本方案描述了器官型脑片培养物（OTSCs）的制备方法。该技术有助于 离体 完整多细胞组织的培养。OTSCs 可立即用于在多细胞环境中检测其对药物的相应反应。
本文内容
摘要
摘要
迫切需要建立能够真实模拟原发性胰腺癌及其转移的临床前模型，以评估治疗反应 离体 并促进个体化患者治疗。然而，目前常用模型（如患者来源的细胞系和异种移植模型）缺乏肿瘤特异性的微环境，因此仅能提供有限的预测性信息。器官型组织切片培养（OTSCs）包含完整的多细胞组织，可快速用于空间分辨的药物反应检测。
本方案描述了胰腺癌及其转移灶的活性肿瘤组织切片的制备与培养方法。简言之，将组织包埋于低熔点琼脂糖中，并在低温等渗缓冲液中保存。随后，使用振动切片机切割出厚度为300 µm的组织切片。制备完成后，将切片置于气液界面，利用细胞培养小室及适当的培养基进行培养。在培养过程中，可监测细胞分化状态和活性的变化。此外，该技术可在体外（ex vivo）对活性的人类肿瘤组织施加处理，并进行后续下游分析，如转录组和蛋白质组谱型分析。
OTSCs 为测试个体治疗反应提供了独特的机会 离体 并鉴定与肿瘤不同区域特异性反应相关的独立转录组学和蛋白质组学特征。OTSCs 可进一步用于探索治疗策略，以实现胰腺癌原发灶及转移灶的个体化治疗。
引言
目前，胰腺导管腺癌（PDAC）及其相应转移灶的临床前模型在预测患者治疗反应方面效果不佳，这是药物开发和预测性生物标志物鉴定中的一个主要缺陷1。尽管患者来源类器官和患者来源异种移植模型具有一定的前景，但其应用仍受限2。这些体外（in vitro）模型的主要局限性在于缺乏肿瘤微环境，以及需在非人类免疫缺陷物种中进行异种移植。近年来，特别是在PDAC及其转移灶中，肿瘤微环境因其在肿瘤生物学中的关键作用而受到越来越多的关注。肿瘤微环境包含细胞成分和非细胞成分，例如（肌）成纤维细胞、胰腺星状细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质、细胞因子和生长因子3。该微环境并非无功能的肿瘤附属成分，而是可促进肿瘤进展和转移，并似乎在放疗和化疗耐药中发挥重要作用4。PDAC的微环境不仅在机械上阻碍药物递送，还具有免疫调节和药物清除活性5,6,7。因此，迫切需要能够反映肿瘤细胞与肿瘤微环境之间复杂相互作用的临床前模型，以在体外（ex vivo）准确评估患者的治疗反应，并指导个体化临床治疗。
ex vivo 培养的新鲜肿瘤样本能够高度接近肿瘤在体内的真实状态。原位组织切片培养（OTSCs）近年来已被开发并用于多种肿瘤的研究，包括头颈部、乳腺、前列腺、肺、结肠及胰腺肿瘤8,9,10,11,12。研究表明，OTSCs 在培养期间可在一定时间内（依组织类型而定）维持其基础形态、增殖活性以及肿瘤微环境11,12,13。多项体外研究显示，胰腺导管腺癌（PDAC）的 OTSCs 在培养 4 至 9 天内仍可保持细胞活力、组织形态以及肿瘤微环境的大部分组分5,12,14。从应用前景来看，该技术可实现将治疗手段直接应用于具有活性的人体肿瘤组织ex vivo，并进行后续的下游分析，例如转录组和蛋白质组学分析。
OTSCs 的建立为术后立即进行 ex vivo 治疗反应测试提供了独特的机会。因此，OTSCs 将有望用于识别治疗策略，以实现转移性疾病治疗的个体化。本方案描述了胰腺癌有活性的 OTSCs 的生成与培养过程。
方案
在获得吕贝克大学当地伦理委员会批准后（批准编号：16-281），收集并处理了组织样本。
1. 新鲜组织的采集与处理
注意：所有未固定的 人体组织标本均应谨慎处理，以防止血液传播病原体感染的风险。所有患者在组织处理前均应检测为 HIV、HBV 和 HCV 阴性。操作时应穿戴防护服，并佩戴手套处理人体组织标本。
