Summary
Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde evaluatie van geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte signaleringsremmers in NSCLC-patiënt-afgeleide organoïdemodellen.
Abstract
Nieuwe 3D-kankerorganoïde culturen afgeleid van klinische patiëntmonsters vormen een belangrijk modelsysteem om intratumor heterogeniteit en behandelingsrespons op gerichte remmers bij kanker te evalueren. Baanbrekend werk in gastro-intestinale en pancreaskankers heeft de belofte van patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) benadrukt als een patiënt-proximaat kweeksysteem, met een toenemend aantal modellen in opkomst. Evenzo heeft het werk bij andere soorten kanker zich gericht op het opzetten van organoïde modellen en het optimaliseren van cultuurprotocollen. Met name 3D-kankerorganoïdemodellen behouden de genetische complexiteit van originele tumormonsters en vertalen zo tumor-afgeleide sequencinggegevens in behandeling met genetisch geïnformeerde gerichte therapieën in een experimentele setting. Verder kunnen BOB's de evaluatie van rationele combinatiebehandelingen bevorderen om resistentie-geassocieerde aanpassing van tumoren in de toekomst te overwinnen. De laatste richt zich op intense onderzoeksinspanningen bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC), omdat resistentieontwikkeling uiteindelijk het behandelingssucces van gerichte remmers beperkt. Een vroege beoordeling van therapeutisch targetbare mechanismen met behulp van NSCLC-BOB's zou kunnen helpen bij het informeren van rationele combinatiebehandelingen. Dit manuscript beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de celkweekplaatgebaseerde beoordeling van geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte remmers in NSCLC-afgeleide 3D-BOB's, met potentieel aanpassingsvermogen aan combinatiebehandelingen en andere behandelingsmodaliteiten.
Introduction
Gepersonaliseerde therapieën tegen oncogene factoren hebben een revolutie teweeggebracht in de behandeling van kanker, waardoor de overleving van de patiënt is verbeterd en de door de behandeling gemedieerde bijwerkingen zijn verminderd1. Recente ontwikkelingen in moleculaire diagnostiek en sequencingtechnologieën hebben de complexiteit van menselijke tumoren benadrukt, met ruimtelijke en temporele heterogeniteit die van invloed is op de behandelingsrespons2. Het samenvatten van deze subklonale verschillen in celkweekmodellen is lange tijd beperkt gebleven tot het onderzoeken van geselecteerde veranderingen van belang in anders uniforme cellijnen. Nieuw ontwikkelde 3D PDO-modellen gegenereerd uit tumorbiopten of chirurgische tumorresecties zorgen voor een verbeterde weergave van cellulaire complexiteit en signaaloverspraak in van de patiënt afgeleid tumorweefsel3. Als zodanig zijn tumororganoïden afgeleid van gastro-intestinale en alvleesklierkanker met succes gegenereerd en recapituleren ze de genetische diversiteit en determinanten van de behandelingsrespons4,5,6. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) worden organoïde ontwikkelings- en vestigingsuitdagingen erkend en is optimalisatie van kweektechnieken en selectieve mediafactoren nodig om in de toekomst een breder en systematischer gebruik van NSCLC-PDO's mogelijk te maken7,8.
Het ontwikkelen van combinatorische therapieën gericht op resterende tumorcellen die bestand zijn tegen de initiële medicamenteuze behandeling is essentieel om de ontwikkeling van resistentie te remmen en uiteindelijk de overleving van de patiënt te verbeteren9. Gezien de architecturale complexiteit van organoïde culturen, moeten klassieke geneesmiddelresponsparameters worden geoptimaliseerd om nauwkeurige en reproduceerbare tests van geneesmiddelgevoeligheden mogelijk te maken. Imaging-gebaseerde uitlezingen10,11 en klassieke cel levensvatbaarheidstests die cellulaire ATP-abundantie meten6,12, naast andere technieken, zijn beschikbaar om geneesmiddelresponsen in BOB-culturen te profileren. Hier ontwikkelen en beschrijven we een gestandaardiseerd protocol om geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte therapie te evalueren tegen bekende klinische drivers in NSCLC PDO-modellen.
