Summary
Wir haben eine automatisierte Computer-Vision-Software entwickelt, um exozytäre Ereignisse zu erkennen, die durch pH-sensitive Fluoreszenzsonden gekennzeichnet sind. Hier demonstrieren wir die Verwendung einer grafischen Benutzeroberfläche und RStudio, um Fusionsereignisse zu erkennen, räumlich-zeitliche Parameter der Fusion zu analysieren und anzuzeigen und Ereignisse in verschiedene Fusionsmodi zu klassifizieren.
Abstract
Die Zeitraffer-TIRF-Mikroskopie von pH-sensitivem GFP (pHluorin), das an Vesikel-SNARE-Proteine gebunden ist, ist eine effektive Methode, um exozytäre Ereignisse einzelner Vesikel in Zellkulturen sichtbar zu machen. Um eine unvoreingenommene, effiziente Identifizierung und Analyse solcher Ereignisse durchzuführen, wurde ein Computer-Vision-basierter Ansatz entwickelt und in MATLAB implementiert. Die Analysepipeline besteht aus einem Zellsegmentierungs- und exozyttischen Ereignisidentifikationsalgorithmus. Der Computer-Vision-Ansatz umfasst Werkzeuge zur Untersuchung mehrerer Parameter einzelner Ereignisse, einschließlich der Halbwertszeit des Fluoreszenzzerfalls und des Peak-ΔF / F sowie der Ganzzellanalyse der Häufigkeit der Exozytose. Diese und andere Parameter der Fusion werden in einem Klassifikationsansatz verwendet, um verschiedene Fusionsmodi zu unterscheiden. Hier führt eine neu erstellte GUI die Analysepipeline von Anfang bis Ende durch. Eine weitere Anpassung von Ripleys K-Funktion in R Studio wird verwendet, um zwischen geclusterten, dispergierten oder zufälligen Auftreten von Fusionsereignissen in Raum und Zeit zu unterscheiden.
Introduction
VAMP-pHluorin-Konstrukte oder Transferrinrezeptor (TfR)-pHuji-Konstrukte sind ausgezeichnete Marker für exozytäre Ereignisse, da diese pH-sensitiven Fluorophore im sauren Vesikellumen abgeschreckt werden und unmittelbar nach der Fusionsporenöffnung zwischen Vesikel und Plasmamembran fluoreszieren1. Nach der Öffnung der Fusionsporen zerfällt die Fluoreszenz exponentiell, mit einer gewissen Heterogenität, die Informationen über das Fusionsereignis preisgibt. Hier wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) beschrieben, die exozytäre Ereignisse automatisch erkennt und analysiert. Diese Anwendung ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse, die durch pH-empfindliche Marker2 aufgedeckt werden, automatisch zu erkennen und aus jedem Ereignis Merkmale zu generieren, die für Klassifizierungszwecke verwendet werden können3 (Abbildung 1A). Zusätzlich wird die Analyse des exozyttischen Ereignisclusterings mit Ripleys K-Funktion beschrieben.
Die automatisierte Klassifizierung exozytischer Ereignisse in verschiedene exozytäre Modi wurde kürzlich berichtet3. Zwei Modi der Exozytose, die Vollvesikelfusion (FVF) und die Kiss-and-Run-Fusion (KNR) Exozytose, wurden zuvor beschrieben4,5,6,7. Während der FVF erweitert sich die Fusionspore und das Vesikel wird in die Plasmamembran eingebaut. Während des KNR öffnet sich die Fusionspore vorübergehend und verschließt dann4, 5,8,9,10. Vier Modi der Exozytose wurden in sich entwickelnden Neuronen identifiziert, zwei verwandt mit FVF und zwei mit KNR. Diese Arbeit zeigt, dass sowohl FVF als auch KNR weiter unterteilt werden können in Fusionsereignisse, die unmittelbar zum Fluoreszenzzerfall (FVFi und KNRi) nach Fusionsporenöffnung übergehen, oder exozytäre Ereignisse, die eine Verzögerung nach der Fusionsporenöffnung aufweisen, bevor der Fluoreszenzzerfall beginnt (FVFd und KNRd) (Abbildung 1B). Der Klassifikator identifiziert den Modus der Exozytose für jedes Fusionsereignis. Hier wurde diese Analyse in eine GUI integriert, die in MATLAB in Windows- und Mac-basierten Betriebssystemen installiert werden kann. Alle Analysedateien finden Sie unter https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing oder
https://github.com/GuptonLab.
