מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הכבד הוא האיבר הגדול ביותר ביונקים. הוא ממלא תפקיד חשוב באחסון גלוקוז, הפרשת חלבונים, חילוף חומרים וניקוי רעלים. כמוציא לפועל של רוב תפקודי הכבד, להפטוציטים ראשוניים יש יכולת התפשטות מוגבלת. זה דורש הקמת מודלים להרחבת האקס ויוו הפטוצית למחקר פיזיולוגי ופתולוגי בכבד. כאן בודדנו את הפטוציטים של מורין בשני שלבים של זלוף קולגנאז וביססנו תרבות אורגנויד תלת-ממדית כ'כבד מיני 'כדי לשחזר אינטראקציות בין תאים ותפקודים פיזיים. האורגנוידים מורכבים מאוכלוסיות תאים הטרוגניות כולל אבות והפטוציטים בוגרים. אנו מציגים את התהליך בפירוט כדי לבודד ולתרבות את הפטוציטים מורין או hepatocyte עוברי כדי ליצור organoids בתוך 2-3 שבועות ולהראות כיצד להעביר אותם על ידי צינורות מכניים למעלה ולמטה. בנוסף, נציג גם כיצד לעכל את האורגנוידים לתאים בודדים לזיהום לנטיוירוס של בנייה של שרנ"א/חוץ רחמי, טרנספקטיון siRNA והנדסת CRISPR-Cas9. האורגנוידים יכולים לשמש למסכי סמים, מידול מחלות ומחקר כבד בסיסי על ידי מידול ביולוגיה של הכבד ופתוביולוגיה.
מבוא
Organoids הם מאורגנים בעצמם, תלת מימדי (3D) באשכולות במבחנה הכוללים תאי גזע מתחדשים עצמית ותאים מובחנים מרובי שושלת1,2. האורגנוידים של איברים רבים הוקמו מתאי גזע פלוריפוטנטיים או בוגרים על ידי גורמי נישה מוגדרים היטב כולל המעי, המוח, המעי הגס, הכליה, הכבד, הלבלב, בלוטת התריס, הקיבה, העור והריאה3,4,5,6,7 . האורגנוידים מסכמים מחדש את תפקודי התא הפיזי על ידי חיקוי התפתחות (שמקורה בתאי גזע עובריים או מושרים, מחשבים אישיים) או התקדמות הומאוסטזיס/התחדשות (שמקורה בתאי גזע בוגרים, ASCs), אשר פותח אפיקים חדשים במחקר מחלות וטיפול8,9.
בתור האיבר הגדול ביותר ביונקים, הכבד אחראי בעיקר לאחסון, חילוף חומרים וניקוי רעלים. שני סוגים של סוגי תאי אפיתל, hepatocytes ו cholangiocytes, לבנות את היחידה הבסיסית של lobule כבד. Hepatocytes אחראים 70-80% של תפקוד הכבד10. למרות הכבד יש יכולת התחדשות יוצאת דופן, אובדן מהיר של תכונות hepatocyte קורה במהלך פולחן monolayer המסורתי על ידי קיטוב תאים dysregulated דיפרנציה, אשר מגביר את הצורך של חוקרים ורופאים לבנות מודלים כבד "גישור פער" בצלחת. עם זאת, עד לאחרונה מודלי הרחבת ex vivo מהפטוציטים ראשוניים לא היו מבוססים היטב11,12,13,14,15. אורגנוידים בכבד ניתן להקים מתאי גזע עובריים/מושרה pluripotent, המרה פיברובלסט לתאים דמויי hepatocyte, ותאים נגזר רקמות. הפיתוח של organoids כבד מגביר את היישום של מודל במבחנה עבור מסכי סמים ורעילות בכבד בדיקות 16,17.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להקמת organoids כבד מן הפטוציטים ראשוניים מורין. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, הקמנו מערכת תרבות הפריה חוץ גופית של אורגנוידים hepatocyte עם שני זלוף של collagenase. אורגנוידים אלה ניתן לעבור להתרחבות ארוכת טווח במשך חודשים. התפקוד הפיזיולוגי שלהם עולה בקנה אחד עם hepatocytes. יתר על כן, אנו מספקים גם תיאור מפורט של כיצד לבצע מניפולציה גנטית, כגון זיהום lentivirus, התמלת siRNA, ו הנדסת CRISPR-Cas9 באמצעות organoids. התפשטות האורגנוידים של הפטוציטים שופכה אור על האפשרות להשתמש באורגנוידים כדי להבין ביולוגיה של הכבד ולפתח גישות לרפואה מותאמת אישית ותרגומית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ניסויי העכברים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטת שאנדונג ובוצעו על פי הרישיון על פי הנחיות ותקנות משרד הפנים (לא. ECSBMSSDU2019-2-079).