Protocol
Voor onderzoek met menselijke proefpersonen werd geïnformeerde toestemming verkregen en weefselverzameling werd uitgevoerd onder de door de UCSF Internal Review Board goedgekeurde protocollen (IRB, protocolnr.: # 13-12492 of CC # 17-23309). De vaststelling van organoïde culturen uit gedeïdentificeerde klinische monsters werd uitgevoerd in samenwerking met onderzoekspartners volgens eerder gepubliceerde methoden13,14,15,16. Organoïde culturen werden opgehaald voor onderhoud en drugsescalatie-experimenten bij passage drie of later. Alle volgende protocollen werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden in een laboratoriumomgeving voor weefselkweek bij zoogdieren.
Figuur 1: Protocolschema van workflow en kritische stappen in de techniek. (A) Experimentele workflow inclusief zaaien van organoïden in 96-well formaat, behandeling met geneesmiddelescalatie 7 dagen na het zaaien en luminescentie-gebaseerde celoverlevingsuitlezing 5 dagen na behandeling met behulp van een ELISA-plaatlezer. (B) Een voorbeeldafbeelding van de EGFRdel19-positieve TH107- en EGFRL858R-positieve TH330 NSCLC-organoïdeculturen. Oorspronkelijke culturen, cellen op het moment van zaaien (dag 0) en organoïden bij de behandeling beginnen 7 dagen na het zaaien (dag 7) worden getoond. Schaalbalk = 100 μm. Veranderingen in organoïddiameter gedurende de initiële kweekperiode van 7 dagen worden gekwantificeerd en wijzen op >2-voudige toename van de organoïdegrootte. Relatieve vouwveranderingen in grootte op dag 7 ten opzichte van de gemiddelde grootte op dag 0 worden weergegeven onder de representatieve afbeeldingen. Voor TH107 wordt een vouwverandering van 2,38 over 7 dagen waargenomen, wat wijst op een verdubbelingstijd van 5,88 dagen (141,12 uur). Voor TH330 wordt een vouwverandering van 2,41 over 7 dagen waargenomen, wat wijst op een verdubbelingstijd van 5,81 dagen (139,42 uur). Kwantificering van veranderingen in organoïdegrootte en statistische evaluatie worden gepresenteerd (rechts). Statistische significantie wordt berekend door middel van ongepaarde t-test, p < 0,0001. (C) Behandelingslay-out voor medicijnescalatie in organoïde 96-well plaatformaat. Het aantal technische replicaties en voorbeelddoses wordt aangegeven, inclusief een negatieve controle. De schema's zijn gemaakt met BioRender, een webgebaseerde illustratietool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Experimentele preparaten
- Bereid groeimedium (GM) voor zoals eerder gemeld15: Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's nutriëntmengsel F12 (DMEM/F-12) met L-alanyl-L-glutamine, aangevuld met 100 U/ml penicilline/streptomycine, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondin, 1x B27, 5 mM Nicotinamide, 1,25 mM N-Acetylcysteïne, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/ml Primocin, 100 ng/ml hNoggin, 100 ng/ml hFGF-10, 25 ng/ml hFGF-7 (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen en filtreer door een filtersysteem van 0,22 μm. Verwarm de media vóór gebruik binnen 1 uur tot 37 °C. - Bereid media met lage groeifactor (LGM) voor zoals eerder gemeld16 zonder toevoeging van epidermale groeifactor (EGF): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's voedingsmengsel F12 (DMEM / F-12), aangevuld met 1 mM HEPES, 1x L-alanyl-L-glutamine, 1x Penicilline-Streptomycine-Glutamine, 10 mM Nicotinamide, 1 mM N-Acetylcysteïne, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng / ml hNoggin.
