Summary
Denna proctocol syftar till att tillhandahålla en metod för in vitro och in vivo mitokondriell Ca2 + imaging i astrocyter och nervceller.
Abstract
Mitokondriell Ca2+ spelar en avgörande roll för att kontrollera cytosolisk Ca2 + buffring, energimetabolism och cellulär signaltransduktion. Överbelastning av mitokondriell Ca2+ bidrar till olika patologiska tillstånd, inklusive neurodegeneration och apoptotisk celldöd vid neurologiska sjukdomar. Här presenterar vi en celltypspecifik och mitokondrier inriktad på molekylär metod för mitokondriell Ca2 + avbildning i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Vi konstruerade DNA-plasmider som kodar mitokondrier-inriktning genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) GCaMP5G eller GCaMP6s (GCaMP5G/6s) med astrocyt- och neuronspecifika promotorer gfaABC1D och CaMKII och mitokondrier-målsekvens (mito-). För in vitro mitokondriell Ca2 + imaging, var plasmiderna transfected i odlade astrocyter och nervceller att uttrycka GCaMP5G/6s. För in vivo mitokondriell Ca2 + imaging, adeno-associerade viral vektorer (AAV) förbereddes och injiceras i mushjärnorna att uttrycka GCaMP5G/6s i mitokondrier i astrocyter och nervceller. Vårt tillvägagångssätt ger ett användbart sätt att avbilda mitokondriell Ca2 + dynamik i astrocyter och nervceller för att studera förhållandet mellan cytosolic och mitokondriell Ca2 + signalering, liksom astrocyt-neuron interaktioner.
Introduction
Mitokondrier är dynamiska subcellulära organeller och anses vara cellkraftverk för energiproduktion. Å andra sidan kan mitokondrier ta upp Ca2+ till matrisen som svar på lokala eller cytosoliska Ca2 + ökningar. Mitokondriell Ca2+ upptag påverkar mitokondriell funktion, inklusive metaboliska processer såsom reaktioner i trikarboxylsyra (TCA) cykeln och oxidativ fosforylering, och reglerar Ca2+känsliga proteiner under fysiologiska förhållanden1,2,3,4. Mitokondriell Ca2 + överbelastning är också en avgörande faktor för celldöd, inklusive nekros och apoptos i olika hjärnsjukdomar5,6,7. Det orsakar öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergång pores (mPTPs) och frisättningen av caspase cofactor, som initierar apoptotic cell död. Därför är det viktigt att studera mitokondriell Ca2 + dynamik och hantering i levande celler för att bättre förstå cellulär fysiologi och patologi.
Mitokondrier upprätthåller matris ca2+ homeostas genom en balans mellan Ca2+ upptag och efflux. Mitokondriell Ca2+ upptaget förmedlas huvudsakligen av mitokondriella Ca2+ uniporters (MCUs), medan mitokondriell Ca2 + efflux förmedlas av Na+-Ca2 +-Li+ växlare (NCLXs) och H+/ Ca2 + växlare (mHCXs)8. Balansen kan störas genom stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCRs)9. Mitokondriell Ca2 + homeostas påverkas också av mitokondriell buffring genom bildandet av olösliga xCa2+-xPO4x-xOH-komplex8.
Intracellulära och mitokondriella förändringar i Ca2+ koncentration ([Ca2+]) kan utvärderas med fluorescerande eller självlysande Ca2+ indikatorer. Ca2+ bindning till indikatorer orsakar spektraländringar, vilket gör det möjligt att registrera gratis cellulära [Ca2 +] i realtid i levande celler. Två typer av sonder finns för närvarande tillgängliga för att övervaka Ca2+ förändringar i celler: organiska kemiska indikatorer och genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs). I allmänhet finns olika varianter med olika Ca2 + affiniteter (baserat på Kd), spektralegenskaper (excitation och emissionsvåglängder), dynamiska intervall och känsligheter tillgängliga för de biologiska frågor som undersöks. Även om många syntetiska organiska Ca2 + indikatorer har använts för cytosolisk Ca2 + imaging, kan endast ett fåtal selektivt laddas i mitokondriell matris för mitokondriell Ca2 + imaging, med Rhod-2 är den mest använda (för recensioner se10,11). Rhod-2 har dock en stor nackdel med läckage under långa tidsvägsexperiment; Dessutom är det delat mellan mitokondrier, andra organeller och cytosol, vilket gör absoluta mätningar i olika underparter svåra. Genom att använda celltypsspecifika promotorer och subcellulära fackinriktningssekvenser kan GECIs uttryckas i olika celltyper och subcellulära fack för cell- och fackspecifika Ca2+ imaging in vitro eller in vivo. Envågiga fluorescensintensitetsbaserade GCaMP Ca2+-indikatorer har nyligen dykt upp som stora GECIs12,13,14,15,16. I den här artikeln tillhandahåller vi ett protokoll för mitokondrier-inriktning och celltyp specifika uttryck för GCaMP5G och GCaMP6s (GCaMP5G/6s) i astrocyter och nervceller, och imaging mitokondriell Ca2 + upptag i dessa celltyper. Med hjälp av detta protokoll kan uttrycket av GCaMP6G/6s i enskilda mitokondrier avslöjas, och Ca2 + upptag i en enda mitokondriell upplösning kan uppnås i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Missouri-Columbia.