הערה: פרוטוקול זה משמש בעיקר לתרבות אורגנוידים תלת-ממדיים מהפטיציטים ראשוניים מבודדים.
1. הקמת תרבות האורגנוידים של מורין הפטוציט
הערה: מטריצה חוץ תאית כגון מטריגל או BME משמשים כמטריצת המרתף לאורגנואידים תרבותיים. יש לאחסן את המטריצה החוץ-תאית ב-20 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותה מראש ב-4 מעלות צלזיוס או על קרח. שמור את המטריצה החוץ-תאית על קרח במהלך הניסויים. מדיום הכביסה הוא מתקדם DMEM / F12 בתוספת גלוטמקס, HEPES ופניצילין / סטרפטומיצין. אינקובטור סטנדרטי (37 °C (37 °C,5% CO2) משמש לתרבות האורגנויד.
- הכנת חומרים
- הכן את המכשירים הנדרשים לניסוי: כרית העכבר, מכשירים כירורגיים סטריליים כמו פינצטה, מספריים, צינורות ומשאבה עם קצב זרימה של 2-10 מ"ל / דקה.
- הכן את ריאגנטים כולל חיץ זלוף, חוצץ העיכול ולהפוך אותם סטריליים לבידוד hepatocyte. יש להוסיף קולגנאז מסוג IV טרי (0.10 מ"ג/מ"ל) ו-CaCl2 (0.50 מ') ולחמם מראש את החיץ במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הכן את המדיום המותנה כדי לייצר R-spondin 1 ואת כל הכימיקלים ואת המניות גורם צמיחה על פי הוראות היצרן.
הערה: הימנע מהקפאה תכופה והפשרה של המדיום המותנה והמניות. מכינים את התרבות בינונית טרייה ומשתמשים בה תוך חודש. זה קריטי ליעילות יצירת האורגנויד.
- בידוד הפטוצ'ית מורין על ידי זלוף בכבד ועיכול
הערה: עכברים זכר או נקבה בין הגילאים 12 שבועות ו 6 חודשים שימשו לתרבות organoid. לא נמצאו הבדלים ברורים ביעילות היווצרות האורגנויד מעידן העכבר התורם בטווח זה.- המתת חסד את העכבר בשיטה מאושרת מבחינה אתית.
- תקן את העכבר על כרית העכבר ונקה את פרוות הבטן והעור עם 70% אלכוהול. לחשוף את הבטן ולהרים את הכבד מעל שאר הגוף. לעשות חבטה בקו האמצע כדי לחשוף את הכבד.
- מלאו את הצינור המחובר למשאבה במאגר זלוף. הפוך חותך של וריד הפורטל (על 1/3 של קוטר הווריד) ולהניח בזהירות קטטר לתוכו. הרם את איברי העיכול כדי לעזור להכניס את הצינורית. עניבה עם הקו הכירורגי היא אופציונלית כדי למנוע החלקה החוצה וקרע.
- התחל את המשאבה ולבצע זלוף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל / דקה עם חיץ זלוף. אם הכבד הופך חיוור מיד, לחתוך את הוועד הנתון הנחות כדי לאפשר חוצץ זלוף לזרום דרך הכבד כולו ולהוציא את הדם.
- כאשר הזרימה החוצה הופכת נקייה, הסר את הצינורית. זה לוקח בערך 5-10 דקות.
- שנה את חיץ זלוף עם חיץ עיכול מחומם מראש בקצב של 5 מ"ל / דקה. אין לעצור את המשאבה עד שהכבד הופך רך ומתנפח. הסר את הצנתר כאשר הכבד מפסיק נפיחות.
הערה: חשוב מאוד לשמור על זמן עיכול תקין כדי למנוע עיכול מוגזם ולקבל תאי כבד בודדים. - חותכים את הכבד ומניחים אותו בצלחת 100 מ"מ מלאה ב 15 מ"ל של שטיפה קרה בינונית. חותכים את הרצועות עם מספריים קטנים. לקרוע את הכבד לחתיכות עם טיפים פיפטה או מלקחיים.