- 手术后立即收集新鲜、未固定且未冷冻的胰腺导管腺癌（PDAC）组织样本，最小尺寸为 0.4 × 0.4 cm，并将样本置于组织保存液中运送至实验室。
- 尽可能立即处理新鲜组织。
- 或者，可将组织置于湿冰上的组织保存液中，在 4 °C 下过夜保存。然而，组织保存可能导致细胞活力下降，应尽量避免。
2. 准备
- 低熔点琼脂糖制备
- 通过将 8 g 琼脂糖溶解于 100 mL 预热的林格氏液中，配制 100 mL 的 8% 低熔点琼脂糖溶液，并在 4 °C 保存至使用前。
- 在宣布进行肿瘤切除后，使用微波炉熔化琼脂糖。
- 将琼脂糖置于预热的水浴（37 °C）中，使其冷却至生理温度后再进行后续制备。
- 振动切片机设置
- 将刀片装入振动切片机的刀架中，并根据制造商说明（如适用）进行自动角度调节。
- 使用冷却装置或湿冰对切削室夹套进行降温。
- 向切削室中加入约 100 mL 生理切割溶液（例如林格氏液）。
- 将安装好的刀片放入预冷的切割溶液中，使刀片充分冷却。
3. 组织在低熔点琼脂糖中的包埋
- 用预冷（4 °C）的 PBS 冲洗组织样本，并将组织置于 PBS 中，放入一个较大的培养皿（约 14 cm）中，置于冰上。
- 在冰上使用解剖刀去除肉眼可见的多余结缔组织，因其可能影响切片效率。
- 将组织放入一个小培养皿（约 3 cm）中。
- 调整组织的方向，使残留的肉眼可见结缔组织与培养皿底部平面方向一致。培养皿底部的方向与切片平面方向相同。
- 将预先准备好的低熔点琼脂糖倒入小培养皿中。
- 如有需要，使用镊子重新调整组织的方向。
- 将培养皿置于湿冰上，以加快琼脂糖的凝固。
- 使用解剖刀小心地切割组织，确保组织每侧均保留至少 5 mm 的周围琼脂糖。
- 小心转移包埋的组织，并使用瞬干胶将其粘附在样品托上。
- 数秒后，将样品托放入切片室中。
- 如有需要，调整组织相对于刀片的方向。
4. 使用振动切片机对琼脂糖包埋的组织进行切片
- 根据组织样本的大小确定切片范围的外侧边界（y轴）。
- 将刀片调整至组织块的顶部。
- 设置切片速度为0.04 mm/s，切削振幅为1 mm，切片厚度为300 µm。
- 小心地切下最初的切片，并将切片转移至装有预冷（4 °C）切片液的独立容器中，容器置于湿冰上。
5. 器官型脑片培养物的培养
- 在6孔板中每孔加入1 mL适当的培养基。
- 培养基A：Advanced DMEM/F12，10% FBS，1%青霉素/链霉素。
- 培养基B：RPMI 1640，10% FBS，1%青霉素/链霉素，4 µg/mL胰岛素，8 ng/mL EGF，0.3 µg/mL氢化可的松。
注意：最佳培养条件所用的培养基可能因组织类型和患者个体而异。本研究比较了两种不同的组织培养基，一种基于DMEM/F12（培养基A），另一种基于RPMI（培养基B）。这两种培养基之间未观察到显著差异。本方案中所示的所有实验均使用培养基A。
- 将含培养基的6孔板放入培养箱中，使温度和pH值在开始培养前达到平衡。
- 使用纱布滤膜将组织切片转移至细胞培养插入式小室（例如，孔径为0.4 µm的亲水性PTFE插入小室）上。
- 将载有切片的滤膜置于无菌布上，以去除多余的切割液。
- 将载有切片的滤膜放入已准备好的6孔板中。切勿向插入式小室内额外添加培养基。
- 将6孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO2）。
- 每隔2天更换一次培养基，方法是使用新的6孔板重复步骤5.1、5.2和5.5。
注意：类器官切片培养的持续时间可根据具体研究问题而定。
6. 刃天青细胞活力检测
