Summary
우리는 제브라피시를 모델로 사용하여 척추 운동 뉴런의 빛에 의한 TAR DNA 결합 단백질(43)의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
비정상적인 단백질 집계 및 선택적 뉴런 취약성은 신경 퇴행성 질환의 두 가지 주요 특징입니다. 이러한 특징 들 사이의 인과 관계는 취약한 세포 유형에서 질병 관련 단백질의 위상 전이를 제어함으로써 심문 될 수 있지만, 이러한 실험적 접근방식은 지금까지 제한되었습니다. 여기서, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에서 퇴행성 모터 뉴런에서 발생하는 TDP-43의 세포질 응집 모델링을 위한 제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에서 RNA/DNA 결합 단백질 TDP-43의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 선택적으로 광유전학 TDP-43 변종을 전달하는 세균성 인공 염색체 (BAC)기지를 둔 유전 방법을 기술합니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 억제되지 않은 물고기에 대한 발광 다이오드(LED)를 사용하여 간단한 외부 조명에 의해 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 위상 전환을 허용합니다. 우리는 또한 광 조명에 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어와 함께 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징의 기본 워크플로우를 제시한다. 이 프로토콜은 ALS 취약 세포 환경에서 TDP-43 위상 전환 및 집계 형성의 특성화를 가능하게 하며, 이는 세포 및 행동 결과에 대한 조사를 용이하게 해야 합니다.
Introduction
리보뉴클레오단백질(RNP) 과립은 균질유체가 2개의 뚜렷한 액체 상1,2로 분해되는 현상인 액체 액체 상 분리(LLPS)를 통해 멤브레인 이없는 분할을 조립하여 핵 및 세포질에서 무수한 세포 활동을 제어합니다. RNP 과립 성분으로 일반적으로 작동하는 RNA 결합 단백질의 소화 불량 LLPS는 단백질 응집으로 이끌어 내는 이상한 상 전이를 촉진합니다. 이 과정은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 연루되었습니다3,4,5. RNA 결합 단백질과 질병 병인의 비정상적인 LLPS 사이의 인과 관계의 정확한 평가는 LLPS가 효과적인 치료 대상으로 악용 될 수있는 여부와 방법을 결정하기위해 중요합니다. RNA 결합 단백질의 LLPS는 시험관 내 및 단세포 모형에서 공부하기 쉽지만 다세포 유기체, 특히 척추동물에서는 어렵습니다. 조직 환경 내의 개별 세포에서 이러한 LLPS를 분석하기 위한 중요한 요구 사항은 질병에 취약한 세포 유형의 LLPS의 이미징 및 조작을 위한 프로브를 안정적으로 표현하는 것입니다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 뇌와 척수의 운동 뉴런이 변성으로 인해 선택적으로 점진적으로 손실되는 궁극적으로 치명적인 신경 장애입니다. 현재까지 25개 이상의 유전자에 있는 돌연변이는 총 ALS 케이스의 5%-10%를 차지하는 유전성(또는 가족적인) 형태의 ALS와 연관되어 있으며, 이들 ALS 유발 유전자 중 일부는 hnRNPA1, TDP-43 및 FUS6,7과 같은 RNP로 구성된 RNA 결합 단백질을 인코딩합니다. 더욱이, 총 ALS 케이스의 90%-95%를 차지하는 ALS의 산발적인 양식은 퇴행성 운동 뉴런에 증착된 TDP-43의 세포질 집계를 특징으로 합니다. 이러한 ALS 관련 RNA 결합 단백질의 주요 특징은 본질적으로 무질서한 영역(IDRs) 또는 주문된 3차원 구조가 부족한 저복잡성 영역이며 LLPS7,8을 구동하는 많은 다른 단백질과 약한 단백질 단백질 상호 작용을 중재합니다. ALS 일으키는 돌연변이가 IDRs에서 수시로 생기는 다는 사실은 이 ALS 관련 단백질의 비정상적인 LLPS 및 위상 전이가 ALS 병인9,10의 기초가 될 수 있다는 생각으로 이끌어 냈습니다.
최근에는 광에 의한 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있는 Cryptochrome 2기반 광유전학기인 OptoDroplet 방법이 IDRs11을 이용한 단백질의 위상 전이를 유도하기 위해 개발되었다. 이 기술은 TDP-43로 성공적으로 확장되었기 때문에 TDP-43의 병리학적 위상 전환과 그 관련 세포 독성12,13,14,15의 기전을 밝히기 시작했습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 ALS 취약 세포 모형, 즉, mnr2b/mnx2b 유전자를 위한 BAC를 사용하여 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 광유전학 TDP-43을 전달하는 유전 적 방법을 간략하게 설명합니다16,17. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 척추 운동 뉴런의 위상 전환을 유발하는 광유전학 TDP-43의 간단하고 비침습적인 빛 자극을 허용합니다. 우리는 또한 광 자극에 대한 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어를 사용하여 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징을위한 기본 워크플로우를 제시합니다. 이러한 방법은 ALS 취약 한 세포 환경에서 TDP-43 단계 전이의 조사를 허용 하 고 세포 및 행동 수준에서 그것의 병적인 결과 탐구 하는 데 도움이 되어야 한다.
