Protocolo de disección automatizado para el enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral

Resumen

La anotación digital con disección automatizada de tejidos proporciona un enfoque innovador para enriquecer el tumor en casos de bajo contenido tumoral y es adaptable tanto a la parafina como a los tipos de tejido congelado. El flujo de trabajo descrito mejora la precisión, la reproducibilidad y el rendimiento y podría aplicarse tanto a la investigación como a los entornos clínicos.

Resumen

El enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20% de contenido tumoral dependiendo del método, es necesario para generar datos de calidad de manera reproducible con muchos ensayos posteriores, como la secuenciación de próxima generación. La disección automatizada de tejidos es una nueva metodología que automatiza y mejora el enriquecimiento tumoral en estos tejidos comunes y de bajo contenido tumoral al disminuir la imprecisión dependiente del usuario de la macrodisección tradicional y las limitaciones de tiempo, costo y experiencia de la microdisección de captura láser mediante el uso de superposición de anotación de imagen digital en diapositivas no teñidas. Aquí, las anotaciones digitales de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizan para dirigirse a áreas tumorales pequeñas utilizando una cuchilla de 250 μm² de diámetro en parafina fija de formalina no teñida incrustada (FFPE) o secciones frescas congeladas de hasta 20 μm de espesor para el enriquecimiento automatizado del tumor antes de la extracción de ácido nucleico y la secuenciación del exoma completo (WES). La disección automatizada puede cosechar regiones anotadas en tejidos de bajo contenido tumoral de secciones únicas o múltiples para la extracción de ácido nucleico. También permite la captura de extensas métricas de recolección antes y después de la cosecha, al tiempo que mejora la precisión, la reproducibilidad y aumenta el rendimiento con la utilización de menos diapositivas. El protocolo descrito permite la anotación digital con disección automatizada en FFPE animal y /o humano o tejidos frescos congelados con bajo contenido tumoral y también podría usarse para cualquier región de enriquecimiento de interés para aumentar la adecuación de las aplicaciones de secuenciación posterior en flujos de trabajo clínicos o de investigación.

Introducción

La secuenciación de próxima generación (NGS) se utiliza cada vez más tanto para la atención del paciente como en la investigación del cáncer para ayudar a guiar los tratamientos y facilitar el descubrimiento científico. El tejido a menudo es limitado y se usan muestras pequeñas con contenido tumoral variable de forma rutinaria. La adecuación y la integridad del tumor, por lo tanto, siguen siendo una barrera para obtener datos significativos. Las muestras con porcentajes tumorales más bajos pueden causar dificultad para distinguir las variantes verdaderas de los artefactos de secuenciación y, a menudo, no son elegibles para NGS¹. Se ha demostrad....

Protocolo

Antes del inicio, obtenga muestras de tejido apropiadas de acuerdo con los protocolos de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Genentech, Inc.

1. Preparación de tejidos y diapositivas

1. Seleccione FFPE o bloques de tejido fresco congelado y utilice el método de procesamiento correspondiente a continuación.
2. Corte secciones de bloques de tejido en portaobjetos de vidrio cargados positivamente en el grosor deseado. Secciona en serie el tejido FFPE en cintas con la primera sección de referencia cortada a ....

Resultados

Se seleccionaron las secciones hepáticas de ratón FFPE y FF que contenían cáncer colorrectal metastásico en xenoinjertos. Las secciones fueron teñidas de H&E (Figura 1A, E, I) y escaneadas en un generador de imágenes de diapositivas completa con un aumento de 20x. Un patólogo anotó digitalmente las regiones tumorales de interés y se generó una máscara utilizando software comercial y se formateó como una imagen de referencia png digital (Figura 1B

Discusión

Aquí se presenta un protocolo para la aplicación de anotación digital y disección automatizada para diseccionar regiones tumorales de FFPE de bajo contenido tumoral o tejidos frescos congelados para el enriquecimiento tumoral y su uso en WES. La combinación de anotación digital y creación de máscaras con disección automatizada reduce significativamente el tiempo práctico y la experiencia requeridos comunes a los métodos clásicos de enriquecimiento tumoral, incluida la macrodisección manual y la LCM. El protocolo demuestr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agilent SureSelectXT	Agilent	G9611A
AVENIO Estación de llenado Millisect	Roche	8106533001
AVENIO Millisect Instrument, Base	Roche	8106568001
AVENIO Millisect Instrument, Cabezal	Roche	8106550001
AVENIO Puntas de fresado Millisect Pequeño	Roche	8106509001
AVENIO Millisect PC	Roche	8106495001
BioAnalyzer	Agilent	G2939BA
Eppendorf 5427R	Eppendorf	22620700	Microcentrífuga
Tampón de incubación	Promega	D920D
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010	Tinción automatizada
Aceite mineral de grado molecular	Sigma	M5904-500ML
Proteinasa K	Promega	V302B	Tampón de digestión
Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80284
Tampón RLT Plus	Qiagen	80204
Superfrost Plus portaobjetos de microscopio con carga positiva	Thermo Scientific	6776214