注意：刃天青活力检测法通过检测活细胞将无荧光的蓝色刃天青还原为红色荧光的试卤灵的程度，来评估类器官切片培养物的总体代谢活性15。该检测对细胞无毒性，可根据具体研究问题对同一批培养物进行多次重复检测。每2-3天使用刃天青检测法测定一次活力。
- 刃天青储备液的制备
- 关闭超净工作台的照明灯，因为刃天青储备液对光敏感。
- 用1×PBS配制浓度为10 mg/mL的刃天青钠盐储备液。
- 将储备液分装后避光保存于4 °C冰箱中，直至使用。
- 组织切片整体活力的评估
- 关闭超净工作台的照明灯，因为刃天青储备液对光敏感。
- 用适当的培养基将刃天青储备液稀释1:250。
注：稀释所用的培养基应与培养过程中使用的培养基相同（培养基A或培养基B）。 - 每片组织切片准备1 mL最终的刃天青溶液，并额外增加1 mL用于空白对照；例如，对于6片组织切片，将28 µL刃天青储备液加入7 mL培养基中进行稀释。
- 在6孔板中每孔加入1 mL稀释后的刃天青溶液。
- 将带有组织切片的培养滤膜转移至含有刃天青溶液的孔中。其中一个含有刃天青溶液的孔保持为空白对照。
注：为简化实验流程，此步骤可与更换培养基（步骤5.7）同时进行。然而，若需进行额外的活力检测，该检测可在组织切片培养过程中的任意时间点进行。 - 将组织切片置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。
- 若需继续培养组织切片，预先准备含培养基的新6孔板（见步骤5.1和5.2）。
- 将带有组织切片的培养滤膜从刃天青溶液中取出，并将其放置于无菌纱布上以去除多余液体。
- 将带有组织切片的培养滤膜转移至预先准备好的培养板中。
- 从每个6孔中取出100 µL刃天青溶液，转移至96孔板中。从空白对照中取三份样品（3 × 100 µL），分别加入96孔板的不同孔中。
- 根据仪器制造商的说明，使用酶标仪测定吸光度。激发波长设为545 nm，发射波长设为600 nm。
7. OTSCs 的福尔马林固定与石蜡包埋
- 小心将培养的组织切片转移至塑料包埋盒中。操作步骤如下：
- 将带有固定切片的培养滤膜置于培养皿中。
- 使用解剖刀仔细将带有固定组织切片的滤膜切割下来。
- 小心地将带有固定切片的滤膜转移至尼龙活检袋中，并放入包埋盒内。
- 随后将塑料包埋盒放入盛有预冷（4 °C）4.5% 甲醛溶液的容器中。切片可在 4 °C 的甲醛溶液中保存至后续使用，但应至少固定 24 小时。
注意：OTSCs 极易撕裂，转移时需格外小心。
- 用流动的自来水小心冲洗经甲醛固定的切片培养物 1.5 小时。
- 通过以下步骤对甲醛固定的组织切片进行脱水：70% 乙醇中孵育（2 次，每次 3 小时），95% 乙醇中孵育（1 次过夜，1 次 3 小时），最后在无水乙醇中孵育（1 次 3 小时，1 次过夜）。
- 用二甲苯在 3 小时内分两次孵育，以透明化甲醛固定的组织切片。
- 将组织在 60 °C 的石蜡中浸渍（1 次过夜，1 次 2 小时）。将组织置于组织包埋模具中，包埋于石蜡块内。
- 使用切片机将石蜡包埋的组织块切成 4 µm 厚的切片，并漂浮于含蒸馏水的 40 °C 水浴中。随后将切片转移至载玻片上。
- 将石蜡切片在 60 °C 孵育 1 小时，以使组织牢固附着于载玻片。再将载玻片在 37 °C 孵育过夜。
8. 苏木精和伊红（H&E）染色
- 将步骤7.7的切片放入二甲苯中孵育（3次，每次5分钟）以脱蜡。
- 依次放入无水乙醇（2次，每次5分钟）、95%乙醇（2次，每次5分钟）和70%乙醇（1次，5分钟）中孵育以再水化。用蒸馏水短暂冲洗。
- 用Mayer苏木精溶液染色5分钟。用流动的自来水冲洗10分钟。
- 用0.5%伊红溶液复染40秒。用蒸馏水冲洗。
- 依次放入70%乙醇（最多1分钟）、95%乙醇（2次，每次3分钟）和无水乙醇（2次，每次3分钟）中孵育以脱水。