1. Konstruktion av DNA-plasmider
OBS: För in vitro- och in vivo-avbildning konstrueras DNA-plasmider som kodar GCaMP5G/6s med astrocyt- och neuronspecifika promotorer och mitokondriella målsekvenser.
- Sätt in mitokondriell matris (MM)-målsekvens (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 i kloningsplatserna EcoRI och BamHI i ryggraden i adenoassocierat virusplasmid pZac2.1 för att erhålla plasmider som innehåller astrocytiska gfaABC1D-promotor eller neuronala CaMKII-promotor18,19,20.
- Subklon GCaMP5G/6s i kloningsplatserna BamH I och Not 1 i ovanstående plasmider för att erhålla nya plasmider pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s och pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s som riktar sig mot transgeneuttryck i mitokondrier i astrocyter och nervceller20,21 (figur 1).
- Förbered pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G och pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-plasmider för transfektion för in vitro-studie (avsnitt 2). Producera AAV-vektorer med serotyp 5 för astrocyter och serotyp 9 för nervceller för in vivo-studie 18 (avsnitt 3).
2. In vitro mitokondriell Ca2+ avbildning i astrocyter och nervceller
- Förbered primära astrocyter från cortex av P1 neonatal möss och primära nervceller från cortex av E15-16 embryon18,22,23,24, och odla dem på 12 mm diameter glas coverslips i 24-brunnsplattor med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS), och neuronal basal medium (NBM) som innehåller 2% B27, respektive.
- Transfekt mogna astrocyter och nervceller med pZac-gfaABC1D-GCaMP6s och pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmider med lipidbaserad transfekt reagens för att uttrycka GCaMP6s i mitokondrier av astrocyter och GCaMP5G i mitokondrierna av nervceller18,20,21. Transfektera celler i varje brunn med 0,5 μg DNA och ändra mediet 6 h senare.
OBS: Astrocyterna och nervcellerna är redo för avbildning 1-2 dagar efter transfection. - Utför in vitro mitokondriell Ca2+ imaging 1-2 dagar efter transfection.
- Överför de glasöverdrag som odlas med astrocyter eller nervceller till PH-1 perfusionskammaren under en epifluorescens eller två fotonmikroskop.
- Stimulera astrocytisk mitokondriell Ca2+ upptag med 100 μM ATP i ACSF, eller stimulera neuronala mitokondrier med 100 μM glutamat/10 μM glycin20,25 (figur 2 och figur 3).
OBS: Lösningsändringar från ACSF till ATP- och glutamat/glycininnehållande ACSF styrs av ett ALA-VM8 perfusionssystem21. Hastigheten på lösningsbytet styrs vid 1-2 ml/min genom att justera en ventil.
3. In vivo mitokondriell Ca2+ avbildning i astrocyter och nervceller
- AAV förberedelser.
- Förbered följande rekombinanta adenoassocierade virusvektorer (rAAV) med hjälp av DNA-plasmiderna som framställs i avsnitt 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G och rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer.
OBS: I detta experiment var rAAV vektorer av serotyp 5 beredda att uttrycka GCaMP5G i mitokondrier i astrocyter och rAAV vektorer av serotyp 9 var beredda att uttrycka GCaMP6s i mitokondrier i nervceller.
- Förbered följande rekombinanta adenoassocierade virusvektorer (rAAV) med hjälp av DNA-plasmiderna som framställs i avsnitt 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G och rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer.
- Stereotaxisk AAV-injektion.