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Protocol
1. Wählen Sie Datensätze und Verzeichnis
- Um Datensätze für die Analyse auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Datensätze suchen (Abbildung 2A, rotes Feld 1), um zu dem Ordner zu navigieren, in dem Daten abgelegt werden (z. B. RawData-Ordner). Datendateien füllen die Datendateien automatisch als Liste auf. Der Ordner kann sich über mehr als ein Dataset befinden.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Verzeichnis auswählen und wählen Sie das Verzeichnis (z. B. Test) aus, in dem die analysierten Dateien abgelegt werden sollen (Abbildung 2A, rotes Feld 2). Eine Reihe von Ordnern und fertigen Analysedateien sowie temporäre Zwischenbilder werden in diesem Verzeichnis erstellt, wenn die Schaltfläche Analyse gedrückt wird. Wenn kein Verzeichnis ausgewählt wird, werden Fehler erzeugt.
2. Pixelgröße und Framerate einstellen
- Geben Sie die entsprechende Bildrate und Pixelgröße der Bilder in das entsprechende Feld "Framerate" oder "Pixelgröße" ein (Abbildung 2A, grünes Feld). Wenn keine Werte angegeben werden (sie sind auf die Standardeinstellung "0" gesetzt), durchsucht das Programm die mit der Datei verknüpften Metadaten nach Framerate und Pixelgröße. Wenn diese Werte nicht gefunden werden können, verwendet das Programm standardmäßig pro Pixel für die Messung und pro Bild für Zeitpunkte.
HINWEIS: Im angegebenen Beispiel beträgt die Framerate 100 und die Pixelgröße 0,08.
3. Masken auswählen oder erstellen
- Verwenden Sie die Schaltfläche Masken-Maker, um automatisch Zellenmasken für die Daten in der Datei-Dataset-Liste zu erstellen (Abbildung 2A, blaues Feld). Wenn Sie die Schaltfläche Mask Maker verwenden, wird ein neuer Ordner im ausgewählten Verzeichnis mit dem Namen MaskFiles erstellt. Die "Run-Anzeige" wird während des Laufens gelb und kehrt nach Abschluss zu Grün zurück.
HINWEIS: Eine Maske für jede Datei in der Liste Datendateien wird aus den ersten 10 Frames der Bilddatei (oder aus allen Frames, wenn sich weniger als 10 in der Bilddatei befinden) erstellt und im Ordner MaskFiles mit dem richtigen Benennungsschema (siehe unten) abgelegt. - Stellen Sie sicher, dass die Maskendateien automatisch die Liste Maskendateien füllen. Der Benutzer kann direkt mit der Analyse fortfahren.
HINWEIS: Überprüfen Sie Maskendateien immer visuell und bestätigen Sie, dass sie den gesamten interessierenden Bereich erfassen. Der erste Frame der Datendatei und die Maskendatei werden auf der Benutzeroberfläche angezeigt, wenn diese Option ausgewählt ist. (Abbildung 2B). Der Mask Maker kann bei geringem Signal-zu-Rauschen Fehler verursachen, daher ist die Validierung der Eignung von Maskendateien für die Qualitätskontrolle von entscheidender Bedeutung. - Als Alternative zur Verwendung von Mask Maker, wenn das Signal zum Rauschen von Bildern nicht ausreicht, erstellen Sie Masken manuell in ImageJ.
- Öffnen Sie zunächst die RAW-Bilddatei in ImageJ (Abbildung 3A).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygonauswahl, und klicken Sie auf , um eine Maske um die Zelle zu zeichnen. Wenn Sie fertig sind, doppelklicken Sie auf den letzten Punkt, um das Polygon zu vervollständigen.
- Wenn Sie fertig sind, navigieren Sie zu bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen (Abbildung 3B). Basierend auf der Polygonzeichnung wird eine neue invertierte Maske erstellt. Speichern Sie Masken in einem bestimmten MaskFiles-Ordner im ausgewählten Verzeichnis. Das Benennungsschema der Maskendatei muss mit den entsprechenden einzelnen Datendateien übereinstimmen, gefolgt von "_mask_file". Wenn eine Datendatei beispielsweise den Namen "VAMP2_488_WT_1.tif" hat, muss die entsprechende Maskendatei den Namen "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" tragen.
- Verwenden Sie die Schaltfläche Maskendateien suchen, um zum ausgewählten Ordner mit hinterlegten benutzerdefinierten Maskendateien zu navigieren. Die Masken füllen die Maskendateien als Liste.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass Sie für jede Datendatei eine Maske haben, bevor Sie die Analyse ausführen.
4. Analyse und Merkmalsextraktion
- Nachdem das Verzeichnis ausgewählt und die Listen Datendateien und Maskendateien aufgefüllt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse (Abbildung 4A). Wenn die Klassifizierung exozytischer Ereignisse erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 5 fort.