- 在三份二甲苯中各透明数秒。滴加一滴封片剂，盖上盖玻片封片。
9. OTSCs的免疫组织化学
- 将切片在二甲苯中孵育 2 次，每次 10 分钟进行脱蜡，随后在 1:1 乙醇/二甲苯溶液中孵育 10 分钟。
- 将载玻片转移至 100% 乙醇（2 次，每次 3 分钟）、96% 乙醇（2 次，每次 3 分钟）、70% 乙醇（1 次，3 分钟），然后转移至 50% 乙醇（1 次，3 分钟）。
- 进行抗原修复以暴露抗原表位。将载玻片置于柠檬酸盐缓冲液中，在微波炉中以 900 W 加热 5 分钟，随后以 600 W 加热 2 次，每次 8 分钟。让载玻片在室温下冷却 20 分钟。
- 在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 在湿盒中，用含 0.1% Triton X-100 的 PBS（每张载玻片 200 µL）于室温孵育 10 分钟，以通透细胞膜。
- 在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 在湿盒中，用甲醇配制的 3% H2O2 溶液（每张载玻片 200 µL）于室温孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
- 在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 加入 200 µL 封闭缓冲液（PBS 中含 1:50 马血清），在湿盒中于室温孵育 25 分钟。
- 将载玻片倾斜置于吸水纸上，去除封闭缓冲液。
- 在载玻片上加入 200 µL 用抗体稀释液适当稀释的一抗（每张载玻片 200 µL），在湿盒中于 4 °C 孵育过夜。作为阴性对照，使用与一抗相同稀释度的适当同型小鼠免疫球蛋白。
- 在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 在载玻片上加入 200 µL 生物素标记的二抗（PBS 中 1:50 溶液），在湿盒中于室温孵育 30 分钟。
- 在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 根据制造商说明书，在使用前配制亲和素/生物素-过氧化物酶复合物。在载玻片上加入 200 µL 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，在湿盒中于室温孵育 30 分钟。
- 在摇床上用 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟。
- 在每张载玻片上加入 200 µL DAB 底物溶液（使用前新鲜配制：1 mL 底物中加入 1 滴 DAB），显色 1–3 分钟，直至达到所需颜色强度。
- 用流动自来水冲洗 10 分钟。
- 将载玻片浸入苏木精中 5 分钟进行复染。
- 用流动自来水冲洗 10 分钟。
- 使用水性封片剂和盖玻片封片。封片后的载玻片可长期在室温下保存。
结果
图1 展示了从新鲜未冻存的肿瘤组织中培养OTSC的工作流程概览。原发性PDAC及转移灶标本在手术切除后立即采集，并在4 °C条件下用湿冰保存过夜，置于组织保存液中。随后对标本进行处理，并按照本方案所述方法将组织切片进行培养。在培养过程中，每个OTSC的宏观形态未发生明显变化。然而，OTSC表面积的大小随时间推移逐渐减小，如图2A所示，在为期6天的培养过程中具有代表性地呈现此趋势。OTSC的整体活力通过刃天青（resazurin）活力检测在第0、2/3和第6天进行评估（图2B）。刃天青活力检测基于活细胞将无荧光蓝色的刃天青还原为红色荧光产物刃天青素（resorufin）的能力，从而反映OTSC的整体代谢活性15。