- Pipette למעלה ולמטה בעדינות כדי לשחרר את התאים עד המאגר רווי בתאים (12-15 פעמים). יוצקים את ההשעיה לתא לתוך צינור 50 מ"ל דרך מסנני 70 מיקרומטר.
- צנטריפוגה במשך 1-3 דקות ב 50 x g ו 4 °C (5 °F). דקאנט סופר-טבעי. לחלופין, resuspend התאים עם לשטוף בינוני או resuspend התאים עם מדיום תרבית ישירות. תספור את התאים עם המציטומיטר.
- להבחין בין תאים חיים או מתים על ידי מכונת מונה התא לאחר כתמי צבע תא חי.
הערה: עדיף לטהר hepatocytes באמצעות קר 40% פרקול. לאחר שלב זה, hepatocytes קיימא יהיה בתחתית הצינורות.
- תרבות אורגניואידית ומעבר
- הסר את supernatant ו resuspend את hepatocytes עם תערובת של מטריצה חוץ תאית ומדיום תרבות ביחס של 3:1.
הערה: 10,000-20,000 תאים בתערובת 50-60 μL לבאר עבור צלחת 24-well מומלץ. חשוב לעבוד במהירות ולשמור את התערובת על קרח לאורך כל התהליך. 200-500 organoids יכול להיווצר בריכוז זה. - מוסיפים את טיפת התא/התערובת על הצלחת עם טיפות קטנות כדי למנוע מהטיפה להתחבר יחד. לדגור את הצלחת באינקובטור התא ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 במשך 5-10 דקות ולאחר מכן להוציא את הצלחת במשך 20-25 דקות עד מטריצה חוץ תאית הופך מוצק.
- מוסיפים מדיום תרבות (500 μL לבאר עבור צלחת 24-well) לתוך בארות ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור לתרבות האורגנויד. לשנות את המדיום כל 3-4 ימים. שימו לב לאורגנואידים עד שהם גדולים מספיק כדי לעבור.
הערה: קוטר עם סביב 400-500 מיקרומטר מתאים למעבר של organoids hepatocyte. - לבודד organoids מן המטריצה החוץ תאית עם התהליך המפורט להלן. החזק פיפטת פסטר זכוכית בלהבה כדי לצמצם את הצמצם שלה (על ידי ~ 1/2). באופן מכני pipette למעלה ולמטה 5-10 פעמים כדי לנתק את organoids לתוך organoids קטן יותר במהלך passaging.
הערה: במהלך המעבר, להכין טיפים micropipette שטוף מראש צינורות עם חוצץ לשטוף קצה כדי למנוע אובדן organoids דבק צינורות או טיפים.
- הסר את supernatant ו resuspend את hepatocytes עם תערובת של מטריצה חוץ תאית ומדיום תרבות ביחס של 3:1.
2. מניפולציה גנטית של אורגנוידים הפטוציטים מורין
- תאים בודדים מאורגנואידים של הפטוציטים
- הוסף 500 μL של קר לשטוף בינוני / פתרון שחזור תא לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה כדי להרוס את תערובת המטריצה החוץ תאית/תאית עם מיקרופיפט ולאחר מכן להעביר את ההשעיה האורגנוידית לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל על קרח. לחלופינית, להפוך את הצינור למעלה ולמטה מעת לעת כדי להפשיר את התערובת ביסודיות.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500-800 x g ו 4 °C (7 °F) להשליך את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של פתרון טריפסין לכדור ולצינור אותו לערבב. דגירה ב 37 °C (5-10 דקות) ולאחר מכן להפסיק את העיכול על ידי הוספת נפח 2x של לשטוף בינוני.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 800 x g ו 4 °C (4 °F) ולהשליך את supernatant. resuspend הכדור עם מדיום תרבית ולספור את התאים באמצעות hemacytometer.
- תעתיק siRNA או plasmid
הערה: organoids קטן יותר עם קוטר של פחות מ 50 מיקרומטר או תאים בודדים מן organoids hepatocyte הם transfected עם siRNA באמצעות Lipofectamine או plasmids באמצעות ריאגנט transfection על פי הוראות היצרן.- מערבבים siRNA או פלסמידים עם ריאגנט טרנספקטיון. הוסף תאים בודדים מאורגנואידים ותערובת ליפופקטמין-RNA/ליפו-פלסמיד (למשל, RNAiMAX) ל-1-2 בארות בצלחת 24-well וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-500 x גרם ו-32 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לדגור את הצלחת באינקובטור במשך 4-5 שעות ב 37 °C (77 °F).
- לאסוף את התאים ואת הזרע במטריצה חוץ תאית עם מדיום תרבית בריכוז של 10,000 תאים לבאר. שנה את המדיום למצב הבחירה יומיים לאחר ההדבקה. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
- זיהום לנטיוויראלי
הערה: organoids קטן עם קוטר פחות מ 50 מיקרומטר או תאים בודדים מן organoids hepatocyte נגועים lentivirus באמצעות ריאגנטים זיהום בינוני על פי הוראות היצרן.- לערבב 250 μL של השעיית תא יחיד מן organoid ו 250 μL של חלקיקים ויראליים בצינור 1.5 מ"ל.
- צלחת את התערובת צנטריפוגה במשך 1 שעה ב 500 x g ו 32 °C (70 °F). דגירה במשך 4-5 שעות ב 37 °C (7 °F).
- לאסוף את התאים ואת הזרע במטריצה חוץ תאית עם מדיום תרבות. שנה את המדיום למצב הבחירה יומיים לאחר ההדבקה. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
- הנדסה גנטית מאת CRISPR/Cas9
הערה: אנו מספקים וידאו עבור ביצועים אלה בחומרים משלימים. תאים בודדים מאורגנואידים נדבקו בלנטיוירוס או הועברו על ידי פלסמידים שנשאו sgRNA ו- Cas9.- לעכל תאים בודדים מן האורגנוידים hepatocyte תרבית ומעבר על פי השיטה לעיל.
- להדביק תאים בודדים עם sgRNA באמצעות Opti-MEM בינוני ריאגנטים זיהום על פי הוראות היצרן.
- לערבב 250 μL של השעיה של תא יחיד ו 250 μL של חלקיקים ויראליים יחד בצינור 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגות תערובת 500 μL עבור 1 שעה ב 500 x g ו 32 °C (5 °F) ולאחר מכן דגירה במשך 4-5 שעות ב 37 °C (7 °F).
- לאסוף את השעיית התא וזרע במטריצה חוץ תאית. להעריך את יעילות היווצרות האורגנויד לאחר 10 ימים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האורגנוידים הפטוציטים מנקבה אלב-Cre; עכבר Rosa26-GFP (8 שבועות) נצפו חמישה ימים לאחר זריעה (איור 1A). האורגנוידים מתרבים עם כתמים חיוביים של Ki67 (איור 1B). ביטוי מפריע של גנים מייצגים באורגנוידים hepatocyte או על ידי transfection siRNA או זיהום lentivirus נבדק על ידי qRT-PCR ו כתם מערבי. התוצאות מוצגות באיור 2A וב-2B. איור 2C מציג את תוצאות הבחירה של אורגנוידים בכבד לאחר 14 ימים של טיפ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היכולת לתרבות הפטוסיטים בוגרים לאורך תקופות ארוכות היא בסיסית בחקר מדע בסיסי בכבד, טוקסיקולוגיה של תרופות וזיהומים של פונדקאי-מיקרוביולוגיה הפטטרופית כגון מלריה ווירוסי הפטיטיס. עם נישה מוגדרת היטב, הפרוטוקול כאן מקים מערכת תרבות להפטוציטים. פרוטוקול זה מניע hepatocytes בוגרים להתרחב בתרבות 3D עם הטרוגניות כי recapitulatulates אינטראקציה תא תא, רוב הפונקציה hepatocyte ושינויים גנטיים, המאפשר את העיצוב של מחקרים תפקוד גנים ואפיקים טיפוליים חדשניים לקראת טיפול רגנרטיבי.
hepatocytes באיכות גבוהה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם חושפים קונפליקטים.