HINWEIS: Mit dem Klick auf die Schaltfläche Analyse wird eine Reihe automatisierter Aufgaben ausgeführt, um die Daten zu analysieren. Es werden einzelne Ordner im ausgewählten Verzeichnis erstellt, um die analysierten Daten zu hinterlegen. Während des Betriebs wechselt die "Laufanzeige" von grün nach gelb (Abbildung 4A, rotes Feld). Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, ändert sich diese wieder auf Grün. - Suchen Sie einen DataFiles-Ordner (Abbildung 4B) mit dem vollständigen Satz von Analysedateien (sowie Feature-Extraktionsdateien, die später in der Klassifizierung verwendet werden sollen), die nach jeder Datendatei benannt sind (Abbildung 4C).
HINWEIS: Eine Beschreibung dieser Analysedateien finden Sie unten im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
5. Klassifizierung exozytischer Ereignisse
- Um die gleichzeitige Klassifizierung exozytischer Ereignisse mit automatischer Erkennung durchzuführen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Klassifizierung, bevor Sie auf die Schaltfläche Analyse klicken. Weisen Sie für jedes exozytäre Ereignis für jede Klasse einen Wahrscheinlichkeitswert zwischen 0-1 zu. Ein exozytäres Ereignis gilt als eine der vier Klassen, wenn die Wahrscheinlichkeitsbewertung für diese Klasse > 0,5 beträgt.
HINWEIS: Sobald die Analyse abgeschlossen ist, wird ein neuer Datendateiordner im ausgewählten Verzeichnis angezeigt. Der Ordner enthält Analysedateien, die jeder Bilddatei entsprechen.
6. Raumzeitliche Analyse der Exozytose mit Ripleys K-Werten
7. RStudio einrichten
- Öffnen Sie Rstudio und öffnen Sie ripleys_k_analysis. R-Datei.
- Installieren Sie das Paket "spatstat" in RStudio, indem Sie zu Tools | Installieren Sie Pakete und geben Sie "spatstat" ein, gefolgt von einem Klick auf Installieren.
HINWEIS: Dies muss nur einmal pro Rstudio-Installation durchgeführt werden. - Führen Sie die Bibliothek spatstat zu Beginn jeder Sitzung aus.
- Achten Sie in diesem Fall auf zwei Hauptvariablen: "neuron_mask" und "neuron_datapoints". Neuron Mask verweist auf den Satz von Maskendateien, die ausgeführt werden sollen, d. H. Soma-Maskendateien."
HINWEIS: Führen Sie alle Soma-Maskendateien zusammen aus, getrennt von Neurite-Maskendateien und umgekehrt. - Lesen Sie in der .csv der Maskendateien für jedes der zu analysierenden Neuronen.
- Führen Sie mehrere Dateien gleichzeitig aus, indem Sie zusätzliche neuron_mask_n+1 kopieren. Auf diese Weise kann Ripleys Analyse mithilfe des in Abschnitt 8 beschriebenen Skripts aggregiert werden.
- Überprüfen Sie nun die zweite Variable, "neuron_datapoints".
- Lesen Sie in der." X_fluorescent_traces.csv" Datei, die vom Analyseprogramm generiert wird (von enthält alle extracted_R Datei) mit den x,y,t-Positionen der exozyten Ereignisse sowie die neuritenspezifische Datei der x,y-Positionen für das 2D-Netzwerk. Dies geht in die Position "neuron_datapoints".
- Wählen Sie in RStudio Code | aus | ausführen Führen Sie alle aus. Dadurch werden mehrere Diagramme generiert, darunter die gruppierten Ripley-K-Werte sowie Dichtediagramme.
- Speichern Von Plots unter Exportieren von | Bild speichern unter | Wählen Sie das entsprechende Bildformat und Verzeichnis aus, geben Sie den entsprechenden Dateinamen ein, und klicken Sie dann auf Speichern.
HINWEIS: Die Plotfunktion für die Heatmaps wird im Skript mit "plot(density(soma_data,0.4))" aufgerufen. Die Zahl "0,4" steht hier für die Glättung der Dichtefunktion. Es kann geändert werden, um Benutzerdaten auf sinnvolle Weise anzupassen, aber wenn Vergleiche zwischen verschiedenen Heatmaps durchgeführt werden sollen, muss die Anzahl zwischen ihnen gleich sein. - Exportieren oder Speichern von Bildern aus Rstudio. Wenn eine Heatmap weiter bearbeitet werden muss, wählen Sie einen geeigneten Dateityp (SVG oder EPS).
8. Ripleys Analyse
HINWEIS: Die Ripleys_k_analysis. R-Datei generierte auch automatisch Ripleys k-Wert-Plots. Durch das Ausführen des gesamten Skripts werden automatisch die unten genannten Funktionen ausgeführt, aber es ist im Detail enthalten, wenn man jeden Teil des Skripts einzeln ausführen oder Änderungen an der Analyse vornehmen möchte.
- Führen Sie zunächst die Hüllkurvenfunktion für jede Zelle aus. Diese Funktion simulierte die vollständige räumliche Zufälligkeit (CSR), um den Ripley-K-Wert des exozyten Ereignispunktmusters zu testen.
Data_envelope_1 = Umschlag(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = Umschlag(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - Als Nächstes bündeln Sie diese Umschläge und erstellen eine Schätzung der CSR für die Gruppe:
Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Führen Sie als Nächstes die Ripley's K-Funktion für alle Datenpunkte aus.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, Verhältnis = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Turm(soma_data_2, Verhältnis = TRUE) - Wenn Sie fertig sind, bündeln Sie die Ripley's K-Werte und bootstrappen Sie ihre Konfidenzintervalle mit dem folgenden Befehl:
Datenpool = Pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Bootstrappen mit dem folgenden Befehl:
Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool) - Zeichnen Sie die Daten auf.
- Wenn ein hartstatischer Unterschied erforderlich ist, ist der Studentisierte Permutationstest im spatstat-Paket enthalten, um auf einen Unterschied zwischen Gruppen von Punktmustern zu testen:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ Gruppe, nperm = np).
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Representative Results
Hier wurde die GUI (Abbildung 2A) verwendet, um exozytäre Ereignisse von drei VAMP2-pHluorin exprimierenden Neuronen bei 3 DIV mittels TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) zu analysieren. E15.5 kortikale Neuronen wurden isoliert, gefolgt von einer Transfektion mit VAMP2-pHluorin und einer Beschichtung unter Verwendung der Protokolle, wie in Winkle et al., 2016 und Viesselmann et al., 201111,12beschrieben. Die Methodik der bildgebenden Parameter ist wie in Urbina et al., 20182beschrieben. Kurz gesagt, TIRF-Mikroskopie wurde verwendet, um die basale Plasmamembran von Neuronen alle 100 ms für 2 min. Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 zeigen eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse exozytischer Ereignisse. Der Ordner, in dem sich die Neuronenbilder befinden, wird ausgewählt, und ein Verzeichnis zum Ablegen der endgültigen Analysedatendateien wird ausgewählt (Abbildung 2A). Über die MaskMaker-Funktion wird für die Neuronen eine Maske generiert, die in der GUI inspiziert wird (Abbildung 2B). In diesem Fall ist die Zellmaske von guter Qualität, und die Analyse kann fortgesetzt werden. Sollte eine Maske nicht ausreichen, kann in ImageJ eine Maske angelegt werden (Abbildung 3). Nach Verwendung der MaskMaker-Funktion oder Erstellen einer Maske in ImageJ und Auswahl des Verzeichnisses, in dem sich die Maskendateien befinden, wird die Analyse durchgeführt (Abbildung 4A). Die Ergebnisse werden im Ordner DataFiles generiert, wenn die Analyse abgeschlossen ist (das gelbe Kennzeichen wechselt wieder in grün) (Abbildung 4B).
Datendateien werden automatisch generiert und entsprechend den bereitgestellten Rohdatendateien benannt.
Angenommen, die Datendatei hat den Namen X:
X_tracking: Diese Datei enthält x,y-Position und Frame-Nummer jedes Ereignisses sowie Begrenzungsrahmen, die zum Zeichnen von Feldern um jedes Ereignis herum verwendet werden können. Alter gibt die Anzahl der Frames an, die nach der ersten Erkennung liegen, wobei ein Ereignis ein eindeutiges Gauß-Puncta ist. Wenn die Klassifizierung überprüft wird, werden die Klassifizierungsergebnisse in dieser Datei angezeigt, die die Wahrscheinlichkeit eines exozyttischen Ereignisses angibt, das zu einer von vier Klassen gehört. Wenn die Wahrscheinlichkeit größer als 0,5 und größer als andere Wahrscheinlichkeiten ist, wurde eine exozytäre Klasse gewählt.
X_fluorescent Spuren: Diese Datei enthält die x,y-Position und die Framenummer jedes Ereignisses. Darüber hinaus enthält es fluoreszierende Intensitätsmessungen in einem Bereich von Interesse um jedes Ereignis 2 Sekunden vor und 10 Sekunden nach dem Peak ΔF / F für jedes Ereignis (gekennzeichnet durch die Timepoint-Spalten).
X_cell_statistics: Diese Datei enthält die Zellfläche, die Gesamtbildzeit und die automatisch berechnete Häufigkeit exozytischer Ereignisse für jede Zelle (in Ereignissen/mm2/Minute).
Zu den Feature-Extraktionsdateien gehören:
X_contrast: Kontrast. Ein Maß für den Intensitätskontrast zwischen einem Pixel und seinem Nachbarn über das gesamte Bild.
X_correlation: Korrelation. Ein Maß dafür, wie korreliert ein Pixel mit seinem Nachbarn über das gesamte Bild ist.
X_energy Gesamtenergie. Definiert als die quadratische Summe der Pixelintensität.
X_homogeneity misst die Nähe der Verteilung der Elemente im ROI zur ROI-Diagonale.
X_ring_fluorescence: die durchschnittliche Fluoreszenz von Randpixeln.
X_SD: Standardabweichung. Dies ist definiert als die Standardabweichung des ROI.
Beispiele für durchschnittliche Fluoreszenzspuren ± REM aus jeder exozyten Klasse wurden aus X_fluorescent Spurendatei gezeichnet (Abbildung 5A). Mit hilfe der Cell_statistics-Datei wurde die Häufigkeit der Exozytose für jede Klasse für jedes Neuron aufgezeichnet (Abbildung 5B). Wenn das Kontrollkästchen Klassifizierung aktiviert ist, weist das Programm jedes exozytische Ereignis einer Klasse zu, die in Abbildung 5C dargestelltist. Nach der Klassifizierung wurde der Ripley's K-Analysecode verwendet, um festzustellen, ob exozytäre Ereignisse zufällig, gruppiert oder in Raum und Zeit verteilt sind. Es wurden Dichte-Heatmaps der Lokalisierung exozytischer Ereignisse (Abbildung 5D) generiert. Diese zeigen erwartete geclusterte "Hotspots" in verschiedenen Regionen des Neurons. Als nächstes wurde Ripleys K-Analyse für soma, Neurit und Clustering im Laufe der Zeit durchgeführt (Abbildung 5E). Der K-Wert des Ripley und das SEM (schwarze Linie bzw. blau schattierte Region) erheben sich über die Linie der vollständigen räumlichen Zufälligkeit (rote gepunktete Linie), was auf eine statistisch signifikante Clusterung hindeutet.
Abbildung 1: Darstellung der exozyttischen Analyse und Klassifizierung. (A) Gliederung der Analysepipeline für die GUI. Zellen werden aus dem Hintergrund segmentiert, bevor exozytäre Ereignisse identifiziert und verfolgt werden. Parameter wie der Peak ΔF/F und t1/2 werden aus fluoreszierenden Spuren der Exozytose in einem ROI um das Ereignis vor und nach der Fusion berechnet. (B) Illustration der vier Modi der Exozytose und Beispielbildmontagen. Nach der Fusion können Ereignisse augenblicklich zu FVF oder KNR (FVFi und KNRi) übergehen, oder es kann eine Verzögerung vor dem Beginn des Fusionsschicksals zu FVF oder KNR (FVFd und KNRd) vorliegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schritt für Schritt Beispielanalyse. (A) Zunächst werden Datensätze ausgewählt (1., rotes Feld), und ein Verzeichnis zum Platzieren von Analysedateien (2., rotes Feld). Als nächstes werden die Framerate und pixelgroß angegeben (3., grünes Feld). Hier kamen 0,08 μm Pixelgröße und 100 ms Framerate zum Einsatz. Anschließend wird die MaskMaker-Funktionstaste gedrückt (4., blaue Box). Im ausgewählten Verzeichnis wird automatisch ein Ordner mit dem Titel "MaskFiles" erstellt, der eine Maskendatei für jede Bilddatei im Datensatz enthält. (B) Wenn Datensätze geladen werden, wird bei Auswahl einer Datendatei und/oder Maskendatei der erste Frame der Bilder angezeigt, um den Vergleich zu erleichtern (grünes Feld). Maskendateien sind möglicherweise nicht vollständig korrekt. Diese Maskendatei kann auf Fehler korrigiert werden, oder eine neue Maskendatei kann manuell erstellt werden Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Manuelles Erstellen einer Maskendatei in ImageJ. (A) Öffnen Sie zunächst die Datei zum Erstellen einer Maske. Die Schaltfläche "Polygonauswahl" ist rot umrandet. Durch Klicken um den Rand der Zelle wird ein Polygonumriss erstellt. (B) So erstellen Sie eine Maske aus dem Polygonumriss. Durch Auswahl von bearbeiten | Auswahl | Create Maskwird aus dem Polygon (rechtes Bild) eine Schwarz-Weiß-Maske erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Analyse exozytischer Ereignisse. (A) Demonstration der Analyseschaltfläche (orangefarbenes Kästchen) und eine laufende Analyse. Beachten Sie, dass die Laufanzeige gelb wird, während eine Analyse durchgeführt wird. (B) Beispielanalysedateien, die nach Abschluss der Analyse im ausgewählten Verzeichnis erstellt werden. DataFiles enthalten alle Analysedateien des exozyttischen Ereignisses. (C) Analysedateien, die im Ordner "DataFiles" generiert werden. Farbfelder stellen die geöffneten Dateien in nachfolgenden Bildern dar. (D) Drei geöffnete Dateien, "X_fluorescent_traces.csv" (rot) und "X_Cell_statistics" (grün) und "X_tracking" (blau). Fluoreszierende Spuren enthalten die x,y-Position und die Frame-Nummer jedes Ereignisses sowie die fluoreszierende Intensität bei jedem ROI. Cell_statistics enthält zusammenfassende Informationen über exozytäre Statistiken ganzer Zellen wie die Häufigkeit der Exozytose. X_tracking enthält Positions- und Zeitinformationen für jedes exozytäre Ereignis sowie die Wahrscheinlichkeit jeder Klasse von Exozytose für jedes Ereignis, dargestellt als Zahl zwischen 0-1 (>0,5 bedeutet, dass ein Ereignis zu einer bestimmten Klasse gehört). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse. (A) Durchschnittliche Fluoreszenzspuren +/- REM aus jeder exozyten Klasse. (B) Häufigkeit der Ereignisse, die für drei murine kortikale Neuronen für jede exozytäre Klasse dargestellt wurden. Diese Datenwerte wurden aus "X_Cell_statistics" unter Verwendung der in "X_tracking" zugewiesenen Klassen gezeichnet. (C) Verteilung der Klassen der Exozytose für die gleichen drei Zellen, die in A verwendet werden). Hier wird das Verhältnis der einzelnen Modi aufgezeichnet. (D) Dichtediagramm, wo exozytäre Ereignisse auftreten, wie im Ripley's K Analysis Teil des Protokolls generiert. Dies kann als "Heatmap" der räumlichen Wahrscheinlichkeit interpretiert werden, wo Ereignisse auftreten. (E) Ripleys K-Analyse von drei Zellen, die für A) und B) verwendet wurden. Die rote Linie zeigt an, welchen Wert eine völlig räumlich zufällige Verteilung exozytärer Ereignisse hätte. Die schwarze Linie gibt den K-Wert des Ripley-Aggregats für die drei Zellen in diesem Beispiel an, und der blau schattierte Bereich stellt das Konfidenzintervall dar. Hier liegt der schattierte Bereich deutlich außerhalb der Linie der vollständigen räumlichen Zufälligkeit zwischen ~ 0,25-1 μm, was darauf hindeutet, dass exozytäre Ereignisse in diesen Entfernungen gruppiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Bitte beachten Sie bei der Verwendung der exozytischen Erkennungs- und Analysesoftware, dass das Programm nur verlustfreie Komprimierung .tif Dateien als Eingabe akzeptiert. Die .tif Bilddateien können 8-Bit-, 16-Bit- oder 32-Bit-Graustufenbilder (Einzelkanal) sein. Andere Bildformate müssen vor der Eingabe in einen dieser Typen konvertiert werden. Als Referenz werden hier Beispiele als 16-Bit-Graustufenbilder verwendet.
Im Rahmen des automatisierten Erkennungsprozesses werden die Zeitraffer-Bildsätze für die automatisierte Hintergrundsubtraktion und Photobleaching-Korrektur verarbeitet. Bei der Hintergrundsubtraktion werden die Pixel außerhalb des maskierten Bereichs der Maskendatei über den Zeitraffer des gesamten Bildes gemittelt, und der Durchschnittswert wird vom Bildsatz subtrahiert. Für die Photobleaching-Korrektur wird eine mono-exponentielle Zerfallsanpassung auf die durchschnittliche Fluoreszenz von Pixeln in der Maske im Laufe des Videos angewendet, wobei die korrigierte Intensität wie folgt angepasst wird:
Korrigierte Intensität = (Intensität zum Zeitpunkt t) ÷ exp-k×t wobei k = Zerfallskonstante
Daher ist vor der Eingabe keine Vorverarbeitung notwendig. Diese Prozesse sind jedoch entscheidend auf die Bildmaske angewiesen, um die Zelle effektiv vom Hintergrund zu trennen, und daher ist eine geeignete Zellmaske für gute Ergebnisse notwendig.
Der automatisierte Zellmaskenersteller benötigt ein einheitliches Signal mit einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis (idealerweise mindestens das 2-fache der Standardabweichung des durchschnittlichen Hintergrundsignals), um eine gute Leistung zu erbringen. Empirisch funktioniert die CAAX-Box, die mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, das bei der Prenylierung in die Plasmamembran einführt, gut. Es ist nicht erforderlich, dass das Signal während der gesamten Zeitrafferbildgebung der Exozytose aufrechterhalten werden kann, da aus einem hohen Signal in den ersten 10 Frames der Sequenz eine geeignete Maske erstellt werden kann. Wenn sich die Zellmorphologie jedoch während des Bildgebungsparadigmas signifikant ändert, ist Vorsicht geboten.