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Protocol
모든 어류 작업은 국립보건원 동물복지실(NIH, NIH)의 동물복지실(보증번호 A5561-01)을 제출하는 국립유전학원(일본)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(일본 24-2)에 따라 진행되었습니다. 미국).
1. mnr2b 프로모터로부터 광유전학 TDP-43 유전자의 발현을 위한 BAC의 건설
- BAC 준비
- 제브라피쉬 mnr2b 궤적(CH211-172N16, BACPAC 유전체학)을 함유한 제브라피쉬 BAC 클론을 구입한다. 온난화 외 18에 기술된 바와 같이 CH211-172N16을 항구하는 DH10B 대장균(E. coli)의 5mL 하룻밤 LB 배양으로부터 BAC DNA를 정화한다.
- 온난화 외 18에 설명된 바와 같이, 전기화에 의해 CH211-172N16을 전기기화로 변환한다.
참고: 전기기화 당일 대장균 으로부터 BAC DNA의 정제는 일반적으로 BAC transform18의 높은 성공률을 제공합니다. 그렇지 않으면, 정제된 BAC DNA는 사용전까지 -20°C로 유지된다. - 아사카와 등에서 설명한 바와 같이, 전기포공에 의한 CH211-172N16의 중추에 Tol2-amp-amp 카세트를 도입한다.
- E의 글리세롤 스톡을 만드십시오. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 상동성 재조합-통합을 확인한 후 iTol2-amp 카세트 통합(CH211-172N16-iTol2A)을 탑재한 콜라 세포 클론(Ex Taq) 프라이머 쌍 Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') 및 pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') 및 다음과 같은 조건을 사용하여: 1분 동안 98°C에서 의 하부절 단계, 10초 동안 95°C에서 25사이클의 내성, 15s에 대해 55°C의 프라이머 어닐링, 프라이머 연장은 72°C에서 1분 동안 72°C, 354개의 베이스 쌍(bp)의 PCR 생성을 증폭시켰다.
- mnr2b-hs:opTDP-43h 건설
- N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig로 태그되는 인간 야생형 TDP-43/TARDBP (TDP-43h)에 대한 발현 카세트를 운반하는 플라스미드를 각각(이하 opTDP-43h)14에 구성한다.
참고: opTDP-43h 단편은 제브라피쉬 hsp70l 유전자 프로모터 서열(650bp) 및 폴리아데닐립(polyA) 신호 서열과 측면으로, 카나마이신 저항 유전자(hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14와 함께 한다. - hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 프롤러 hsp70l 및 칸을 음질하고 PCR(GXL DNA 폴리머라제)에 의한 mnr2b 유전자의 인니티에이터 코돈의 상류 및 하류의 45bp 서열을 함유하고 있습니다. b-hspGFF-Forward (5'tat cag cag caa ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AG CTT CCA GAA C-3') 및 Km-r (5'ggt tct tca gct aaa agg tcg tcg atcc atc cc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG AA-3') 다음과 같은 조건: 98°C에서 1 분 동안 의 내포화 단계, 10에 대한 95 °C에서 30 사이클, 55 °C에서 55 ° C, 프라이머 앤날링 15 ° C ~5.7 bp의 PCR 제품을 증폭.
- PCR 제품을 아가로즈 젤 전기포고(100 V)로 분리하고 HSp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA 대역을 DNA 컬럼으로 정화한다. 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1mM EDTA를 포함하는 트리스-EDTA 버퍼(TE)에서 정제된 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트의 농도를 50 ng/μL로 조정한다.
- hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 CH211-172N16-iTol2A로 온난화 외.18에 설명한 바와 같이 전기포이션에 의해 도입하고 LB agar 플레이트에서 암피실린 및 가나마이신 내성 변혁제를 선택한다. HSp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 운반하는 CH211-172N16-iTol2A는 mnr2b-hs:opTDP-43h로 지정됩니다.
- bac 정화 키트를 사용하여 mnr2b-hs:opTDP-43h를 정화하고 페놀/클로로폼 추출 후 TE에서 250 ng/μL에서 용해합니다.
- N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig로 태그되는 인간 야생형 TDP-43/TARDBP (TDP-43h)에 대한 발현 카세트를 운반하는 플라스미드를 각각(이하 opTDP-43h)14에 구성한다.
- mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z 건설
- opTDP 대신 N-종산 (EGFP-TDP-43z)에서 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)으로 태그된 제브라피시 야생 형 타드bp를 운반하는 또 다른 플라스미드를 구성하십시오. 43h하지만 그렇지 않으면 hsp70l-opTDP-43h-폴리아-칸 분과 동일합니다(hsp70l-EGFP-TDP-43z-폴리아-칸)14. EGFP-TDP-43z를 opTDP-43h의 광 자극을 위한 내부 제어로 사용합니다.
- 1.2.1-1.2.5에 기재된 바와 같이 mnr2b 궤적에서 hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan 카세트를 수용하는 CH211-172N16-iTol2A를 구성한다. HSp70lp-EGFP-TDP-43z-폴리아-칸 카세트를 운반하는 CH211-172N16-iTol2A는 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z로 지정된다.
2. 제브라피시의 Tol2 트랜스포슨 매개 BAC 트랜스게네스
- 40mM KCl, 페놀 레드(10% v/v), mnr2b-hs:opTDP-43h DNA의 25 ng/μL, 25 ng/μ Tol2 트랜스포사스 mRNA19를 포함하는 사출 용액을 준비한다.
- 1세포 단계에서 야생형 제브라피시 배아의 사이토솔에 1nL의 주입 용액(약 123 μm의 직경이 있는 액적)을 1세포 단계에서 야생형 제브라피시 배아의 사이토솔에 주입한다. 2-3일 후 수정(dpf)에서 형광 스테레오현미경으로 척추 운동 뉴런을 포함한 다양한 배아 조직에서 적색 형광 단백질(RFP)-양성 응집체의 형성을 위해 주입된 물고기를 선별한다. RFP 양성 어류를 성인기에 올립니다.
- 2.1 및 2.2에 기술된 바와 같이 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA를 주입한다. 성인기에 EGFP 양성 물고기를 올립니다.
- 몇 달 후, F1 자손을 얻기 위해 표준 2 L 짝짓기 케이지에 쌍에 성적으로 성숙한 주입 물고기와 야생 형 물고기를 넣어. 플랑드르-네오플루아르 5x/0.15 목표 렌즈를 장착한 피형성 현미경을 사용하여 척추 모터 컬럼의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광에 대한 3dpf의 스크린 F1 물고기. 전형적으로, 한 명의 창업자 물고기는 10-20 주입된 물고기에서 확인됩니다(생식선 전송률은 5%-10%)입니다.
- 여러 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]와 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 다른 창업자 물고기의 삽입물을 다른 창업자 물고기의 삽입을 다른 창업자 물고기의 강도를 분리하고 비교하되, opTDP-43h 또는 EGFP-TDP-43z 발현의 패턴은 어조로 인해 설립자 물고기마다 다를 수 있습니다.
- 크로스 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 및 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 물고기 라인 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b
- E3 버퍼 30mL(5mM NaCl)가 들어 있는 플라스틱 접시에 생선을 올립니다. 0.17 mM KCl2, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 10-5% 메틸렌 블루) 및 멜라제닌증을 억제하기 위해 8-10 h포스트 수정(hpf)에서 N-phenylthiourea에서 0.003% (w/v) N-phenylthiourea를 추가합니다.
- 30hpf 후 알루미늄 호일로 플라스틱 접시를 덮습니다.
3. 청색광 조명LED 준비
- 태블릿/휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 LED 패널을 켭니다. 분광기의 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 넣고 응용 프로그램을 통해 ~ 456 nm에서 피크파장에 LED 빛을 조정합니다. 광학 전력 계의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 라이트(~0.61mW/cm2)의 전력을 조정합니다. LED 조명 설정을 저장할 수 있으며 응용 프로그램에서 검색할 수 있습니다.
- 28°C에서 인큐베이터에 접시/LED 패널 설정을 소개합니다. 물고기의 화상 진찰이 48 hpf에서 시작하기 전에이 단계를 완료하십시오.
4. 광유전학 TDP-43을 표현하는 제브라피시 애벌레의 이미징
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 적어도 47hpf 전에 이중 형질형 물고기를 선택하십시오. 전술한 상술한 피피플루오렌스 현미경 설정을 이용하여 척추모터컬럼내의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광에 기초하여.
- Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질체 물고기.
- 에틸 3-아미노벤조이트 메탄술포네이트 소금의 250 μg/mL을 함유한 1% 낮은 용융 온도 아가로즈를 42°C에서 예열한다.
- 짧게 마취 Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] E3 버퍼에서 48 hpf에서 이중 형질식 물고기트리케인의 동일한 농도를 함유한다.
- 예열된 1% 낮은 녹는 온도아가로즈를 실온에서 유리 베이스 접시에 떨어뜨립니다. 유리 접시에 돔 모양의 아가로즈 드롭의 직경은 8-10mm입니다.