OPMERKING: Meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen en filtreer door een filter van 0,22 μm. Verwarm de media vóór gebruik binnen 1 uur tot 37 °C. - Ontdooi BME2 (Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, zie Tabel met materialen) op ijs, bij 4 °C, 's nachts.
2. Het genereren van eencellige suspensie en het zaaien van cellen
- Dissociëren van ondergedompelde BME2 organoïde cultuur zoals beschreven in de volgende stappen (2.1.1-2.1.6).
- Aspirateer zorgvuldig media van de cultuurplaten. Vermijd het aanraken van de ondergedompelde BME2-organoïdecultuur.
OPMERKING: Media-aspiratie kan worden gedaan zoals de onderzoeker dat wil, bijvoorbeeld met een basisvloeistofaspiratiesysteem of met behulp van een pipet. Vermijd het aanraken van de in BME2 ingebedde organoïden, omdat dit kan leiden tot verlies van organoïde biomassa. - Trypsiniseren van de ondergedompelde BME2 organoïde cultuur met een geschikt recombinant enzym (zie Tabel met materialen). Voeg in 6-well plaatformaat 2 ml per put toe. Breek de BME2 mechanisch door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Incubateer platen bij 37 °C in de celkweekincubator gedurende 5 min.
- Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 600 x g .
- Zuig het recombinante enzym voorzichtig op zonder de organoïde pellet aan te raken.
OPMERKING: Rest BME2 kan aanwezig zijn. Herhaal de enzymvertering indien nodig. - Resuspend de organoïde pellet in GM (stap 1.1). Voeg DNase I 1x 100 U/ml toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (zie Materiaaltabel).
- Centrifugeer bij 600 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer de media voorzichtig af zonder de organoïde pellet aan te raken en gooi weg. Resuspend in verse GM.
- Aspirateer zorgvuldig media van de cultuurplaten. Vermijd het aanraken van de ondergedompelde BME2-organoïdecultuur.
- Zaaien van organoïde eencellige suspensie
- Verwarm een nieuwe zwarte, heldere bodemplaat met 96 putten op 37 °C gedurende 10 minuten in de celkweekincubator.
OPMERKING: Het gebruik van heldere bodemplaten is essentieel om de groei van organoïden en de respons op geneesmiddelen te controleren. - Bereid voor het tellen een verdunning van 1:5 van de celsuspensie in PBS (totaal volume: 500 μL) en tel de celsuspensie met behulp van een celanalysator (zie Materialentabel).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u vermenigvuldigt met de verdunningsfactor (x 5) om de uiteindelijke celconcentratie te ontvangen. Alternatieve telmethoden zoals een hemocytometer kunnen worden gebruikt. De levensvatbaarheid van cellen moet worden gecontroleerd met behulp van een levensvatbaarheidskleuringstest (bijvoorbeeld met Trypan Blue17). Met behulp van een celanalysator wordt de levensvatbaarheid automatisch beoordeeld. De levensvatbaarheid van organoïde eencellige suspensies zoals geëvalueerd door de celanalysator moet ≥95% bedragen (aanvullende figuur 1). - Bereken het volume van de celsuspensie die nodig is om te zaaien voor het experiment.
OPMERKING: De zaaiconcentratie is 1500 cellen/μL BME2, met 5 μL BME2 nodig per put (Totaal aantal: 7500 cellen/put). Voor één 96-putplaat zijn 6 x 10E5 cellen nodig. Dit omvat het zaaien van 60 putten met organoïde koepels (4,5 x 10E5) en experimenteel overschot (berekening voor een totaal van 80 putten). - Bereid één aliquot celsuspensie voor in een microcentrifugebuis van 1,5 ml per elke 96-putplaat die gepland is om te worden gezaaid als meerdere 96-wellplaten in het experiment zijn opgenomen.
OPMERKING: Experimenteel overschot en afzonderlijke aliquots per gezaaide 96-well plaat zijn nodig om rekening te houden met de verhoogde experimentele bias als gevolg van het hanteren van BME2. - