本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida albicans）ABC（ATP结合盒）蛋白Cdr1。设计了一种C端可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签，标签与Cdr1之间含有16个氨基酸残基的连接序列，以促进Cdr1的纯化及去垢剂筛选。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
ABC转运蛋白的生化与生物物理表征的成功在很大程度上取决于异源表达系统的选择。在过去二十年中，我们开发了一种酵母膜蛋白表达平台，已用于研究多种重要的真菌膜蛋白。表达宿主 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ADΔΔ 缺失了七种主要的内源性 ABC 转运蛋白，且含有带有功能获得性突变的转录因子 Pdr1-3，该突变可实现外源膜蛋白基因在基因组中以单拷贝稳定整合后的组成型过表达 PDR5 基因座。多功能质粒载体的构建以及一步克隆策略的优化，使得异源ABC转运蛋白的快速、准确克隆、定点突变及表达成为可能。本文中，我们描述了一种新型可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签（即单体化的酵母增强型绿色荧光蛋白yEGFP3与六聚组氨酸亲和纯化标签的融合）的设计与应用，该设计旨在避免标签对目标蛋白功能的潜在干扰，并提高His标签与镍亲和树脂的结合效率。将mGFPHis标签与膜蛋白开放阅读框（ORF）融合，可通过聚丙烯酰胺凝胶观察实现蛋白的便捷定量，并检测仍保留mGFPHis标签的降解产物。我们展示了该特性如何促进去垢剂筛选以实现膜蛋白的有效溶解。同时提供了一种高效、快速且可靠的少量质粒膜蛋白制备方案，适用于C端标记的 白色念珠菌 多药外排转运蛋白 Cdr1 过表达于 S. cerevisiae ADΔΔ 的方法。该小规模质膜分离方案可在一个工作日内获得高质量的质膜。所制备的质膜可用于测定 Cdr1 及其突变体的酶活性。
引言
从天然脂质环境中提取膜整合蛋白可能会显著影响其结构和功能1,2,3,4。生物膜复杂的脂质组成5确保了关键的蛋白质-脂质相互作用得以发生6。脂质维持膜蛋白的结构完整性，从而使其能够在目标膜区室中正常发挥功能7,8。因此，膜蛋白纯化过程中的关键第一步是从其天然环境中提取蛋白，同时不破坏其结构和/或功能。
膜蛋白结构表征存在诸多障碍，其中大多数与膜蛋白的疏水性质有关，以及难以表达出足够数量正确折叠且具有功能的膜蛋白，以满足X射线晶体学或冷冻电子显微镜（cryo-EM）9,10,11,12的研究需求。膜蛋白表达系统主要有三种类型：同源表达系统
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 制备新鲜或冷冻的感受态ADΔ和ADΔΔ细胞菌种
- 用单个酵母菌落接种25 mL的2x YPCD培养基[即2x YPD；2% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 蛋白胨，4% (w/v) 葡萄糖，0.079% (w/v) 完全补充混合物(CSM)]35，在30 °C、200转/分钟(rpm)振荡条件下过夜(o/n)培养16小时。
- 用25 mL 过夜培养物接种225 mL的2x YPCD培养基，并检测细胞在600 nm处的光密度(OD600)；OD600通常约为0.5–1.0。
注意：在此阶段，请确保后续转化实验所需的所有材料均已准备就绪。 - 继续在30 °C、200 rpm振荡条件下培养约6–8小时，直至细胞密度达到OD600约6–8。
注意：除非另有说明，以下所有步骤均在室温(RT)下进行。 - 在3,000 x g条件下离心3分钟，收集处于对数生长期的细胞。
- 用无菌的双蒸水(ddH2O)将细胞重悬并洗涤两次（即先用200 mL，再用20 mL）。
- 在3,000 x g条件下离心3分钟，收集细胞。
- 在冰上将细胞沉淀缓慢重悬于X mL的FCC溶液[5% (w/v) 甘油，10% (....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
使用pYES2质粒对S. cerevisiae ADΔΔ进行转化时获得了较高的转化频率（约4 × 104 个转化子/µg）（图2B）。如预期所示，无DNA对照组（即仅加入ddH2O）未产生任何转化子，而使用1 µg线性CDR1-mGFPHis转化盒（图1A）并结合优化的ADΔΔ转化方案，获得了约50个转化子（图2C）。此外，还检测了CDR1-mGFPHis转化子在非发酵性碳源上的生长能力，以排除可能存在的线粒体功能缺陷的petite突变体。在检测的25个尿嘧啶原养型转化子中，有3个（黄色圆圈；图2D）无法在YPG琼脂平板上生长，因此被排除在后续研究之外。由新构建的菌株ADΔΔ-CDR1-mGFPHis表达的Cdr1-mGFPHis蛋白正确地定位于质膜（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管膜蛋白的结构分析已取得最新进展，但目前尚无Cdr1或任何其他PDR转运蛋白的三维结构。因此，了解Cdr1的结构及其生化特征至关重要，这不仅有助于合理设计新型药物以克服外排介导的耐药性，还将揭示ABC蛋白一个重要亚家族的功能机制。
膜蛋白结构表征的主要要求之一是以X射线晶体学或冷冻电镜所需的数量表达正确折叠且完整的膜蛋白。在选择表达系统时，重要的标准包括操作的简便性、生长速率和成本，以及表达具有翻译后修饰蛋白的能力，这些修饰对蛋白的功能和/或稳定性可能至关重要61,62。
在过去的二十年中 S. cerevisiae 膜蛋白表达技术60 已优化14 以促进目标膜蛋白的一步法克隆24 在N端或C端标记了各种亲和标签、表位标签或报告标签，并且在需要时，其.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢新西兰马斯登基金（项目编号 UOO1305）以及泰国曼谷朱拉隆功大学医学院提供的项目经费（M. Niimi）。他们感谢奥塔哥大学为 G. Madani 提供的博士奖学金。作者们还希望感谢斯特凡·劳瑟教授及其同事阿米尔·阿佩尔鲍姆博士和戴瓦纳亚加巴里亚蒂·维纳亚甘博士，在 G. Madani 于德国多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所（MPIMP）为期六个月的访问期间所提供的支持与指导。作者们同时感谢德国学术交流中心（DAAD）为 G. Madani 提供的研究资助（项目编号 57381332），以支持其访问 MPIMP。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 (Tris 碱；超纯) | Merck | 77-86-1 | |
| 2,2-二癸基丙烷-1,3-双-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | NG310S | LMNG |
| 2,2-二己基丙烷-1,3-双-β-D-葡萄糖吡喃糖苷 | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-二辛基丙烷-1,3-双-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | NG322S | DMNG |
| 4-反式-(4-反式-丙基环己基)-环己基 α-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
| 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
| 乙酸 (冰醋酸) | Merck | 64-19-7 | |
| 琼脂 | Formedium | 009002-18-0 | |
| 钼酸铵 | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| 过硫酸铵 (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| ATP 二钠盐 | sigma-Aldrich | A-6419 | |
| 溴酚蓝 | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Formedium | DCS0019 | |
| CSM 缺尿嘧啶 | Formedium | DCS0161 | |
