Coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare l'impatto della rigidità e del confinamento
Summary
È ormai riconosciuto che l’ambiente tridimensionale delle cellule può svolgere un ruolo importante nel loro comportamento, maturazione e/o differenziazione. Questo protocollo descrive un modello di coltura cellulare tridimensionale progettato per studiare l’impatto del contenimento fisico e dei vincoli meccanici sui megacariociti.
Abstract
L’ambiente 3D che porta sia al confinamento che ai vincoli meccanici è sempre più riconosciuto come un importante determinante del comportamento cellulare. La cultura 3D è stata così sviluppata per affrontare meglio la situazione in vivo. I megacariociti si differenziano dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel midollo osseo (BM). Il BM è uno dei tessuti più molli del corpo, confinato all’interno dell’osso. Essendo l’osso scarsamente estensibile alla scala cellulare, i megacariociti sono contemporaneamente sottoposti a una debole rigidità e ad un elevato confinamento. Questo protocollo presenta un metodo per il recupero degli HSPC negativi al lignaggio di topo (Lin-) mediante selezione immunomagnetica e la loro differenziazione in megacariociti maturi in un mezzo 3D composto da metilcellulosa. La metilcellulosa non è reattiva nei confronti dei megacariociti e la sua rigidità può essere regolata a quella del midollo osseo normale o aumentata per imitare un midollo fibrotico patologico. Il processo di recupero dei megacariociti per ulteriori analisi cellulari è anche dettagliato nel protocollo. Sebbene l’estensione del proplatelet sia impedita all’interno dell’ambiente 3D, è descritto di seguito come risospendare i megacariociti in mezzo liquido e quantificare la loro capacità di estendere i proplatelet. I megacariociti cresciuti in idrogel 3D hanno una maggiore capacità di formare proplatelet rispetto a quelli coltivati in un ambiente liquido. Questa coltura 3D permette i) di differenziare i progenitori verso i megacariociti che raggiungono uno stato di maturazione più elevato, ii) di ricapitolare fenotipi che possono essere osservati in vivo ma passano inosservati nelle colture liquide classiche, e iii) di studiare le vie di trasduzione indotte dai segnali meccanici forniti da un ambiente 3D.
Introduction
Le cellule del corpo sperimentano un complesso microambiente 3D e sono soggette all’interazione tra segnali chimici e meccanofisici tra cui rigidità dal tessuto e confinamento dovuto alle cellule vicine e alla matrice circostante 1,2,3. L’importanza della rigidità e del confinamento per il comportamento cellulare è stata riconosciuta solo negli ultimi decenni. Nel 2006, il lavoro seminale di Engler et al. 4 ha evidenziato l’importanza dell’ambiente meccanico per la differenziazione cellulare. Gli autori hanno dimostrato che la variazione della rigidità del substrato cellulare ha portato all’orientamento delle cellule staminali verso vari lignaggi di differenziazione. Da allora, l’impatto dei segnali meccanici sul destino e sul comportamento cellulare è diventato sempre più riconosciuto e studiato. Nonostante sia uno dei tessuti più molli dell’organismo, il midollo osseo ha un’organizzazione strutturale 3D che è confinata all’interno dell’osso. La rigidità del midollo, sebbene tecnicamente difficile da misurare con precisione, si stima che si trovi tra 15 e 300 Pa 5,6. All’interno dello stroma, le cellule sono strettamente confinate l’una all’altra. Inoltre, la maggior parte di loro sta migrando verso i vasi sinusoidi per entrare nella circolazione sanguigna. Queste condizioni creano ulteriori vincoli meccanici sulle celle adiacenti, che devono adattarsi a queste forze. I segnali meccanici rappresentano un parametro importante le cui conseguenze sulla differenziazione dei megacariociti e sulla formazione di proplatelet sono state recentemente esplorate. Sebbene i megacariociti possano differenziarsi in vitro in coltura liquida tradizionale, non raggiungono il grado di maturazione osservato in vivo, in parte a causa dell’assenza di segnali meccanici dall’ambiente 3D 7. I progenitori in crescita incorporati nell’idrogel portano segnali meccanici 3D che mancano nell’ambiente liquido.
Gli idrogel sono stati ampiamente utilizzati per diversi decenni in campo ematologico, in particolare per far crescere le cellule in saggi di formazione di colonie per quantificare i progenitori ematopoietici. Tuttavia, tali idrogel sono stati raramente utilizzati per esplorare l’impatto biologico dell’ambiente meccanico 3D sulla maturazione e la differenziazione delle cellule ematopoietiche. Negli ultimi anni il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di coltura 3D utilizzando un idrogel 8a base di metilcellulosa. Questo gel fisico non reattivo è uno strumento utile per imitare i vincoli fisici dell’ambiente nativo dei megacariociti. È derivato dalla cellulosa mediante sostituzione dei residui di idrossile (-OH) con gruppi metossido (-OCH3). Sia il grado di sostituzione metilica che la concentrazione di metilcellulosa determinano la rigidità dell’idrogel una volta che si è gelificato. Durante la fase di sviluppo di questa tecnica, è stato dimostrato che un modulo di Young nell’intervallo da 30 a 60 Pa è la rigidità ottimale del gel per la crescita dei megacariociti 9.
Il seguente protocollo descrive un metodo per far crescere i progenitori megacariocitici del topo in un idrogel 3D di metilcellulosa. È stato precedentemente dimostrato che rispetto alla coltura liquida standard, questa coltura di idrogel aumenta il grado di poliploidizzazione dei megacariociti, migliora la maturazione e l’organizzazione intracellulare e aumenta la capacità dei megacariociti di estendere i proplati una volta risusciati in un mezzo liquido 9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il protocollo per l’isolamento delle cellule lin− del midollo osseo di topo e il loro incorporamento in un idrogel di metilcellulosa per la coltura 3D, nonché la quantificazione della loro capacità di produrre proplatelet e il recupero delle cellule per ulteriori analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel decennio precedente, la meccanobiologia ha suscitato sempre più interesse in molte aree della biologia. Ora è comunemente riconosciuto che l’ambiente meccanico che circonda le cellule svolge un ruolo nel loro comportamento, sottolineando l’importanza di studiare come i megacariociti percepiscono e rispondono ai segnali meccanici extracellulari. È difficile misurare con precisione la rigidità del tessuto del midollo osseo in situ11, soprattutto se consideriamo il midollo rosso emat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Fabien Pertuy e Alicia Aguilar che inizialmente hanno sviluppato questa tecnica in laboratorio, così come Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasburgo) che ha caratterizzato le proprietà viscoelastiche dell’idrogel di metilcellulosa. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e da una sovvenzione ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher è una destinataria della Fondation pour la Recherche Médicale (numero di sovvenzione FRM FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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