通过BiFC-FRET-FLIM检测法测定MADS-box转录因子两个单体与钙感受蛋白之间的三元相互作用

摘要

本文介绍一种利用荧光标记蛋白结合基于BiFC的FRET-FLIM检测技术，可视化三种蛋白质伙伴之间三元复合物形成的方法。该方法对于研究蛋白质-蛋白质相互作用复合物具有重要价值。 体内.

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用是细胞中所有生物过程的重要组成部分，因其在调控、维持和修复细胞功能方面发挥着关键作用。这些相互作用参与多种生物学现象，包括信号转导、病原体响应、细胞间相互作用以及代谢和发育过程。对于转录因子而言，此类相互作用可能导致亚基的寡聚化，或在特定亚细胞环境（如细胞核、细胞质等）中的隔离，进而对下游基因的表达产生更深远的影响。本文展示了一种用于可视化 体内 基于双分子荧光互补（BiFC）的荧光共振能量转移（FRET）结合荧光寿命成像（FLIM）的三元相互作用分析。本演示中选取的两种蛋白质作为BiFC配对伙伴相互作用，其重构的荧光信号用于检测与第三种蛋白之间的FRET-FLIM。实验采用生长室培养4至5周龄的植株 Nicotiana benthamiana 植物被用作本演示的模式植物系统。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）通过调控多种代谢和发育过程，构成了真核细胞正常功能的基础。某些PPI是稳定的，而另一些则具有瞬时性。根据相互作用中成员的数量和类型，可将这些相互作用分为二聚体、三聚体、四聚体同源多聚体以及异源多聚体¹。对蛋白质相互作用的鉴定与表征有助于更深入地理解蛋白质功能及其调控网络。

转录因子是一类参与调控功能的蛋白质，通过与DNA结合来调节其下游基因的转录速率。有时，蛋白质的寡聚化或形成高级复合物是其发挥功能的前提条件²。植物MADS-box转录因子属于同源异型基因，可调控多种生物学过程，包括花转变、花器官发育、受精、种子发育、衰老以及营养生长。已知这些转录因子能够形成高级复合物并与DNA结合^3,4。研究转录因子及其相互作用蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，有助于揭示转录调控背后的复杂机制。

瞬时蛋白表达在 Nicotiana benthamiana 已成为研究蛋白质定位或蛋白质-蛋白质相互作用的常用方法 在体⁵双分子荧光互补（BiFC）和荧光共振能量转移（FRET）是研究蛋白质-蛋白质相互作....

方案

1. 基因在入门载体和目的载体中的克隆（图2）

1. 通过 PCR 扩增目的基因（本研究中为 M 和 C 基因）的编码序列（CDS），并将其克隆至合适的入门载体中（例如 pENTR/D-TOPO 载体）； 见 表1 用于本实验的载体）。
2. 在含有抗生素的平板上培养克隆。通过限制性酶切和DNA测序验证经抗生素筛选的克隆^22,23.
3. 将重组的CDS从入门克隆转移至目的载体（pSPYNE-35S、pSPYCE-35S、pSITE-1CA和pSITE-3CA），并通过限制性酶切验证序列从入门载体向目的载体的正确转移。
   注意：本实验中使用的所有载体均列于 表1.
4. 最后，转化 农杆菌 GV3101 (pMP90 (Gent^R)) 细胞与目的载体通过电穿孔进行转化（图3)²⁴.

2. Nicotian....

结果

本方案提供了一种优化的方法，用于研究植物体内三元蛋白质-蛋白质相互作用。in vivo 实验的基本原理是结合两种荧光标记的蛋白质相互作用技术，即双分子荧光互补（BiFC）和荧光共振能量转移（FRET），以建立检测三个蛋白质组分之间形成三元复合物的分析方法。在此，我们采用荧光寿命成像显微技术（FLIM）来测量在有或无FRET受体存在时FRET供体组分的荧光寿命。若两个蛋白质之间存在正向相互作用，则预期供体的荧光寿命会降低。我们首先测量了供体（即C-CFP蛋白）的荧光寿命。实验中采用了“全光子计数”测量模式，该模式利用感兴趣区域（ROI）内的所有光子生成荧光衰减曲线，所得寿命值的误差小于传统的符合单光子计数法。高速FLIM滤光片可确保脉冲之间仅使用单光子事件。随后选择合适的数学模型，对衰减曲线进行逐像素计算与拟合²⁷。

此处使用的 CFP 变体（也是最常用的变体）具有构象适应性，会导致两种荧光寿命。因此，我们选择采用多指数供体模型来拟合荧光衰减曲线。该方法可将 CFP 的两种寿命分离开，在本实验中测得的两种寿命分别为 1.......

讨论

本实验方案展示了如何利用基于双分子荧光互补（BiFC）的荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）检测方法，来确定MADS-box蛋白的两个单体与一种钙感应蛋白之间三元复合物的形成。该方案改编自Y. John Shyu等人发表的研究，他们曾开发了一种基于BiFC的FRET方法，通过敏化发射法可视化Fos-Jun异源二聚体与NFAT或p65之间形成的三元复合物⁷。此前，Galperin及其同事于2004年开发了一种三荧光团FRET系统²⁹，但该系统需要六种滤光片，依赖复杂的显微镜装置。此外，在图像采集过程中细胞器（如内体）的快速运动也带来了实验上的困难。相比之下，基于BiFC的FRET-FLIM仅需两种荧光团的滤光片，显微镜配置更为简化。该系统可直接可视化三元复合物，而三荧光团FRET系统则无法实现这一点。与BiFC-FRET系统相比，该方法在定量性和稳健性方面更具优势，优于依赖敏化发射的FRET测量⁷。在本检测中，通过测量单个光子的荧光寿命来计算FRET效率，而非依赖供体与受体分子相对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 无针注射器	Dispovan	-
乙酰丁香酮	Sigma-Aldrich	D134406
Gateway  LR Clonase II 酶混合物	Thermo Fischer Scientific	11791020	本研究中使用的载体基于 Gateway 系统
硫酸庆大霉素	Himedia	CMS461
硫酸卡那霉素	Himedia	MB105
MES 水合物	Sigma-Aldrich	M2933
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒	Thermo Fischer Scientific	K240020	本研究中使用的载体基于 Gateway 系统
Phusion 高保真 Taq DNA 聚合酶	Thermo Fischer Scientific	F530-S	任何高保真聚合酶均可使用
利福平	Himedia	CMS1889
SP8 FALCON 共聚焦激光扫描显微镜	Leica	SP8 FALCON	任何具备荧光寿命成像（FLIM）功能的共聚焦激光扫描显微镜均可用于此分析
盐酸双氢链霉素五水合物	Himedia	TC034