단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

Trang T. Nguyen; Steven Siang; Julien Roche

doi:10.3791/62701

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방법 논문

단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

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DOI:

10.3791/62701

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2021년 6월 29일

Trang T. Nguyen¹ , Steven Siang² , Julien Roche²

¹Department of Chemistry, Iowa State University, ²Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

이 논문에서

요약

우리는 고압 세포를 조립하고, 고압 NMR 실험을 설정하고 기록하고, 마지막으로 압력하에서 피크 강도 와 화학 적 변화 변화를 모두 분석하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 실험은 단백질의 접이식 통로 및 구조적인 안정성에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

초록

고압은 구형 단백질을 불안정하게 하고 단백질 복합체를 가역적 방식으로 해리시키는 데 사용할 수 있는 잘 알려진 교란 방법입니다. 유압은 낮은 어금니 볼륨을 가진 주쪽으로 열역학 평형을 구동합니다. 증가하는 압력은, 그러므로, 구형 단백질의 안정성및 단백질 복합체의 올리고머화 평형을 미세하게 조정할 수 있는 기회를 제공합니다. 고압 NMR 실험은 압력 변투의 미세한 안정성 튜닝 능력과 솔루션 NMR 분광법에 의해 제공되는 사이트 해상도를 결합하여 구형 단백질의 안정성, 접이식 메커니즘 및 올리고머화 메커니즘의 안정성을 관장하는 요인의 상세한 특성화를 허용합니다. 여기서 우리는 1 bar에서 2.5 kbar로 기록된 2D 1H-15N 실험세트를 통해 단백질의 국소 접이식 안정성을 조사하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 실험의 수집 및 분석에 필요한 단계는 hnRNPA1의 RRM2 도메인에서 획득한 데이터와 함께 설명됩니다.

서론

단백질과 단백질 복합체의 고에너지, 인구밀도가 낮은 형태가 많은 생물학적경로^1,^2,^3에서중요한 역할을 한다는 것은 오랫동안 인식되어 왔다. 카-퍼셀-메이붐-길(CPMG)^4,화학교류 포화전달(CEST)^5,암흑상태 교환 포화전달(DEST)⁶ 펄스 서열(그 외) 등) 실험덕분에, 용액 NMR 분광법은 일시적인 축축상태를 특성화하기 위한 선택의 방법으로^{등장했다.} 이러한 실험과 함께, 온도, pH 또는 화학 적 강수제와 같은 교란은 더 높은 에너지 형성 하위 상태의 상대적 인구를 증가시키기 위해 도입 될 수있다. 마찬가지로, 단백질 평형증은 또한 높은 정압을 적용하여 혼란을 수 있습니다. 해당 형태 변화와 관련된 부피 변화의 크기에 따라, 수백~몇 천 개의 바의 압력 증가는 더 높은 에너지 상태를 현저하게 안정화하거나 단백질이^8,^9,