- Bedöva musen med 3% isofluran.
OBS: Senare under operationen reduceras isoflurannivåerna till 2%. - När musen når en kirurgisk nivå av anestesi, som bestäms av svans och tå nypa, raka håret över operationsplatsen, motorn eller somatosensory cortex, med en hårtrimmer.
- Placera musen på musens stereotaxiska enhet och fixera huvudet med öronstänger. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att skydda dem under operationen. Använd en värmedyna för att hålla musens kroppstemperatur vid 37 °C under hela operationen.
OBS: Utför kirurgi med aseptiska ingrepp. Alla kirurgiska verktyg måste steriliseras antingen genom autoklavering eller en varmpärlasteriliserare. - När musen är monterad på stereotaxic enheten, sterilisera hårbotten med alternerande jodbaserad skrubb och 70% etanol tre gånger. Gör ett snitt i mitten av hårbotten för att exponera injektionsstället.
- Skär upp huden i bregma-lamdaaxeln och skapa ett burrhål med diametern ~1 mm med en höghastighetsborr på motorns eller somatosensoriska cortex avsedda injektionsplats.
- Använd en 33 G Hamilton spruta som innehåller adeno-associerade virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G vektorer [1 x 1011 GC] eller rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektorer [1 x 1011 GC]) för att injicera upp till 1 μL virus vid målområdet.
OBS: Till exempel, för när viral leverans, injicera viruslösningen på två djup i flera steg. Sätt först in nålen till ett djup av 1 mm från duran och låt 5 min för hjärnan återhämta sig. Flytta sedan nålen upp till ~700 μm djup och injicera 500 nL av viruslösningen med en injektionshastighet på 10 nL/s med hjälp av en hamiltonspruta som styrs av en mikrosyringpumpstyrenhet. När injektionen är klar, vänta i 5 minuter för att låta viruset sprida sig in i hjärnan. Flytta sedan nålen upp till den andra injektionsplatsen på ett djup av 300 μm. Här injicerar du ytterligare 500 nL av viruslösningen. Vänta i 10 minuter för att låta viruset spridas in i hjärnan. - Stäng hårbotten och huden med ett vävnadslim. Låt mössen återhämta sig på värmeplattan. Skicka möss tillbaka till djuranläggningen efter återhämtning.
- Bedöva musen med 3% isofluran.
- Hjärnskålen-fönster intstallation och in vivo två-foton (2-P) imaging av mitokondriell Ca2 + signaler.
OBS: Kranial fönsterimplantation görs 3 veckor efter AAV-injektion över motorn eller somatosensorisk cortex26,27,28,29. Carprofen (10 mg/kg) injiceras subkutant för att ge lindring från potentiell smärta före operationen. Hjärnskålen fönster kirurgiska ingrepp är identiska med AAV injektion kirurgiska ingrepp och utförs under aseptiska villkor.- Bedöva musen med 3% isofluran.
OBS: Detta är den initiala dosen och minska till 2% för operationen senare. Under avbildning används en intraperitoneal (IP) injektion av 130 mg ketamin/10 mg xylazin/kg kroppsvikt upplöst i ACSF för anestesi. - Placera musen på musens stereotaxiska enhet och fixera huvudet med öronstänger. Applicera oftalmisk salva på ögonen. Använd en värmedyna för att hålla musens kroppstemperatur vid 37 °C under hela operationen.
OBS: Alla kirurgiska verktyg måste steriliseras. - Gör ett snitt på 5-8 mm långt i mitten av hårbotten och ta bort en hudklaff med en sax.
- När skallen har exponerats, utför 2,0-3,0 mm diameter craniotomy med en höghastighetsborr över det virusinsprutade området (dvs. motorbarken eller somatosensorisk cortex, figur 1B). Gör först fyra små hål och borra sedan längs i en cirkel som förbinder hålen. Lyft sedan och ta bort benet med vass sax och ta bort. Den exponerade duramatern kan tas bort eller hållas intakt för impantation av kranialfönstret.
- Placera ett glasöverdrag på 3-5 mm i diameter som bär ett genomskinligt silikon över kraniotomin. Använd en tandpetare för att försiktigt trycka kranialfönstret på hjärnans yta. Försegla sedan kanten med en liten mängd silikonlim.
ANMÄRKNINGAR: Alternativt, istället för silikonskiva, kan 1,2% låg smältpunkt agarose gel användas mellan täckglaset och hjärnvävnaden. - Slutligen försegla kanterna på täckslipet med dentalcement. Var noga med att applicera cementet något vid kanten av kranialfönstret för stark bindning. Fäst en specialtillverkad huvudplatta i metall på skallen med tandcement.
OBS: Metallplattan används för att fixera musens huvud till 2-P-mikroskopet under avbildningssessionen(figur 1C). - Tillsätt 0,5 ml ACSF-lösning över täcket på kranialfönstret för vattensänkning under avbildning.
- Utför tidsfördröjning in vivo 2-P avbildning av mito-GCaMP5G i astrocyter och mito-GCaMP6s i nervceller med 910 nm våglängd genom hjärnskålen fönstret (figur 1C)18,20,27.
OBS: Under avbildningen är möss på värmeplattan för att bibehålla fysiologisk temperatur. Mössen kommer att offras omedelbart efter att avbildningssessionen är klar. - Märk astrocyter in vivo med sulforhodamin 101 (SR101) när det är nödvändigt att bestämma colocalization.
- Applicera 100 μL av 100 μM SR101 i ACSF på kortikalytan i 100 μM SR101 i ACSF på kortikalytan i 1-5 minuter.
- Skölj ytan med ACSF för att tvätta bort den obundna SR101. Med hjälp av 2-P-avbildning kan sammärkning av mito-GCaMP5G och SR101 i astrocyter observeras 45-60 min senare(figur 4A).
- Bedöva musen med 3% isofluran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna studie var att tillhandahålla en metodik för att avbilda mitokondriella Ca2 + signaler med GECIs i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Resultaten av både in vitro och in vivo mitokondriell Ca2 + imaging presenteras här.
In vitro mitokondriell Ca2+ signalering i odlade astrocyter och nervceller
Mitokondriell Ca2+ upptag i astrocyter kan framkallas genom ATP-applikation, och mitokondriell Ca2 + upptag i nervceller kan framkallas av glutamat och glycinapplikation genom ett perfusionssystem. Figur 2 och figur 3 visar att GCaMP6s uttrycks i odlade astrocyter respektive GCaMP5G i nervceller. Mitokondriell Ca2+ upptag i astrocyter framkallades av 100 μM ATP med en enda mitokondriell upplösning(figur 2B-D). Mitokondriell Ca2+ upptag i nervceller framkallades av 100 μM glutamat och 10 μM glycin med en enda mitokondriell upplösning (figur 3B-D).
In vivo 2-P avbildning av mitokondriellt uttryck av GCaMP5G eller 6S i astrocyter och nervceller
Avbildningen görs genom att samla in tidsfördröjning in vivo 2-P avbildning av mitokondriella fluorescenssignaler i astrocyter och nervceller med ett Ultima 2-P mikroskopsystem. Vi använder excitation våglängd 880-910 nm. Figur 4 visar uttryck för GCaMP5G i mitokondrier i astrocyter i musbarken. Det astrocytspecifika uttrycket av GCaMP5G bekräftades genom colocalization av SR101 med GCaMP5G med en enda mitokondriell upplösning (figur 4A), och spontana Ca2 + förändringar i enskilda mitokondrier kan observeras (figur 4B-E). Figur 5A visar neuron-specifika uttryck av mito-GCaMP6s colocalized med neuronal markör NeuN. Fluorescensen av mito-GCaMP6s i nervceller visar mitokondriell morfologi i dendriter (figur 5B). Spontana mitokondriella Ca2+ ökningar av dendriter kan observeras (figur 5C-F).
Analys av mitokondriella Ca2+ signaler
Kvantifiera fluorescerande signaler genom att beräkna cellkroppens eller enskilda mitokondriers genomsnittliga pixelintensiteter i astrocyter och nervceller med hjälp av en bildanalysprogramvara. Ca2+ förändringar övertid (t) uttrycks som F/Fo (t) värden kontra tid, där Fo är bakgrunden subtraherad baslinjefluorescens och F är den ursprungliga subtraherade fluorescensförändringen20,21. Använd topp F/Fo-värdena för att jämföra amplituden för Ca2+-signaler.
