本文介绍了在神经母细胞瘤的斑马鱼模型中实时开发、表征和追踪肿瘤转移的方法，特别是针对MYCN和LMO1过表达的转基因斑马鱼品系，该品系可自发产生转移。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼已成为研究人类疾病，尤其是癌症的重要动物模型。结合在斑马鱼建模中广泛应用的高效转基因和基因组编辑技术，以及其易于饲养、繁殖力高和强大的活体成像能力，斑马鱼成为研究转移过程及其细胞与分子基础的宝贵模型系统 体内首个斑马鱼神经母细胞瘤（NB）转移模型是通过过表达两个癌基因建立的， MYCN 和 LMO1，由多巴胺-β-羟化酶（dopamine-beta-hydroxylase,dβh）启动子。共过表达 MYCN 和 LMO1 导致神经母细胞瘤发生的潜伏期缩短、外显率增加，以及肿瘤细胞远处转移的加速。该新模型稳定重现了人类转移性神经母细胞瘤的多个关键特征，包括临床相关且与转移相关的遗传学改变，以及转移的自然自发性发生。 体内；以及转移的保守位点。因此，斑马鱼模型在解析肿瘤转移这一复杂过程方面具有独特优势 体内.
引言
斑马鱼已被广泛应用于多个研究领域，尤其是在癌症研究中。该模型具有诸多优势，例如繁殖能力强、维护成本低，以及能够多途径可视化肿瘤生长和转移过程，这些特点使斑马鱼成为研究肿瘤发生和转移的细胞与分子基础的有力工具。近年来，大规模基因组作图、转基因、基因过表达或敲除、细胞移植以及化学筛选等新技术极大地增强了斑马鱼模型的研究能力1。在过去几年中，已开发出多种斑马鱼品系，用于研究包括白血病、黑色素瘤、横纹肌肉瘤和肝细胞癌在内的多种人类癌症的肿瘤发生与转移过程2,3,4,5。此外，首个神经母细胞瘤（NB）的斑马鱼模型是通过在多巴胺-β-羟化酶（dβh）启动子的调控下，在外周交感神经系统（PSNS）中过表达致癌基因MYCN而构建的。利用该模型，进一步证明了活化的ALK可与MYCN协同作用，加速肿瘤的发生并提高肿瘤的外显率in vivo6。
神经母细胞瘤（NB）起源于神经嵴细胞的交感肾上腺谱系，是儿童中一种高度转移性的癌症....
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方案
所有使用斑马鱼的研究方法及动物护理/饲养均遵循梅奥诊所的机构指南。
1. 用于建立在PSNS中过表达LMO1的转基因斑马鱼品系的转基因构建体的制备与显微注射
- 为构建LMO1-pDONR221入门克隆，使用PCR从人细胞系获得的cDNA中扩增人LMO1的编码区。
- 配制25 µL反应体系，具体如下：2.5 µL 10x标准Taq反应缓冲液，0.125 µL Taq DNA聚合酶，0.5 µL 10 mM dNTPs，2 µL cDNA模板，0.5 µL 10 µM LMO1 ATTB1正向引物，0.5 µL 10 µM LMO1 ATTB2反向引物，以及18.875 µL水。
注意：使用LMO1 ATTB1正向引物：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'。
CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3'，以及LMO1 ATTB2反向引物：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
GAACTTGGGATTCAAAGGT-3' - 采用以下程序进行扩增：94 °C预变性2分钟，1个循环；随后进行30个循环（94 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后72 °C延....