Wenn Sie die automatisierte Erkennungssoftware verwenden, geben Sie die Framerate und Pixelgröße an, um genaue zeitliche und räumliche Ausgaben zu erzielen. Wenn keine Framerate oder Pixelgröße deklariert ist, erfolgt die Ausgabe pro Pixel und pro Frame. Als Faustregel gilt, dass Vesikeldurchmesser in sich entwickelnden Neuronen auf der Skala von ~ 100 nm13 liegen,und daher kann die automatisierte Erkennung von Ereignissen für Vesikel ähnlicher Größe funktionieren. So wie es aussieht, gibt es keine feste Grenze für die Größe der Vesikel, die (nach Pixelfläche) detektiert werden können, da die automatisierte Erkennung auf der Gauß-förmigen Intensität über einen großen Bereich von Gaußschen Breiten beruht. Die Fusion von Vesikeln, die kleiner als die Breite eines Pixels sind, kann genau erkannt werden, wenn die Intensität des Ereignisses die Signal-Rausch-Kriterien von 2x der Standardabweichung des durchschnittlichen Hintergrundsignals erfüllt, da sich die Fluoreszenzbeugung über mehrere Pixel ausdehnt.
Dieses Programm wurde entwickelt, um exozytäre Ereignisse in sich entwickelnden Neuronen zu erkennen. Die Software wurde jedoch genutzt, um exozytäre Ereignisse in anderen Zelllinien2erfolgreich zu erkennen, was darauf hindeutet, dass der Erkennungsalgorithmus robust ist. Obwohl wir die Software zum Nachweis exozytärer Ereignisse in nicht-neuronalen Zelltypen verwendet haben, deuten Unterschiede im exozytären Ereignismodus zwischen Zelltypen14 darauf hin, dass der Klassifikationsalgorithmus möglicherweise nicht für andere Zelltypen geeignet ist. Exozytäre Ereignisse in sich entwickelnden Neuronen wurden ursprünglich mit drei verschiedenen Methoden klassifiziert: Hierarchisches Clustering, Dynamisches Time Warping und Hauptkomponentenanalyse (PCA), wobei vier verschiedene Klassen3aufgedeckt wurden. Hier werden alle drei Klassifikatoren in der GUI verwendet, um exozytäre Ereignisse in eine dieser etablierten vier Klassen zu kategorisieren. Für jedes exozytäre Ereignis wird für jede der vier möglichen Klassen ein Wahrscheinlichkeitswert zwischen 0-1 zugewiesen. Jede Klasse mit einer Wahrscheinlichkeitsbewertung > 0,5 wird als Klasse dieser Klasse betrachtet. Diese Klassifikation wurde bisher nur bei der Entwicklung von Neuronen verwendet. Ob diese Klassen in anderen Zelltypen oder zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Neuronen existieren, ist nicht bekannt. Eine große Anzahl von Ereignissen mit Wahrscheinlichkeitswerten von <0,5 für eine der Klassen würde darauf hindeuten, dass das Klassifizierungsverfahren möglicherweise nicht für die exozyttischen Ereignisse geeignet ist, die derzeit ausgewertet werden. Wenn exozytäre Ereignisse verschiedener Zelltypen mit niedrigen Wahrscheinlichkeitswerten zugeordnet werden, würde dies darauf hindeuten, dass eine De-novo-Klassifizierung erforderlich ist, da neue oder alternative Modi der Exozytose existieren können. Die gleichen Klassifizierungsmethoden, die hier verwendet werden, müssten auf die automatisch erkannten exozyten Ereignisse angewendet werden.
Um die räumliche und zeitliche Clusterung exozytischer Ereignisse zu untersuchen, wird Ripleys K-Analyse15 genutzt. Die Analyse von Clustering für Neuronen umfasst drei separate Analysen: Eine für das Soma, eine für die Neuriten und eine für die Zeit. Der Grund für die Spaltung von Soma und Neuriten ist die extreme Morphologie von Neuriten, die oft dünn genug sind, dass sie als 2D-Netzwerk behandelt werden können und eine 2D-Variante von Ripleys K-Analyse anwenden können. Für die Zeit wird eine 1D Ripley's K-Analyse für das zeitliche Clustering implementiert. Ripleys K-Analyse ist eine robuste Methode zur Erkennung von Clustering von Punktprozessen und Kolokalisierung. Der Graph von Ripleys K kann als solcher interpretiert werden: Der Ripley-K-Wert + Konfidenzintervall hat eine Chance von 5%, an jedem Punkt außerhalb der Linie der vollständigen räumlichen Zufälligkeit zu liegen, analog zu einem p-Wert von 0,05. Wenn der Wert außerhalb der Linie der vollständigen räumlichen Zufälligkeit liegt, werden exozytäre Ereignisse in diesen Abständen (über CSR) gruppiert (über CSR) oder in regelmäßigen Abständen (unter CSR) getrennt (x-Achse).