Figur 1: DNA-konstruktioner för astrocyt- och neuronspecifika mitokondrier som riktar in sig på transgenuttryck och in vivo 2-P-avbildning. (A) DNA-konstruktioner av genetiskt kodade Ca2 + indikator GCaMP5G eller GcaMP6s i pZac2.1 plasmid med gfaABC1D (upp) och CaMKII (låg) promotorer för leverans till astrocytisk respektive neuronal mitokondriell matris. Mitokondrier-inriktning uppnås med hjälp av en mitokondriell matris (MM) specifik sekvens (mito) bifogas N-ändstationen av fluorescerande proteiner. ( B) En kraniotomi över en muss cortex. C) Musskalle är fäst vid en metallplatta som är ansluten till den stolpe som är fastsatt på scenen i 2-P-mikroskopet. Infälld visar kranialfönstret med en metallplatta fäst vid skallen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Mitokondriell Ca2+ avbildning av odlade astrocyter. (A-B) En 2-P-bild av en astrocyt som uttrycker mito-GCaMP6s (A) och dess svar på stimuleringen av 100 μM ATP vid den angivna tiden (B). (C) Bilder av mito-GCaMP6s i de fyra enskilda mitokondrier (i A, cirklar) vid de olika tidpunkterna efter ATP-stimulering. ( D) Tidskurerna för mito-GCaMP6s fluorescens ändras, plottade som ΔF/Fo, i de fyra enskilda mitokondrierna efter ATP-stimulering. Den röda pilen anger starttiden för avbildning. Pseudocolorskalan är en linjär representation av fluorescensintensiteten i denna och andra figurer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Mitokondriell Ca2+ avbildning av odlade nervceller. (A-B) En 2-P bild av mito-GCaMP5G uttrycker neuron (A) och dess svar på 100 μM glutamat och 10 μM glycin vid den angivna tiden (B). (C) Bilder av mito-GCaMP5G i de fyra enskilda mitokondrier (i A, cirklar) vid olika tidpunkter efter glutamatstimulering. (D) Tidskurserna för mito-GCaMP5G fluorescens förändras i de fyra enskilda mitokondrierna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: In vivo 2-P avbildning av mitokondriell Ca2+ signalering i astrocyter. (A) 2-P bilder av mito-GCaMP5G som uttrycker astrocyter colocalized med SR101. (B-C) 2-P bild av en astrocyt som uttrycker mito-GCaMP5G för analys av spontan Ca2 + ökning. (C-E) Bilder av mito-GCaMP5G i de fyra enskilda mitokondrier i astrocyten (i B, cirklar) vid olika tidpunkter (C) och tidsföretarna för mito-GCaMP5G fluorescensförändringar, plottade som ΔF/Fo, i de fyra enskilda mitokondrier (E). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: In vivo 2-P avbildning av mitokondriell Ca2+ signalering i nervceller. (A) Colocalization av GCaMP6s (övre) med neuronal markör NeuN (mitten) i hjärnan. (B) Högupplösta bilder av dendriter som uttrycker GCaMP6s med mitokondriell morfologi (indikeras av *s). c)GCaMP6s uttryckta i neuronala mitokondrier. (D-F) Analys av spontan mitokondriell Ca2 + ökning av nervceller. Pseudocolor 2-P bild av mito-GCaMP6s i C vid olika tidpunkter (D). Bilder av mito-GCaMP6s i de fyra enskilda mitokondrier i C (cirklar) vid de olika tiderna (E-F) och tidskurserna för mito-GCaMP6s fluorescens ändras, ritade som ΔF/Fo, i de fyra enskilda mitokondrier (F). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Film: Mitokondriell Ca2+ ökar baserat på GCaMP5G fluorescensförändringar som svar på 100 μM ATP i odlade astrocyter. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln tillhandahåller vi en metod och protokoll för avbildning mitokondriell Ca2 + signaler i astrocyter och nervceller. Vi implementerade mitokondrier-inriktning och celltypspecifika strategier för att uttrycka GECI GCaMP5G/6s. För att rikta in sig på GCaMP5G/6s i mitokondrier inkluderade vi en mitokondrier-målsekvens i plasmiderna. För att uttrycka GCaMP5G/6s i astrocyter och nervceller in vivo, satte vi in en astrocytspecifik promotor gfaABC1D och neuron-specifika promotorn CaMKII i plasmiderna. Celltyp specifika uttryck av GCaMP5G/6s i astrocyter och nervceller kan bekräftas genom SR101 märkning i astrocyter och immunstaining av nervceller med NeuN. Från våra data ger dessa strategier en tillförlitlig celltypspecifik metod för mitokondriell Ca2 + avbildning i astrocyter och nervceller in vivo.