图2B展示了两种不同培养基中培养的两个代表性原发肿瘤来源OTSC的活力检测结果比较。OTSC分别在培养基A（高级DMEM/F12，10% FBS，1%青霉素/链霉素）或培养基B（RPMI 1640，10% FBS，1%青霉素/链霉素，4 µg/mL胰岛素，8 ng/mL EGF，0.3 µg/mL氢化可的松）中培养，结果显示无论使用何种培养基，OTSC的整体活力相似。值得注意的是，第0天后活力下降的情况常可观察到，这是由于组织切片操作及适应培养环境所致，属于预期现象。但我们也观察到活力上升的情况，如右图面板所示（图2B）。
在A培养基中培养特定时间后，将OTSCs用福尔马林固定，以进行后续免疫组织化学表征（IHC）。福尔马林固定后，OTSCs经石蜡包埋并切片。H&E染色切片显示，组织的整体结构在整段培养期间均得以保持。 离体 (图3）。肿瘤细胞和间质细胞分别通过细胞角蛋白7和波形蛋白的免疫组化染色进行区分。在培养过程中，肿瘤细胞与间质细胞的比例未见显著变化。
对H&E切片进行显微镜下组织病理学评估，未发现所有培养组织在培养期间出现明显的坏死增加（图3、图4、图5）。此外，分别通过Ki-67和cleaved caspase 3染色来评估细胞增殖和凋亡情况。同样，在为期6天的培养期间，我们未观察到增殖和凋亡发生显著变化（图3）。然而，在延长培养时间的情况下，cleaved caspase 3染色结果显示凋亡细胞的比例随时间逐渐增加。图4展示了原代PDAC培养15天后cleaved caspase 3阳性细胞的增加情况。图5展示了PDAC腹膜转移灶的组织病理学特征。该实验表明，不同组织切片之间在肿瘤/间质含量以及通过cleaved caspase 3染色检测到的自然发生的凋亡方面均存在显著的瘤内异质性。因此，对培养的OTSCs进行组织病理学评估对于分析每例培养肿瘤或其转移灶的肿瘤/间质结构及存活状态具有重要意义。
图6 显示了腹壁PDAC转移灶的组织病理学结果。H&E染色以及细胞角蛋白7的免疫组化染色显示，所获得的OTSC不包含任何肿瘤细胞，仅由结缔组织构成，部分区域呈坏死状态。OTSC技术的一个局限性在于，无法在培养前对新鲜、未固定且未冷冻的组织进行肿瘤细胞含量的评估。
总体而言，这些数据表明，包含不同类型细胞的肿瘤及其相应转移灶的多细胞结构在OTSCs中得到了体现，尤其是肿瘤-间质相互作用得以保留。
图1：从新鲜未冷冻的肿瘤/转移组织标本中培养OTSCs的工作流程概览。 使用振动切片机将新鲜未冷冻的组织标本进行切片，并在聚四氟乙烯（PTFE）细胞培养插件上于气液界面进行培养。可在预定时间点通过刃天青活力检测法测定整体存活率。该检测方法允许在完成活力测定后继续培养组织切片。在预定时间点将切片用福尔马林固定，以进行后续组织病理学检查。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：OTSCs在培养期间的宏观形态及细胞活力。 一例PDAC标本被用于培养OTSCs，持续6天。（A）每个OTSC的宏观形态在培养过程中未见明显变化。然而，OTSCs的表面积随时间推移逐渐减小。（B）通过刃天青细胞活力检测法在培养基A和B中定量总体活力。由于切片操作及对培养条件的适应，通常在第0天后可观察到活力下降。但我们也观察到活力上升的情况，如右图所示。每个图板代表一个独立的肿瘤标本，其衍生的组织切片培养产量不同（左图 n = 10，右图 n = 10）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：OTSCs在总共培养6天后的组织病理学评估。 OTSCs（n = 6）在培养基A中进行培养。通过H&E染色评估组织形态。分别利用细胞角蛋白7和波形蛋白的免疫组化染色区分肿瘤细胞与间质细胞。Ki-67和Cleaved Caspase 3染色分别用于评估细胞增殖与凋亡。在总共6天的培养期间未观察到细胞凋亡的显著增加。每个比例尺代表100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：体外培养15天后OTSCs的组织病理学评估。 OTSCs（n = 8）在A培养基中培养。通过H&E染色评估组织形态。分别利用细胞角蛋白7和波形蛋白的免疫组化染色区分肿瘤细胞与间质细胞。Ki-67和活化型caspase 3染色分别用于评估细胞增殖与凋亡。如活化型caspase-3染色所示，培养15天后细胞凋亡显著增加。每条标尺代表100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：胰腺导管腺癌腹膜转移瘤类器官（OTSCs）的组织病理学评估。 将OTSCs（n = 8）在A培养基中进行培养。通过H&E染色评估组织形态。分别使用细胞角蛋白7和波形蛋白的免疫组化染色区分肿瘤细胞和间质细胞。通过Ki-67和cleaved caspase 3染色分别评估细胞增殖和凋亡情况。组织病理学评估显示，不同切片之间在肿瘤/间质含量以及通过cleaved caspase 3染色检测的自然发生的凋亡方面均表现出高度的瘤内异质性。每个比例尺代表100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：腹壁胰腺导管腺癌转移灶类器官组织培养物（OTSCs）的组织病理学评估。 OTSCs（n = 5）在培养基A中进行培养。通过H&E染色评估组织形态。分别利用细胞角蛋白7和波形蛋白的免疫组化染色区分肿瘤细胞与间质细胞。分别通过Ki-67和cleaved caspase 3染色评估细胞增殖与凋亡。组织病理学评估显示，培养后的转移灶中缺乏肿瘤细胞，并出现部分坏死，而这些特征在培养前无法确定。每个比例尺代表100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
新鲜肿瘤样本的离体肿瘤组织切片（OTSCs）是肿瘤的近似模型 原位它们在培养期间于特定的、依赖组织的时间段内保持其基础形态、增殖活性及微环境11,12,13该技术能够将治疗手段直接应用于具有活性的人类肿瘤组织 离体 以及后续的下游分析，例如转录组和蛋白质组分析。OTSCs 的一个特定优势在于，可对完整的多细胞肿瘤组织进行具有空间分辨能力的下游分析，例如 MALDI 成像。
本文介绍了一种用于生成、培养及进行组织病理学评估胰腺导管腺癌（PDAC）及其转移灶的离体组织切片培养物（OTSC）的方法。该技术的关键在于对新鲜组织进行切割，避免任何冷冻处理，并在气液界面条件下进行培养。本方法的一个局限性在于，无法在培养前对新鲜、未固定且未冷冻的组织进行肿瘤细胞含量的评估。正如我们在结果中所示，OTSC可能包含与同一肿瘤其他标本快速切片所预期不同的组织成分。因此，培养后对OTSC进行组织病理学评估对于个体化切片培养的数据分析至关重要。文中所述的活力检测仅能对每个OTSC的整体活力进行一般性评估。总体而言，只要实验室配备振动切片机和组织培养设备，即可实施本方法。由于该技术操作简便，可轻松扩展应用于多种肿瘤类型及不同的科研问题。
已开发出多种方法用于培养人类肿瘤组织 离体例如原代细胞系、患者来源的类器官和异种移植模型。然而，由于这些模型大多失去了组织微环境背景，即基质细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，其在药物开发和预测性生物标志物鉴定中的应用仍然受限2.