- 配制25 µL反应体系，具体如下：2.5 µL 10x标准Taq反应缓冲液，0.125 µL Taq DNA聚合酶，0.5 µL 10 mM dNTPs，2 µL cDNA模板，0.5 µL 10 µM LMO1 ATTB1正向引物，0.5 µL 10 µM LMO1 ATTB2反向引物，以及18.875 µL水。
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结果
为了确定是否 LMO1 协同作用于 MYCN 影响NB发病机制，驱动表达以下任一的转基因构建体 LMO1 (dβh:LMO1 和 dβh:mCherry）或 MYCN (dβh:EGFP-MYCN 在受控条件下的PSNS细胞中 dβh 启动子被注射到斑马鱼胚胎中13如图所示 图1A在获得稳定转基因品系并验证其基因型后，将杂合子 MYCN 和 LMO1 鱼类进行杂交。其后代按以下方式分选： MYCN （EGFP+）或 LMO1 分别在受精后1天或3-4天（mCherry+）表达。 MYCN 过表达已被证明可抑制 PSNS 的发育6因此， EGFP-MYCN 在1 dpf时，非PSNS多巴胺能神经元细.......
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讨论
斑马鱼在过去的几十年中已被广泛用于研究，尤其是在癌症研究领域，这显然得益于其易于饲养、繁殖能力强以及在诸多方面具有的显著优势 体内 成像1,28斑马鱼模型由于其体外受精和体外发育的特性，易于进行胚胎操作，可与大鼠、小鼠等哺乳动物模型生物相辅相成，适用于大规模的遗传学研究1,2,3此外，斑马鱼基因组与人类基因组具有高度相似性。通过将斑马鱼基因组的详细注释与人类参考基因组进行比较，约70%的人类基因已被证实存在对应的斑马鱼直系同源基因。29此外，斑马鱼在研究中的其他应用已拓展至药物发现以及作为个体化癌症治疗的患者替身模型30,31越来越多的研究表明，在斑马鱼中.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01 CA240323（S.Z.）；美国国防部（DoD）资助项目 W81XWH-17-1-0498（S.Z.）；癌症研究V基金会V学者奖（S.Z.）；梅奥生物医学发现中心平台资助（S.Z.）；以及梅奥诊所癌症中心和个体化医学中心的支持（S.Z.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3,3’-二氨基联苯胺（DAB）Vector试剂盒 | Vector | SK-4100 | |
| 乙酸 | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| 琼脂糖GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| 抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体 | Pel-Freez | P40101 | |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R 检测试剂 | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND一抗稀释液 | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC仪器 | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | 全自动免疫组化染色系统 |
| CH211-270H11 BAC克隆 | BACPAC资源中心（BRFC） | N/A | |
| 配备DP71相机的复式显微镜 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL（基于二甲苯的封片介质） | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| 伊红 | Leica | 3801601 | 即用型（无需配制） |
| 乙醇 | Carolina | 86-1263 | |
| Expand长片段PCR系统 | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II酶混合物 | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II酶混合物 | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| 山羊抗兔二抗（生物素标记） | Dako | E0432 | |
| 改良哈里斯苏木精溶液 | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP亲和素D | Vector | A-2004 | |
| 盐酸 | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| 过氧化氢，3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI酶 | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| 硫酸卡那霉素 | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes纸巾 | Fisher Scientific | 34133 | |
| 碳酸锂 | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| 用于切片的切片机 | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10化学感受态 E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | 犹他大学Chi-Bin Chien博士 | N/A | 慷慨馈赠 （请访问网页 http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page 获取材料，该材料按说明免费分发。） |
| 石蜡 | Surgipath Paraplast | 39603002 | 石蜡到石蜡 |
| 多聚甲醛 | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST载体（含I-SceI识别位点的改良目的载体） | 德国卡尔斯鲁厄理工学院C. Grabher博士 | N/A | 慷慨馈赠 |
| pDONR 221 gateway供体载体 | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R供体载体 | 犹他大学Chi-Bin Chien博士 | N/A | 慷慨馈赠 |
| 酚红，0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），10X | BioRad | 1610780 | |
| 苦味酸-天狼星红染色试剂盒 | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| 蛋白酶K，重组，PCR级 | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| RDO快速脱钙剂 | Apex Engineering | RDO04 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| 体视荧光显微镜 | Leica | MZ10F | |
| 配备数字成像相机DS-U1的立体荧光显微镜 | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA聚合酶 | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI真空浸润处理仪 | Sakura | N/A | 型号 #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| 二甲苯 | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
参考文献
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
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重印与许可