| 环己基-1-丁基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| 环己基-1-庚基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
| 环己基-甲基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
| DMSO | Merck | 67-68-5 | |
| 乙醇 | Merck | 459836 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR 产物纯化试剂 | Applied Biosystems | 78205 | 外切酶与磷酸酶的混合物 |
| 葡萄糖 | Formedium | 50-99-7 | |
| 甘油 | Merck | 56-81-5 | |
| 甘氨酸 | Merck | G8898 | |
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| 盐酸 | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | 用于可靠的菌落 PCR |
| 乙酸锂 (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| 六水合氯化镁 | sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-癸酰-N-羟乙基-葡萄糖酰胺 | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
| n-癸酰-N-甲基-葡萄糖酰胺 | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
| n-癸基-磷酰胆碱 | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
| n-癸基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | D322S | DM |
| n-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐 | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-十二烷基-N,N-二甲基胺-N-氧化物 | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-十二烷基-α-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | D310HA | α-DDM |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | D310S | β-DDM |
| n-壬基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷 | Anatrace | N324S | NG |
| n-壬基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | N330S | NM |
| n-十八烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐 | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-辛基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐 | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-辛基-磷酰胆碱 | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
| n-辛基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷 | Anatrace | O311S | OG |
| n-十四烷基-磷酰胆碱 | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
| n-十四烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | T315S | TDM |
| n-十三烷基-磷酰胆碱 | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
| n-十三烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | T323S | - |
| n-十一烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
| N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| 辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 蛋白胨 | Formedium | 3049-73-7 | |
| 苯甲基磺酰氟 (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion Hot Start Flex DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0535S | 高保真 DNA 聚合酶 |
| 聚乙二醇 (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
| 聚氧乙烯山梨醇单油酸酯 | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| 硝酸钾 | Sigma-Aldrich | P8394 | |
| 蛋白检测试剂盒 | Bio-Rad | 5000122 | RC DC 蛋白检测试剂盒 II |
| QC 胶体考马斯亮蓝染色液 | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prism Ultra 蛋白分子量标准 (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| 钠-L-抗坏血酸 BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| 蔗糖单十二烷酸酯 | Anatrace | S350S | DDS |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| 酵母提取物 | Formedium | 008013-01-2 | |
| 不含氨基酸的酵母氮源基础 | Formedium | CYN0402 | |
| 仪器（类型） | |||
| 离心机 (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
| 离心机 (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| 离心机 (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC 装置（配备荧光检测器、自动进样器和组分收集器的 NGC 层析中压系统） | Bio-Rad | ||
| 凝胶成像 (GelDoc EZ 成像仪) | Bio-Rad | ||
| 微孔板读数仪 (Synergy 2 多功能检测) | BioTek Instruments | ||
| PCR 扩增仪 (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
| 电源 (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS-PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
| 摇床培养箱 (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
| 紫外/可见分光光度计 (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |
参考文献
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or compl....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