- 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 베이스 접시에 녹는 낮은 온도에 추가한 다음 몇 번 파이펫팅하여 섞습니다. 물고기와 함께 아가로즈에 추가된 E3 버퍼의 양을 최소화합니다.
- 척수가 적절한 수평 위치에 있는지 확인하기 위해 아가로즈 (일반적으로 ~ 1 분)의 고화 시 주사기 바늘을 사용하여 측면에 물고기를 유지합니다. 고화 후, 돔 모양의 아가로즈 장착 물고기에 E3 버퍼 몇 방울을 넣습니다.
- 수분 조리개 1.00을 장착한 공초점 현미경으로 스캔하여 척수의 직렬 공초점 z 단면을 획득하고, 픽셀당 4.0 μs(픽셀당 12비트), 목표용 슬라이스당 1.0 μm의 스텝 크기, 배설/배기가스 의 조합 채널 1) EGFP 및 채널 2용 473/510 nm) mRFP1용 559/583 nm.
참고: 물고기의 복부 측에 있는 클로카는 관심 영역(ROI)에 참고 자료로 포함되며, 이는 시간 지점에서 척추 세그먼트(레벨 16-17)를 식별하고 비교하는 데 도움이 됩니다. - 이미징이 완료되자마자 주사기 바늘로 아가로즈를 조심스럽게 부수어 아가로즈에서 물고기를 제거하십시오. 아가로즈가 <30분 동안 포함되는 것은 물고기의 생존가능성에 영향을 미치지 않지만, 물고기가 아가로즈에 내장되는 시간을 가능한 한 짧게 유지한다.
5. 푸른 발광 다이오드 (LED) 빛의 필드 조명에 의해 opTDP-43h 표현 물고기의 빛 자극
- 7.5mL의 E3 버퍼를 우물에 넣고 이미지된 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 트랜스제닉 어류를 웰에 넣습니다. 접시와 LED 패널을 스페이서와 5mm 간격으로 유지하여 LED 패널에 6웰 접시를 놓습니다(예: 5개의 슬라이드 안경이 쌓여 있음).
- 파란색 LED 표시등을 켭니다. Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질식 생선을 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 접시에 보관하십시오(즉, 어두운 조건에서).
- 조명 후(예: 도 3에서 72hpf에서 24시간 동안) 4.3-4.9단계를 반복하여 조명된 물고기의 척수를 이미지화한다.
6. 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 세포질 재배치 의 시각화
- 이미지 파일을 이미지 파일 인 ImageJ/Fiji21 (버전: 2.1.0/1.53c)에서 열어 NIH 이미지에서 개발한 오픈 소스 Java 이미지 프로세싱 프로그램으로 https://imagej.net/Fiji/Downloads 다운로드할 수 있습니다.
- Z 스크롤 모음을 사용하여 초점 평면을 통과합니다. 이미지 | 클릭하여 여러 조각의 최대 강도 투영을 만듭니다 . 스택 | Z 프로젝트 | 최대 강도 및 설정 시작 슬라이스 및 척추 모터 컬럼의 중간 세그먼트를 커버 슬라이스를 중지합니다.
- 이미지 | 클릭하여 멀티채널 이미지를 두 개의 단일 채널 이미지로 분할 합니다. 색상 | 분할 채널.
- EGFP-TDP-43z 신호를 향상시켜 이미지를 클릭하여 세포질 EGFP-TDP-43z가 명확하게 표시되도록 | | 조정 밝기/대비 및 최소 조정
- 분석 | 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. 도구 | ROI 매니저. 세포 체의 상대적 위치를 기준으로 48 hpf 및 72 hpf의 두 이미지에서 식별 가능한 세포를 찾습니다. Freehand 선택을 사용하여 EGFP-TDP-43z 신호에 의해 시각화된 단일 척추 운동 뉴런의 세포 몸의 윤곽을 요약한 다음 ROI 관리자에서 [t] 추가를 클릭하여 ROI를 설정합니다.
- 직선을 사용하여 직선을 그리고 | 분석을 클릭하여 소마의 주요 축을 설정합니다. EGFP-TDP-43z(C1) 및 opTDP-43h(C2) 이미지에 대한 플롯 프로파일은 48 및 72hpf에서.
- 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 신호에 대해 값을 가장 큰 값으로 나누어 플롯 프로파일을 정규화합니다. x와 y가 통계 소프트웨어에서 XY 그래프를 사용하여 각각 소마 및 상대 형광 강도의 주요 축을 나타내는 x-y 좌표로 정규화된 값을 플롯합니다.
7. ImageJ/Fiji를 이용한 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호 간의 비율 비교
- ImageJ/Fiji에서 이미지 파일을 열고 6.1-6.5에서와 같이 EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지를 사용하여 단일 mnr2b 양성 셀에 대한 ROI를 설정합니다. 배경 신호(배경 ROI)를 나타내기 위해 복부 척수(예: 노토코드) 외부에 ROI를 추가합니다.
