通过流式细胞术进行质量控制的痰液分析

摘要

本方案描述了一种将痰液高效解离为单细胞悬液的方法，以及在标准流式细胞术平台上对细胞亚群进行后续表征的技术。

摘要

痰液常用于研究肺部细胞成分及其他微环境特征，以评估肺部健康状况，传统上采用基于细胞学的方法进行分析。这种方法的应用受到限制，因为读片过程耗时较长，且需要高度专业化的人员。此外，样本中常含有大量碎片以及过多的鳞状上皮细胞（SECs）或口腔颊细胞，导致许多样本不适合用于诊断。相比之下，流式细胞术能够高通量地对细胞群体进行表型分析，同时有效排除碎片和鳞状上皮细胞。

本文介绍了一种高效的方法，用于将痰液解离为单细胞悬液，对细胞群体进行抗体染色和固定，并在流式细胞术平台上获取样本。文中提供了一种设门策略，用于排除碎片、死细胞（包括唾液上皮细胞，SECs）以及细胞双联体。此外，本研究还解释了如何基于分化簇（CD）45阳性与阴性细胞群，对存活的单个痰液细胞进行分析，以鉴定造血系和上皮系细胞亚群。通过鉴定肺特异性巨噬细胞作为样本来源于肺部而非唾液的证据，本文还提供了质量控制的评估方法。最后，本文通过在同一患者样本上使用三种不同的流式细胞仪——Navios EX、LSR II 和 Lyric——获得的痰液分析图谱，证明该方法可适用于多种细胞计量平台。此外，该方案还可根据需要进行修改，以纳入其他感兴趣的细胞标志物。本文所提出的在流式细胞术平台上分析完整痰液样本的方法，使痰液样本更适用于开发肺部疾病的高通量诊断技术。

引言

流式细胞仪在硬件和软件方面的技术进步使得同时鉴定多种不同细胞群体成为可能^1,2,3,4。例如，在造血细胞研究中应用流式细胞仪，极大地促进了人们对免疫系统²以及造血系统细胞层级结构⁵的理解，并有助于多种不同类型血液肿瘤的诊断鉴别^6,7,8。尽管大多数痰液细胞来源于造血系统^9,10,11，但流式细胞术尚未被广泛应用于痰液分析以实现诊断目的。然而，已有若干研究表明，对痰液中免疫细胞群体（最主要的细胞亚群）进行评估，可能在哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病的诊断和/或监测中具有重要价值^12,13

方案

痰液处理的所有步骤均须在生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

1. 开始痰液解离前的试剂准备

1. 将1%多聚甲醛（PFA）按每份样品25 mL在冰上解冻，并保持低温直至使用。
   注意：PFA经吸入或皮肤接触具有毒性。请按照制造商说明配制固定液，并分装为25 mL后于-20 °C保存，直至使用。
2. 估算样品重量，并解冻足量的0.1%二硫苏糖醇（DTT）用于步骤2.2，将其升温至37 °C。（DTT分装液应在使用前于-20 °C保存。）
3. 将足量的0.5% N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）升温至37 °C，用于步骤2.2。（NAC应每周新鲜配制，并在使用前于4 °C保存。）

2. 痰液解离

1. 称取痰液样本的重量，以确定解离试剂的体积。
   注意：若初始重量 ≤3 g，则视为小样本；若 >3 g 但 ≤8 g，则视为中等样本；若 >8 g 但 ≤16 g，则视为大样本；若样本重量 >16 g，则视为超大样本。在整个实验方案中，将使用“小”、“中等”、“大”和“超大”来指代样本大小。解离和标记所需的试剂量根据痰液样本的大小而有所不同。
2. 将小样本转移至洁净的 50 mL 圆锥形管中，中等样本转移至洁净的 250 mL 塑料一次性瓶中，大或超大样本转移至洁净的 500 ....

结果

本方案的开发以临床实验室环境为背景，重点考虑了操作的简便性、高效性和可重复性。在方案开发过程中发现，痰液样本处理中最耗时的步骤是细胞计数。因此，本方案的设计使得痰液处理和细胞标记可以独立于细胞计数步骤进行，从而避免时间浪费。准确的细胞计数对于将样本稀释至适合无阻滞运行的浓度仍然必要，该计数可在抗体标记孵育期间完成，从而实现时间的高效利用。

本方案采用痰液重量作为指标，而非细胞计数，以确定用于最佳细胞标记的抗体/染料用量。然而，痰液样本的重量存在较大差异；在分析的126个样本中，重量范围从0.57 g到38.30 g。图1A显示，痰液重量与细胞得率之间的相关性较弱。因此，将样本分为四类；小样本、中等样本、大样本和超大样本的中位重量分别为2.1 g、5.0 g、11.2 g和22.0 g（图1B）。然而，仍有一些样本的细胞得率远高于其重量所预期的结果（图1C），但大多数样本的分布较为集中。小样本的中位细胞得率.......

讨论

痰液的细胞成分包含多种多样的细胞，通常伴有大量碎片³⁷。此外，痰液分析需要进行质量控制，以确认样本来源于肺部而非口腔³⁸。因此，与血液等样本相比，痰液的流式细胞术分析并不简单，因为血液能够释放出更纯净且均一的细胞悬液。本方案已解决上述所有问题：通过使用特定尺寸的微球设定仪器参数，确保能够检测到最小和最大的细胞群体；采用设门策略去除碎片、细胞团块、污染的上皮细胞（SECs）及其他死细胞；最后，通过质量控制措施确保痰液样本来源于肺部，而非主要为唾液。

在处理痰液样本的实验方案中，有几个关键步骤值得特别指出。首先，在痰液解离步骤的第2.5步中，所使用的尼龙细胞筛数量会显著影响细胞得率。可能需要使用多个细胞筛，以避免因筛孔堵塞而导致大量细胞丢失。当液体通过细胞筛的速度明显减慢时，应更换新的细胞筛。其次，痰液样本的细胞沉淀通常非常疏松，尤其是当样本中含有大量鳞状上皮细胞（SECs）污染时。因此，在离心后去除上清液时，务必避免将移液头过于靠近沉淀，否则可能导致细胞丢失，甚至完全丢失整个沉淀。第三，本.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 多聚甲醛流式固定液	Polysciences	25037
100 µM 尼龙细胞滤网，Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M 氢氧化钠	EMD	SX0593-1
50 mL 圆锥形 Falcon 管	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 抗人 CD19 抗体	BioLegend	302219
Alexa488 抗人 CD3 抗体	BioLegend	300415
Alexa488 抗人细胞角蛋白抗体	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK、CD3 和 CD19 同型对照	BioLegend	400129
BV510 抗人 CD45 抗体	BioLegend	304036
CD66b FITC 同型对照	BD Biosciences	555748
CompBead Plus 补偿微珠	BD Biosciences	560497
Corning 聚苯乙烯一次性无菌瓶，250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning 聚苯乙烯一次性无菌瓶，500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T 微珠	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC 抗人 CD66b 抗体	GeneTex	GTX75907
可固定的活力染料	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST 微珠，05 μM	Polysciences	64080
NIST 微珠，20 μM	Polysciences	64160
NIST 微珠，30 μM	Polysciences	64170
PE 抗人 CD45 抗体	BioLegend	304039
PE-CF594 抗人 EpCAM 抗体	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM 同型对照	BD Biosciences	562292
PE-CR594 抗人 CD206 抗体	BD Biosciences	564063
柠檬酸钠二水合物	EMD	SX0445-1
台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15250061