Die Erstellung der Maskendatei beruht auf einem hohen anfänglichen Signal-Rauschen der Zelle. pH-empfindliche Marker funktionieren möglicherweise nicht immer gut bei der Beleuchtung einer Zelle, je nachdem, an welches Protein die Sonde gebunden ist. Eine weitere Möglichkeit, Maskendateien zu erstellen, wenn das Signal zum Rauschen des exozyten Markers den Zellrand nicht ausreichend hervorhebt, besteht darin, einen zweiten fluoreszierenden Kanal / Bild für die Maskenerstellung zu verwenden. Wenn Sie einen anderen Fluoreszenzmarker (z. B. tagRFP-CAAX) zum Erstellen von Masken verwenden, navigieren Sie bei der Auswahl eines Datensatzes zuerst zu dem Ordner mit den Bildern, aus dem Masken erstellen sollen (z. B. ein Ordner, der die tagRFP-CAAX-Bilder enthält). Verwenden Sie hier die Schaltfläche Maskenmacher. Denken Sie daran, die Maskendateien so umzubenennen, dass sie der exozytären Datendatei entsprechen, die mit dem obigen Benennungsschema analysiert werden soll (nach dem obigen Beispiel müssen die Maskendateien mit dem Namen "CAAX_1_mask_file.tif" in "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" umbenannt werden, um dem zu analysierenden VAMP2-Bildsatz zu entsprechen). Sobald die Maskendateien entsprechend benannt sind, kehren Sie erneut zur Schaltfläche Datensatz auswählen zurück, um zu den zu analysierenden exozyten Datensatzdateien zu navigieren.
Der Nachweis von Exozytose ist bemerkenswert empfindlich, und exozytäre Ereignisse wurden bei Signal-Rausch-Verhältnissen von nur ΔF / F von 0,01 genau detektiert. Die Empfindlichkeit der Detektion hängt teilweise von der Varianz der Hintergrundfluoreszenz ab, und Ereignisse, die weniger als 4 Standardabweichungen über dem Hintergrundsignal liegen, werden nicht erkannt.
Die Erkennung exozytischer Ereignisse beruht auf ihrer vorübergehenden Natur. Als Merkmal der Analyse vorübergehender Ereignisse untersucht unser Erkennungscode ein 20-Sekunden-Fenster um das exozytäre Ereignis. Bei einigen Zelltypen kann die Kuss-und-Bleiben-Exozytose für ein viel längeres Zeitfenster "bleiben" als bei sich entwickelnden Neuronen, und die automatisierte Erkennung erfasst diese weniger vorübergehenden Ereignisse möglicherweise nicht robust. Diese Funktion ist eine leicht veränderbare Variable für diejenigen, die mit MATLAB vertraut sind. Ähnlich wie bei der Begrenzung des 20-Sekunden-ROI können exozytäre Ereignisse, die vor dem letzten Zeitrahmen des Videos auftreten, aber nicht verschwinden, nicht als echte Exozytose gezählt werden, was die Frequenz beeinflussen kann, die auf der Grundlage der gesamten Länge der Zeitreihe berechnet wird.
Der mitgelieferte Maskenhersteller ist vom Design her automatisiert und funktioniert gut bei der Segmentierung komplexer Formen aus dem Hintergrund. Das vollautomatische Design begrenzt jedoch den Bereich von Signal-zu-Rausch und Signaltyp, mit dem automatisch eine Maske generiert werden kann. Wenn der Benutzer keinen fluoreszierenden Zellmarker einfügen kann, der gleichmäßig und mit einem signifikanten Signal-Rausch-Verhältnis ist, muss die Zellmaske manuell gezeichnet werden.
Die benutzerbasierte Analyse der Exozytose ist ein zeitaufwändiger Prozess und unterliegt persönlichen Vorurteilen, da Ereignisse nicht immer klar von anderen Fluoreszenzen getrennt sind. Der Einsatz eines automatisierten Analyseprogramms zur korrekten Identifizierung und unvoreingenommenen Analyse exozytärer Ereignisse erhöht die Analyseeffizienz und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge.
Diese exozytische Ereigniserkennung funktioniert nicht nur zur genauen Erfassung der pH-sensitiven Fluoreszenz in sich entwickelnden Neuronen, sondern auch bei anderen Zelltypen (Urbina et al., 2018). Ob die Klassifizierung für andere Zelltypen funktioniert, muss noch ungenimmt werden. Zukünftige Anwendungen dieser Technik könnten an Synapsen, in nicht-neuronalen Zelltypen oder mit neuartigen Markern des exozytären Vesikel-Dockings und der Fusion, wie kürzlich beschrieben pHmScarlet16,nützlich sein.
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Disclosures
Die Autoren erklären nichts zu enthüllen.
Acknowledgments
Wir danken Dustin Revell und Reginald Edwards für das Testen von Code und GUI. Die Finanzierung wurde von den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, die diese Forschung unterstützten: einschließlich R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) und F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
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References
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