- 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43 이미지에 대해 이미지를 클릭하여 여러 슬라이스의 투영을 | 스택 | Z 프로젝트 | 중간 슬라이스를 합산 하고 중간 척추 모터 컬럼을 덮는 슬라이스 를 시작하고 중지합니다.
- 최대 강도 프로젝션 이미지로 만든 ROI 관리자를 엽니다. EGFP-TDP-43z의 이미지 창을 선택한 다음 ROI 관리자에서 모두 표시 를 클릭하여 합계 슬라이스 이미지에 ROI를 표시합니다. ROI 관리자의 측정 값을 클릭하여 각 ROI에 대한 평균 값을 얻습니다.
- 7.3에서 제공되는 동일한 절차에 따라 opTDP-43h의 평균 값을 획득합니다.
- 각 ROI에 대해, 배경 ROI에 대한 평균을 빼낸 후, EGFP-TDP-43z에 대한 빼기 평균으로 opTDP-43h에 대한 빼기 된 평균을 분할하여 비율 값을 얻습니다. 비율 측정 값은 서로 다른 시간 점 간에 비교하고 프리즘 소프트웨어의 열 그래프를 사용하여 표시할 수 있습니다.
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Representative Results
제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에 있는 광유전학 및 비 광유전학 TDP-43 단백질의 살아있는 화상 진찰
제브라피시의 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 상 전이를 유도하기 위해, N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig22로 태그되는 인간 TDP-43h는 각각 opTDP-43h14(도 1A)로 구성및 지정되었다. opTDP-43h 유전자 단편은 mnr2b 궤적(도 1B)을 포함하는 BAC로 도입되었다. mnr2b-hs:opTDP-43h로 지정된 결과 BAC는 Tol2 트랜스포슨 매개 BAC 트랜스게네시스19에 의해 제브라피시 게놈으로 도입되었다. 척추 운동 뉴런에서 비-암전유전학 TDP-43의 국소화를 모니터링하기 위해, 타드BP 유전자에 의해 인코딩된 제브라피쉬 TDP-43은 N-terminus(도 1A)에서 EGFP로 태그되었고 EGFP-TDP-43z 유전자 단편은 opTPP-4B와 유사한 mnr2b BAC에 도입되었다. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z로 지정된 결과 BAC는 Tol2 트랜스포손 매개 BAC 전염에 의해 제브라피시 게놈으로 도입되었다. 각 BAC 구조로 주입된 물고기는 야생형 물고기와 교차되었고, 그 결과 F1 물고기는 3일째에 빨간색(Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]) 또는 녹색(Tg[mnr2b hs:EGFP-TDP-43z]) 형광척척수로 인해 상영되었다. 고립 된 빨간색 또는 녹색 형광 양성 F1 물고기는 Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] 또는 Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43z]로 지정되었습니다.
Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 48 hpf에서 이중 형질형 물고기는 마취및 그들의 측면에 낮은 녹는 아가로즈에 내장; 아가로즈 고화 후, 그들은 위에서 척수의 측면의 관찰을 허용하기 위해 E3 버퍼로 덮여 있었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 20배 물 침수 목표 렌즈와 여기/방출 파장의 조합으로 수행되었다: EGFP의 경우 473/510 nm, mRFP1용 559/583 nm. 스캔한 물고기는 즉시 조심스럽게 아가로즈로부터 가져와 6웰 플레이트에서 E3 버퍼로 이송되고, 28°C에서 LED 패널에 플레이트를 배치하여 파란색 LED 조명에 의해 조명되었다(도 2A, B). 24h 조명 후, 물고기는 48hpf(그림 2B)에서 이미지된 해당 척수 영역을 포함하도록 ROI가 조정되었다는 점을 제외하고는 동일한 이미징 조건을 사용하여 공초점 현미경으로 스캔되기 전에 아가로즈에 다시 마취및 내장하였다. 4-5 개의 연속 척추 세그먼트의 전체 헤미척수는 현미경 세션 (일반적으로 20-30 분)동안 이미지화되어 공초점 스캐닝 평면에 비해 장착 된 물고기의 척수의 세로 축의 수평도에 따라 20-40 슬라이스를 포함하는 z 시리즈 이미지를 생성했습니다.
척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 세포질 재배치 의 시각화
단일 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h의 세포질 재배치를 시각화하기 위해 48 및 72 hpf에서 획득한 z 시리즈 이미지 (일반적으로 20-40 슬라이스)는 피지로 열리고 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 채널로 분리되었습니다. EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지는 48 및 72 hpf의 이미지를 위해 만들어졌으며, 48 및 72hpf에서 두 이미지에서 식별가능한 단일 절연 척추 뉴런이 선택되었습니다(그림 2B, 화살표). 모터 컬럼의 등쪽 측면에 위치한 세포 체가 있는 척추 운동 뉴런은 희소한 분포 패턴 때문에 세포 체형의 측정에 적합한 것으로 간주되었다.