תודות
אנו מודים לפרופסור הנס פיקחס על שסיפק באדיבות את קווי התא כדי לייצר R-spondinant recombinant1. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים מתוכנית המחקר והפיתוג הלאומית של סין (2019YFA0111400), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31970779) ל- H.H., וקבוצת המחקר הבינתחומית והחדשנות לנוער של אוניברסיטת שאנדונג (2020QNQT003) ל- H.H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>מאגר זלוף | |||
| EGTA | סנגון ביטק | A600077-0100 | 3.50 גרם/ליטר |
| גלוקוז | סנגון ביטק | A100188-0500 | 9.00 גרם/ליטר |
| KCl | סנגון ביטק | A100395-0500 | 4.00 גרם/ליטר |
| Na2HPO4· 12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 גרם/ליטר |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 גרם/ליטר |
| NaH2PO4· 2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 גרם/ |
| ליטר NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 גרם/ליטר |
| פנול אדום | סנגון Bitech | A100882-0025 | 0.06 גרם/ליטר |
| <חזק>מאגר עיכול | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 מ |
| 'קולגנאז IV | סיגמא | C1639 | 0.10 מ"ג/מ"ל |
| HEPES | סנגון ביטק | C621110-0010 | 23.80 גרם/ליטר |
| KCl | סנגון ביטק | A100395-0500 | 4.00 גרם/ליטר |
| Na2HPO4· 12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 גרם/ליטר |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 גרם/ליטר |
| NaH2PO4· 2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 גרם/ליטר |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 גרם/ליטר |
| <חזק>חוצץ טיפים | |||
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10091148 | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| Wash בינוני | |||
| מתקדם DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| פניצילין/סטרפטומיצין | סנגון ביטק | A600135-0025 | 100 X |
| <חזק>תרבית בינונית | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | ריכוז מלאי 500 ומיקרו; M, סופי ריכוז 2 ומיקרו; M |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | מאוחסן ב-4 מעלות; |
| C B-27 תוסף 50x, מינוס ויטמין A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | ריכוז מלאי 30 מ"מ, ריכוז סופי 3 ומיקרו; M |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | מאוחסן ב-4 מעלות; C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | ריכוז מלאי 100 מ"מ, ריכוז סופי 10 ננומטר |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | ריכוז מלאי 500 מ"מ, ריכוז סופי 1 מ"מ |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | ריכוז מלאי 1 M, ריכוז סופי 3 מ"מ |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| רקומביננטי אנושי EGF | Peprotech | AF-100-15 | ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל |
| רקומביננטי אנושי FGF10 | Peprotech | 100-26 | ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל |
| רקומביננטי אנושי HGF | Peprotech | 100-39 | ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 25 ננוגרם/מ"ל |
| רקומביננטי אנושי TGF ואלפא; | Peprotech | 100-16A | ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל |
| TNF אנושי רקומביננטי אלפא; | אוריג'ין | TP750007-1000 | ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל |
| מעכב רו קינאז Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 דיהידרוכלוריד | ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 10 ומיקרו; M |
| Rspondin-1 בינוני | יציב קו תאים יציב שנוצר במעבדת Hu. ריכוז סופי 15%. | ||
| <חזק>אחרים | |||
| 0.22 & m | פילטר Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # צינור סיליקון | LangerPump | ||
| 24 באר, מתלה | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 ° אמבט | |||
| 70 ומיקרו; מסנן m | BD | 352350 | |
| תא גזע Accutase | AT-104 | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C | |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | עכבר |
| אנטי-GAPDH | CST | 5174S | ארנב |
| אנטי-HDAC7 | Abcam | ab50212 | עכבר |
| אנטי-KI67 | Abcam | ab15580 | ארנב |
| בטיחות ביולוגית ארון | ESCO | CCL-170B-8 | |
| פתרון שחזור תאים | קורנינג | 354253 | מאוחסן ב-4 מעלות; C |
| צנטריפוגה 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| חממת CO2 | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | מאוחסנים ב- RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | מאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo., Ltd | LV2020-2364 | מאוחסן ב -80 ° C |
| Hitrans G A | שנחאי Genechem ושות', בע"מ | REVG004 | יעילות מוגברת של זיהום וירוסים |
| Image Pro Plus תוכנה | מדיה קיברנטיקה, בת'סדה, מרילנד, ארה"ב | גרסה 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection | Reagent Invitrogen | 13778150 | יעילות זיהום וירוסים מוגברת |
| צבע תאים חיים | Luna | F23001 | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| צנטריפוגה שולחנית במהירות נמוכה | TD5A-WS/TD5AWS | ||
| Nucleofactor-& 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 מאוחסן ב-4 מעלות; C | |
| פסטר פיפטה | סנגון Bitech | F621006-0001 | |
| משאבה פריסטלטית | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF ממברנה | Millipore | IPVH00010 הפעל עם מתנול | |
| PX458 | Addgene | 48138 | מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; C |
| צנטריפוגה מקוררת | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 4 ומיקרו; M |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | מאוחסן ב-4 מעלות; C |
| Wee1 siRNA | גואנגג'ואו RiboBio ושות', בע"מ | siG2003180909205971 | מאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; ג |
מקורות
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
