Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit. Reperfusie veroorzaakt extra letsel buiten ischemie. Endotheelcellen (EC's) kunnen cardiomyocyten (CM's) beschermen tegen reperfusieschade door cel-celinteracties. Coculturen kunnen helpen bij het onderzoeken van de rol van cel-cel interacties. Een gemengde co-kweek is de eenvoudigste benadering, maar is beperkt omdat geïsoleerde behandelingen en downstream-analyses van enkele celtypen niet haalbaar zijn. Om te onderzoeken of EC's dosisafhankelijk CM-celschade kunnen dempen en of deze bescherming verder kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren, gebruikten we muis primaire coronaire endotheelcellen en volwassen muis cardiomyocyten om drie soorten celkweekinzetstukken te testen die varieerden in hun intercellelijke laagafstand bij 0,5, Respectievelijk 1,0 en 2,0 mm. In CMs-only nam cellulair letsel zoals beoordeeld door lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte significant toe tijdens hypoxie en verder na reoxygenatie wanneer de afstand 2,0 mm was in vergelijking met 0,5 en 1,0 mm. Wanneer EC's en CM's bijna direct contact hadden (0,5 mm), was er slechts een lichte demping van de reoxygenatieschade van CM's na hypoxie. Deze demping werd aanzienlijk verhoogd wanneer de ruimtelijke afstand 1,0 mm was. Met een afstand van 2,0 mm verzwakten EC's CM-letsel tijdens zowel hypoxie als hypoxie / reoxygenatie, wat aangeeft dat voldoende cultuurafstand nodig is voor EC's om te kruisverwijzingen met CM's, zodat uitgescheiden signaalmoleculen kunnen circuleren en beschermende paden volledig kunnen stimuleren. Onze bevindingen suggereren voor het eerst dat het optimaliseren van de EC / CM co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van EC's in CM-bescherming tegen gesimuleerde ischemie / reperfusieletsel. Het doel van dit rapport is om onderzoekers een stapsgewijze aanpak te bieden om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.
Inleiding
Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit 1,2. Het behandelingsproces van reperfusie kan echter zelf de dood van cardiomyocyten veroorzaken, bekend als myocardiale ischemie / reperfusie (IR) -letsel, waarvoor er nog steeds geen effectieve remedie is3. Er is gesuggereerd dat endotheelcellen (EC's) cardiomyocyten (CMs) beschermen door de secretie van paracriene signalen, evenals cel-tot-cel interacties4.
Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van autocriene en /of paracr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Experimentele voorbereiding/beplating
- Onderhoud CM's en EC's volgens de instructies van de fabrikant.
- Ontdooi beide cellijnen wanneer ze van leveranciers komen. Plaat in T25-kolven na het wassen met verse media. Het wordt aanbevolen om elk celkweekmedium te kopen bij dezelfde leveranciers waar de cellen zijn gekocht. Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent.
- Houd de celkweekincubator op 37 °C met 21% O2, 5% CO2, 74% N2 en bevochtigd.
OPMERKING: De primaire coronaire endotheelcellen van de muis die in dit protocol worden gebruikt, worden geïsoleerd uit ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alle drie de soorten inserts (A, B, C) die in dit experiment worden gebruikt, hebben dezelfde poriegrootte van 0,4 μm. Het enige verschil tussen hen is de insert-to-base hoogte, waardoor afstanden tussen de twee samengekweekte cellagen respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm kunnen zijn (figuur 3) en dat ze van verschillende leveranciers zijn (zie tabel met materialen voor details).
Om een in vitro co-kweekmodel op te zetten met afzonderlijke .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen in het protocol
Celco-cultuurmodellen zijn gebruikt om cellulaire mechanismen van cardioprotectie te bestuderen. Het creëren van twee afzonderlijke lagen met een betekenisvolle afstand ertussen is dus cruciaal voor de ontwikkeling van een geschikt co-cultuurmodel. Een uitdaging bij het bestuderen van gesimuleerde IR, d.w.z. HR, letsel is dat niet alleen ischemie (hypoxie) zelf, maar ook reperfusie (reoxygenatie) cellulaire disfunctie verergert. Daarom moet een realistisch model deze k.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) en door institutionele fondsen aan M.L.R.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Geïsoleerd uit hartweefsel van volwassen C57BL/6J muis |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Celtelling voor het berekenen van celaantal |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Steriele kap voor celcultuur |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Gebruikt voor celvrieswerk voor lange termijn celopslag |
| Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | Om normale leefomstandigheden voor cellen te bieden (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, bevochtigd) |
| Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas voor celcultuur incubator |
| Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Gebruikt voor EC-CM co-cultuur |
| Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Gebruikt voor EC-CM co-cultuur |
| Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Gebruikt voor EC-CM co-cultuur |
| Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | Voor celcultuur plateren en passeren |
| CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Gebruikt voor reguliere CMs-cultuur, gecoat door fabrikant |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | Volledige CMs-cultuurmedium |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs-cultuurmedium zonder fenol rood gebruikt tijdens LDH-meting |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Gebruikt voor experimenten van LDH-meting, gecoat door fabrikant |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs-celcultuur onder hypoxische omstandigheden (glucose- en serumvrij) |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Tellende slides gebruikt voor celteller |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH-meetkit |
| ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Gebruikt voor reguliere ECs-cultuur |
| ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | Volledige ECs-cultuurmedium |
| ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs-cultuurmedium zonder fenol rood gebruikt tijdens LDH-meting |
| ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Gebruikt voor experimenten van LDH-meting |
| ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Gebruikt voor het coaten van flesschen en platen voor ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs-celcultuur onder hypoxische omstandigheden (glucose- en serumvrij) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-goedgekeurd voor celcultuur en onderhoud |
| Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | Om een hypoxische omgeving met 0,01%O2 te creëren |
| Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | Om te verbinden met hypoxische gastank voor een consistente gasstroomsnelheid |
| Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Gebruikt om hypoxisch medium en kamer te spoelen (0,01%O2/5%CO2/94,99N2) |
| Microscope | Nikon | TMS | Om celconditie waar te nemen |
| Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Geïsoleerd uit coronaire slagader van C57BL/6 muizen |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | Voor celcultuur proces, experimenten, oplossingsvoorbereiding etc. |
| NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | Voor celcultuur proces, experimenten, oplossingsvoorbereiding etc. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Gebruikt voor celwassen tijdens cultuur of experimenten |
| Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetrische of fluorometrische platenlezing |
| Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Gebruikt voor LDH-meting platenlezing |
| Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterieel gefilterd en getest voor weefselcultuur |
| Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0,25%, getest voor celcultuur |
Referenties
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