EGFP-TDP-43z 이미지에서 EGFP 신호의 강도를 조정한 후, 모터 뉴런의 소마를 커버하는 ROI는 EGFP 신호의 가장자리를 48 및 72hpf(도 2C)로 추적하여 설정하였다. 소마의 주요 축을 따라 형광 강도는 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 신호에 대해 48 및 72 hpf(도 2C, 오른쪽)를 측정하였다. 48hpf에서 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호의 패턴은 대체로 서로 겹쳤다.
대조적으로, 72hpf에서, opTDP-43h 신호의 피크는 EGFP-TDP-43z 신호가 낮은 지역에서, 즉 세포질에서, opTDP-43h의 세포질 재배치를 나타내는 지역에서 발견되었다. 빛 의존성 세포질 opTDP-43h 재배치는 비 광유전학 TDP-4314와 크게 독립적으로 시작됩니다. 이 분석에서, 최대 강도 투영 이미지는 정량적 측정을 희생하여 핵/세포질 경계의 위치를 추정하는 데 사용되었다.
척추 운동 뉴런에서 광유전학 및 비 광유전학 TDP-43의 형광 강도의 비율 측정 비교
변동하는 opTDP-43h 단백질 수준에 대한 청색광 자극의 효과를 평가하기 위해, 세포 체내의 opTDP-43h 신호는 EGFP-TDP-43z 신호를 참조하여 빛 자극 전후를 측정하였다. 척추 헤미세그먼트를 포함한 z 시리즈 이미지는 피지와 함께 열렸습니다. 단일 척추 운동 뉴런을 포함하는 ROI를 설정하기 위해 EGFP-TDP-43z 신호의 최대 강도 프로젝션 이미지가 48 및 72 hpf로 만들어졌으며 48 및 72 hpf 이미지 모두에서 식별 할 수있는 단일 절연 척추 뉴런이 선택되었습니다 (그림 3A). 무료 선택을 사용하여 ROI는 48 hpf 이미지와 72hpf 이미지(그림 3A)에 대해 ROI 관리자에 그려지고 등록되었습니다. EGFP-TDP-43z 신호의 최대 강도 투영은 높은 콘트라스트 때문에 ROI를 설정하는 데 적합한 것으로 간주되었다.
opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호를 정량화하기 위해 동일한 z 시리즈 이미지의 각 채널에 대한 투영 이미지를 48 및 72hpf(그림 3A)에 생성하였다. 등록된 ROI 세트를 사용하여, opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 형광 강도는 매 시각 지점에 대해 측정되었다. EGFP-TDP-43z(RFP/GFP 값)에 대한 opTDP-43h의 상대적 양은 RFP 값을 GFP 값으로 나누어 각 셀 및 시간 지점에 대해 계산하였다(그림 3B). 조사된 4개의 mnr2b 양성 세포의, 셀 #1은 특히 포화 EGFP-TDP-43z 신호(그림 3A)를 표시했습니다. 포화 형광 신호를 가진 세포는 정량적 분석을 수행할 때 데이터 집합에서 제외되어야 합니다. 세포 #2-#4는 청색광 조명 후 EGFP-TDP-43z에 대한 상대 opTDP-43h 수준의 감소 추세를 나타내었지만(그림 3B), 대규모 분석은 이전에 EGFP-TDP-43z에 대한 상대적 opTDP-43h 수준의 감소가 통계적으로 유의하지 않았다는 것을 입증했습니다(3개의 독립적인 동물로부터 65세포).
도 1: mnr2b 궤적을 이용한 BAC DNA의 시공. (A) opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z용 발현 카세트의 구조. (b) CH211-172N16 BAC DNA에 의해 운반된 제브라피시 게놈 영역. opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z용 PCR 증폭식 카세트는 동종재조합에 의해 mnr2b의 첫 번째 엑소에 mnr2b(빨간색 화살표)의 5′un번역 영역(UTR)의 하류에 삽입된다. 막대는 500(A) 및 10k(B) bp를 나타냅니다.