尽管所介绍的器官型脑片培养方法能够保持多细胞组织结构，但仍需考虑若干局限性。首先，必须重视肿瘤内部及不同区域之间的异质性。来自同一肿瘤活检样本的不同器官型脑片培养物（OTSC）在肿瘤细胞与基质细胞的比例上可能存在显著差异。除整体组织质量外，这可能是导致脑片在培养过程中存活率不同的原因之一。其次，最佳培养条件所需的培养基可能因组织类型和患者个体而异。我们比较了两种不同的组织培养基：一种基于DMEM/F12（培养基A），另一种基于RPMI（培养基B）。每个原发肿瘤或其转移灶样本可能都需要进行培养基的调整。第三，肿瘤坏死可能在体内（in situ）已存在16，并不一定由OTSC培养条件不足所致，因此应考虑与原发肿瘤的组织病理学结果进行对比分析。
根据本方案所述建立OTSCs，可在手术后及时测试治疗反应，从而提供一种机会 离体 保留肿瘤微环境的模型系统。展望未来，OTSCs 将有助于制定个体化治疗策略，实现转移性疾病的个性化治疗。
披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
R. Braun 受吕贝克临床科学家学院（DFG #413535489）和吕贝克大学青年资助计划的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级DMEM/F-12培养基 | Gibco | 12634028 | |
| 低熔点琼脂糖 | Roth | 6351.2 | 8% 的林格氏液 |
| 抗体稀释液，降低背景 | Dako | S3022 | |
| AquaTex | 默克 | 108562 | |
| 生物乙醇（99%，变性） | CHEMSolute | 2,21,19,010 | |
| 柠檬酸一水合物 | Sigma Aldrich | C7129 | |
| 裂解型 Caspase-3（Asp175）(5A1E) 兔单克隆抗体 | 细胞信号技术公司 | 9664 | 1:400 稀释度 |
| Derby 加强型双刃安全剃须刀片 | 德比·托凯 | ||
| 包埋盒 | Roth | H579.1 | |
| 0.5% 伊红Y水溶液 | 默克 | 10,98,44,100 | |
| Eukitt快速硬化封片介质 | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 4.5% 甲醛溶液，缓冲液 | Bü化学品 | B211101000 | |
| 迈耶氏明矾硫酸铝溶液 | Roth | T865 | |
| 人表皮生长因子 | Miltenyi Biotec | 130-097-794 | |
| 氢化可的松 | Sigma Aldrich（默克） | H0888 | |
| 过氧化氢 30% | 默克 | 1,08,59,71,000 | |
| 胰岛素人 | Sigma Aldrich (Merck) | 12643 | |
| 液态DAB+底物显色系统 | Dako | K3468 | |
| MACS 组织储存液 | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
| 甲醇 | 默克 | 10.600.092.500 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | J1800AMNZ | |
| Millipore 细胞培养小室，30 mm，亲水性聚四氟乙烯，0.4 µm µm | 默克密理博（Millipore, Merck） | PICM0RG50 | |
| 单克隆小鼠抗人 细胞角蛋白 7（克隆株 OV-TL 12/30） | Dako | M7018 | 1:200 稀释 |
| 单克隆小鼠抗人Ki67克隆MIB-1 | Dako | M7240 | 1:200 稀释 |
| 单克隆小鼠抗波形蛋白抗体（克隆 V9） | Dako | M0725 | 1:200 稀释度 |
| 阴性对照小鼠IgG2a | Dako | X0943 | 1:200 稀释度 |
| 阴性对照小鼠IgG1 | Dako | X093101-2 | 1:200 稀释度 |
| 石蜡（熔点 56°- 58°) | 默克 | 10,73,37,100 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Gibco | 15140122 | |
| PBS pH 7.4 (1×)，流式细胞术级别 | Gibco | A12860301 | |
| 刃天青钠盐；PBS 中 10 mg/ml | Sigma Aldrich | R7017 | 1:250 稀释度 |
| 林格氏液 | Fresenius Kabi | 2610813 | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma Aldrich（默克） | R8758 | |
| 组织培养测试板 6 | TPP | 92006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-过氧化物酶试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6200 | |
| 二甲苯（特纯） | J.T.Baker | 8,11,85,000 | |
| <强>仪器设备 | |||
| ClarioStar 微孔板读板机 | BMG Labtech | ||
| 石蜡包埋中心 E61110 | Leica | ||
| 旋转式切片机 Microm HM355S | 赛默飞世尔科技 | ||
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参考文献
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