Ett potentiellt problem för GECI-uttryck är att det kan orsaka Ca2 + buffring eftersom det kan minska gratis Ca2 + med Ca2 + bindning. Ett annat problem som kan uppmärksammas är mängden virus som injiceras. Enskilda celler som uttrycker GECI kan inte identifieras om ett överdrivet virus injiceras. Dessa problem kan effektivt lindras genom att minska Titer av AAV. Fotobleaching kan också vara ett problem. Teoretiskt sett är alla fluorescerande indikatorer föremål för fotobleaching. GCaMP5G/6s är ganska stabila, men de kommer att bleka under kontinuerlig exponering för excitationsljus. En allmän praxis för att undvika fotobleaching är att minska exponeringstiden för vävnad för laserljus samtidigt som tillräckligt med fluorescens samlas in. Detta kan uppnås om högkänslighets-PMT och mål för hög ljusöverföring används. Fotobleaching kan också minskas genom att stänga slutaren mellan bilderna.
I våra resultat av in vivo 2-P imaging, spontana mitokondriell ökningar kan observeras både i astrocyter och nervceller. Dessa mitokondriella Ca2+ transienter har långa varaktigheter (figur 4E och figur 5E), i överensstämmelse med en färsk rapport från Gobel et al.30. Den underliggande mekanismen för detta fenomen är inte tydlig men är värd att eftersträvas ytterligare. För cytosolisk Ca2+ ökning har astrocyter och nervceller olika mekanismer. G-proteinreceptorstimuleringar orsakar Ca2+ ökning av ER i astrocyter medan aktiveringar av spänning gated Ca2 + kanaler eller glutamatreceptorer orsakar cytosoliska Ca2 + ökning av nervceller, som kan tas upp av mitokondrier. I vår tidigare studie20fann vi att när mito-GCaMP5G var cotransfected med IP3 5-fosfatas (5ppase) odlade astrocyter, ATP-inducerad mitokondriell Ca2 + ökning kunde till stor del avskaffas. De två mutanterna av 5ppase, dvs. R343A och R343A/R350A 5ppase, som saknar enzymatisk aktivitet, påverkade dock inte mitokondriell Ca2 + ökning efter ATP stimulering. Dessa resultat visar att cytosolic och mitokondriell Ca2 + nivåer är mycket kopplade, sannolikt på grund av den intima fysiska kopplingen mellan ER och mitokondrier i astrocyter, med cytosolen fungerar som en mellanliggande kanal för Ca2 + leverans. Vi fann också att glutamat stimulering orsakade mitokondriell Ca2 + ökning av nervceller, vilket tyder glutamatreceptorer spelar en roll i Ca2 + inträde från extracellulärt utrymme. I framtiden kommer det att vara intressant att studera sensoriska mitokondriella Ca2 + ökningar av astrocyter och nervceller.
Vårt tillvägagångssätt kan användas för att samtidigt avbilda cytosulatiska och mitokondriella Ca2+ signaler i samma celltyp när två GECIs av olika fluorescensvåglängder uttrycks, t.ex. en röd florescence GECI RCaMP i cytoplasma och GCaMP i mitokondrier, eller vice versa31. Detta tillvägagångssätt kan också användas för in vivo-studien av astrocyte-neuron interaktioner i fysiologi och patologi med GCaMP uttryckt i astrocyter och RCaMP i nervceller, eller vice versa.
GCaMP är en GFP-baserad envågsfluofor GECI. För närvarande är GCaMPs de mest föredragna Ca2 + indikatorerna på grund av deras höga signal-till-brus-förhållande (SNR) och stora dynamiska intervall (DR). Nyligen rapporterades jGCaMP7-sensorer, den optimerade versionen av GCaMP6, med förbättrad känslighet för enskilda spikar16. GCaMP7-sensorer kan enkelt subklokas i våra plasmider för mitokondriell Ca2+ avbildning. Sammanfattningsvis kan de strategier vi presenterade här användas för att avbilda mitokondriell Ca2 + upptag och hantering i nervceller och astrocyter med tillräcklig känslighet för att lösa Ca2 + förändringar på en enda mitokondriell nivå in vivo. Detta protokoll representerar ett användbart sätt att studera cytosolic och mitokondriell Ca2 + signalering i astrocyter och nervceller, liksom astrocyt-neuron interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) bidrag R01NS069726 och R01NS094539 till SD. Vi tackar Erica DeMers för ljudinspelningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