그림 2: 빛 자극 전후의 opTDP-43h의 실시간 이미징. (A) 억제되지 않은 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 42h까지 의 원전 조명을 통해 이중 형질식 물고기의 척추 운동 뉴런에 표현된 opTDP-43h의 광 자극 의 방식. (B) 광 자극(48hpf) 전후(72hpf) 전후의 복부 척수의 z 시리즈 공초점 이미지의 최대 강도 투영 이미지. 돌진선은 척수의 복부 한계를 해비합니다. 수치는 아사카와 외.14 (C) 세포질 이24h 청색광 조명 후 opTDP-43의 비현지화에서 적응된다. 48 및 72 hpf에서 관찰된 mnr2b 양성 세포의 소마(B의 적색 화살표)의 윤곽은 마젠타에서 나타난다. 소마의 주요 축은 밝은 파란색으로 표시되었다. 주요 축을 따라 정규화된 형광 강도가 플롯되었습니다. 별표는 강력한 EGFP-TDP-43z 겹치는 신호를 표시하지 않는 강력한 opTDP-43 신호의 클러스터를 나타내며, 이는 세포질 opTDP-43h 잘못 지역화를 나타낸다. 막대는 1mm(A), 20 μm(B), 4μm(C)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 광 자극 전후opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 비율 측정 비교. (A) 48 및 72hpf에서 4개의 단일 mnr2b 양성 세포의 소마를 커버하는 ROI는 EGFP-TDP-43z 신호를 기반으로 그려졌으며 마젠타에 표시된다. 직사각형 ROI(bg)는 배경 신호(background ROI)를 빼는 데 사용되었습니다. 수치는 아사카와 외.14 (B)에서 적응하여 OPTDP-43h에서 EGFP-TDP-43z로 의 상대적 강도는 RFP/GFP 비율로 각 시간에 각 셀에 대해 플롯되었다. 별표로 표시된 셀 #1은 EGFP-TDP-43z 신호가 포화되고 RFP/GFP 값이 과대 평가되었기 때문에 비율 비교에 적합하지 않았습니다. 막대는 10 μm을 나타냅니다 .
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Discussion
mnr2b-BAC-매개 발현은 제브라피시의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 발현을 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 위상 전이의 라이브 이미징을 위한 독특한 기회를 제공한다. 제브라피시 애벌레의 신체 조직의 광학적 투명성은 opTDP-43h의 간단하고 비침습적 광유전학적 자극을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 단일 척추 운동 뉴런 사이의 비교는 opTDP-43h의 빛 의존 올리고머화가 ALS 병리학을 연상시키는 세포질 클러스터링을 일으킨다는 것을 보여주었습니다.
본질적으로 무질서한 단백질의 위상 거동을 정의하는 중요한 매개변수 중 하나는 세포내 농도입니다. 높은 수준의 opTDP-43h 식은 잠재적으로 빛 독립적 opTDP-43h 올리고머화, 위상 전환 및 집계로 이어질 수 있습니다. 따라서, 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h 발현의 안정적이고 무독성 수준의 유도는 척추 운동 뉴런에 대한 opTDP-43 상 전환의 생리학적 및 병리학적 결과의 성공적인 평가에 핵심이다. opTDP-43 h의 mnr2b-BAC 매개 발현은 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 물고기디스플레이가 주로 핵 opTDP-43을 나타내기 때문에 이러한 목적에 적합한 것으로 보이며, 팽창된 수영 방광으로 자유로운 수영을 할 수 있으며, 1b-dpf에서 연속암색 조건에서 자란 후에도 완전한 생존력을 유지한다. 제브라피시에서, 외인성으로 관심 있는 유전자를 발현하는 데 사용되는 종래의 접근법은 1세포 단계에서 mRNA 주입이다. 그러나, 주입된 mRNA에서 한 번에 모두 번역된 TDP-43 단백질의 고용량은 나중에 분화하는 척추 운동 뉴런의 분석을 배제하는 초기 발달 결함을 일으킨다. 그러나, 주입된 mRNA의 양을 견딜 수 있는 수준으로 낮추는 것은 척추 운동 뉴런의 광유전학 변조를 위한 충분한 opTDP-43h를 분화할 때까지 공급하지 못하고, mRNA 주사가 얼룩말피의 척추 모터 뉴런에 opTDP-43h를 전달하는 적당한 방법이 아님을 나타낸다. 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h를 발현하는 데 사용되는 또 다른 가능한 접근법은 주사하고, 1세포 단계에서, 척추 운동 뉴런에서 활성화되는 프로모터의 통제 하에 opTDP-43h 구조를 수용하는 플라스미드 또는 BAC DNA를 주입하는 것입니다. mnr2b-hs:opTDP-43h BAC DNA의 주입은 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h의 발현을 지시할 수 있지만, opTDP-43h 양성 모터 뉴런의 수는 낮으며, 이러한 수치적으로 제한된 opTDP-43h 양성 세포에서 발현 수준은 일반적으로 높으며, 종종 빛-opdp와 연관된다. 이러한 관측은 통칭한 형질전환 식이 무독성 수준에서 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h를 안정적으로 표현하는 대체 할 수없는 전략임을 시사합니다. 특히, mnr2b-BAC 라벨은 zebrafish20,23에 있는 거의 모든 척추 운동 신경세포를 표시하더라도, opTDP-43h의 발현 수준은 개별 mnr2b 양성 세포 사이에서 변화할 수 있었습니다. 이러한 변화는 부분적으로 운동 뉴런 분화에서의 조절 역할과 관련된 mnr2b의 본질적인 발현 패턴 때문일 수 있다. 다양식에 대한 또 다른 잠재적 원인은 mnr2b-BAC 인서트에 대한 염색체 위치 효과로부터 발생할 수 있다. 원인이 무엇이든, mnr2b 양성 세포 중 다양한 opTDP-43 발현 수준은 빛 의존적인 opTDP-43h 위상 전이와 관련되었던 세포 독성에 있는 변이를 일으키는 원인이 될 수 있었습니다.
