Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Resumen

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Resumen

Los fotorreceptores de varilla son neuronas sensoriales altamente polarizadas con compartimentos distintos. Los bastones de ratón son largos (~80 μm) y delgados (~2 μm) y están empaquetados lateralmente en la capa más externa de la retina, la capa fotorreceptora, lo que resulta en la alineación de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, la sección tangencial de la retina plana congelada se ha utilizado para estudiar el movimiento y la localización de las proteínas dentro de diferentes compartimentos de bastones. Sin embargo, la alta curvatura de la retina del ratón dominante en bastón hace que la sección tangencial sea un desafío. Motivados por el estudio del transporte de proteínas entre compartimentos, desarrollamos dos métodos de peeling que aíslan de manera confiable el segmento externo de varilla (ROS) y otros compartimentos subcelulares para western blots. Nuestras técnicas relativamente rápidas y simples entregan fracciones enriquecidas y subcelulares específicas para medir cuantitativamente la distribución y redistribución de importantes proteínas fotorreceptoras en bastones normales. Además, estas técnicas de aislamiento también se pueden adaptar fácilmente para aislar e investigar cuantitativamente la composición proteica de otras capas celulares dentro de retinas sanas y degeneradas.

Introducción

Las células fotorreceptoras de varilla, estrechamente empaquetadas en la capa más externa de la retina neural, son una parte integral de la visión con luz tenue. Para funcionar como contadores de fotones fieles, las varillas utilizan una vía de señalización basada en proteína G, denominada fototransducción, para generar respuestas rápidas, amplificadas y reproducibles a la captura de un solo fotón. Esta respuesta a la luz finalmente desencadena un cambio en la corriente en la membrana plasmática y posteriormente se señala al resto del sistema ^visual1. Como su nombre lo indica, cada célula de varilla tiene una forma distinta en forma de varilla ....

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales locales del comité de cuidado de animales de investigación de la Universidad del Sur de California (USC).

1. Método de peeling de retina de células vivas

1. Preparación de tampones de Ames, papeles de pelar y plato de disección
   1. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte el papel de filtro de celulosa (Grado 413) en rectángulos que midan aproximadamente 5 mm x 2.5 mm. Guarde los esquejes para su uso futuro.
   2. Prepare 1 L de tampón HEPES de Ames combinando una botella de Ames' Medium, 2,3....

Resultados

Las estrategias actuales se desarrollaron para proporcionar métodos relativamente rápidos y simples para aislar y analizar proteínas entre compartimentos subcelulares de bastones específicos para el análisis de western blot. Aplicamos dos técnicas de peeling secuencial (Figura 1 y Figura 2) seguidas de inmunoblotting para demostrar que estos métodos podrían usarse de manera confiable para detectar la distribución conocida de transducina de bastón (GNAT1) y arres.......

Discusión

Muchas enfermedades de la retina afectan a las células fotorreceptoras de bastoncillos, lo que lleva a la muerte de los bastones y, en última instancia, a la pérdida completa de la ^visión37. Una parte significativa de los orígenes genéticos y mecanicistas de la degeneración retiniana humana se han recapitulado con éxito en numerosos modelos de ratones a lo largo de los años. En ese contexto, la capacidad de separar fácil y selectivamente los compartimentos subcelulares de bastoncillos individuales.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Frasco de laboratorio o de medios de comunicación de 100 mL equipado con un adaptador de tapa de tubo	N/A	N/A
100% O2 tanque	N/A	N/A
1000mL Filtro de tapa de botella, PES Material del filtro, 0.22 μ m	Genesee Scientific	25-235
4X SDS Tampón de muestras	Millipore Sigma	70607-3
50 mL Tubo Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
95% O2 y 5% CO2 tanque	N	/A N/A
Ames' Medio con L-glutamina, sin bicarbonato	Sigma-Aldrich	A1420
CaCl2 (99%, dihidratado)	Sigma	C-3881
Drierita (Sulfato de calcio anhidro, >98% CaSO4, >2% CoCl2)	WA Hammond Drierite Co LTD	21005
Falcon Placa de Petri de fácil agarre (poliestireno, 35 x 10 mm)	Falcon-Corning	08-757-100A
Plato de cultivo de tejidos Falcon de fácil agarre (60 x 15 mm)	Falcon-Corning	08-772F
Bisturí de plumas (n.º 10, 40 mm)	VWR	100499-578
Bisturí de plumas (n.º 11, 40 mm)	VWT	100499-580
KCl (99%)	Sigma	P-4504
Kimble Kontes mortero de pellets	Sigma	z359971
Matraces de congelación rápida	Labconco Labconco	N/A
LN2 (nitrógeno líquido) + Matraz Dewar o matraz de vacío similar	N/A	N/A
MgCl2	Sigma	M-9272
Milli-Q/agua desionizada	EMD Millipore	N/A
Na2HPO4 (polvo)	J.T. Baker	4062-01
NaCl (cristal)	EMD Millipore	Sx0420-3
NaHCO3	Amresco	0865
OmniPur EDTA	EMD	4005
OmniPur HEPES, Ácido Libre	EMD	5320
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793
Reynolds Wrap Papel de aluminio	Reynolds Brands	N/A
Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m)	Scotch-3M	N/A
Desoxicolato de sodio	Sigma-Aldrich	D67501
Spectrafuge mini centrífuga	Labnet International, Inc	C1301
Cámara de incubación de tejidos (comprada o hecha a medida)	N/A	N/A
Tris-HCl	J.T.Baker	4103-02
Triton X-100	Signma-Aldrich	T8787
VirTis Liofilizador de sobremesa 2K o máquina equivalente	SP Scientific	N/A
VWR Grado 413 Papel de archivado (diámetro 5,5 cm, tamaño de poro 5 μ m)	VWR	28310-015
Papel de filtro cualitativo Whatman Grado 1 (diámetro 9 cm, tamaño de poro 11 μ m)	Whatman/GE Healthcare	1001-090
Pipeta de transferencia de diámetro amplio, Global Scientific	VWR	76285-362