얼룩말 물고기 애벌레에서 척수 신경 신경의 소마는 복부 척수에 조밀하게 정렬되며, somal 세포질은 축산 세포질보다 훨씬 낮은 볼륨을 가지고 있습니다. 이 해부학 적 특징은 척추 운동 뉴런에서 세포질 opTDP-43h의 정량적 분석을 제한합니다: opTDP-43h는 핵및 somal 세포질에서만 정량적으로 측정가능하지만 운동 뉴런의 전체 세포에서는 측정할 수 없습니다. 척추 운동 뉴런의 전체 세포에서 단백질의 정량적 이미징, 소마와 말초 신경 말단을 포함 하 여, 도전적인 작업 남아. 정량적 분석에 대한 제한에도 불구하고, soma에서 opTDP-43h/EGFP-TDP-43z 비율은 IDR(A315T)14에서 ALS 유발 돌연변이에 의해 상승되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 방법은 척추 운동 뉴런의 소마내상 전이와 관련된 단백질 안정성에 대한 TDP-43 돌연변이의 효과를 평가하는 데 적용가능하다.
원칙적으로, mnr2b-BAC 접근법은 LLPS를 조절하고 TDP-43을 넘어 IDR을 가진 다른 ALS 관련 RNP 단백질의 세포 독성을 평가하기 위해 확장될 수 있다. 몇몇 프로토콜 단계는 척추 운동 신경에 있는 그 같은 광유전학 탐사선의 최적 발현 수준을 얻기 위하여 조정될 필요가 있을 수 있습니다. 첫째, Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 형질형 구조에서 hsp70l 프로모터는 mnr2b 증강제에 의해 구동되는 opTDP-43h 발현을 향상시키기 위해 기저 프로모터로 사용되었다. 상기 hsp70l 프로모터는 관심 있는 단백질의 발현 수준이 너무 높아지면 BAC 분결물로부터 제거되어 광독립적인 자궁피소상 전이를 유발할 수 있다. 둘째, opTDP-43h에는 CRY2olig 태그가 장착되어 있으며, 이는 청색광 조명에 클러스터링 용량을 향상시키는 포인트 돌연변이를 운반하는 사진화형 편성학(PHR) 도메인이다222. 상기 야생형 단백질 CRY2PHR 은 빛의존적 군집 활성을 감쇠할 필요가 있는 경우 빛의존적인 올리고머화 태그로서 사용될 수 있다. 마지막으로, 제브라피시의 ALS 병리학을 보다 충실히 재구성하기 위해, 물고기 생리학이 청소년 및 성인 단계 동안 청색광의 현장 조명에 의해 최소한의 영향을 받는 조명 프로토콜을 설정하는 것이 바람직하다. 본 방법은 48에서 72hpf(24시간)까지 연속 청색광 조명을 사용하며, 시력과 같은 가벼운 반응성 생리적 기능이 영향을 받을 수 있지만, 물고기 생존력을 잃지 않고 120hpf(72h)까지 조명 지속시간을 연장할 수 있다. 간헐적인 빛 조명을 위한 프로토콜을 개발함으로써, 훨씬 더 장기적인 빛 자극이 가능해질 수 있으며, 이는 opTDP-43h의 개발을 보다 성숙한 병리학적 골체로 용이하게 할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 덜 생리적으로 방해하는 다른 광파장을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 변조하기위한 다른 광유전학 프로브24 또한 더 조사할 가치가있을 수 있습니다. 이러한 향상된 광유전학 TDP-43 프로브의 조합, 질병 취약 한 세포 유형을 대상으로 하는 적절 한 프로모터, 생리 기능에 최소한의 효과 와 조명 프로토콜 은 TDP-43 단백질 병증의 병리를 충실 하 게 모델링 하는 길을 열 것 이다 뿐만 아니라 척수에서 뿐만 아니라 뇌에서.
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Disclosures
KA와 KK는 이 원고에 기재된 지적 재산권의 발명가이며, 임시 특허는 국립유전학원에 의해 제출되었다.
Acknowledgments
이 작품은 세리카 펀드 (KA), KAKENHI 그랜트 번호 JP19K06933 (KA) 및 JP20H05345 (KA)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
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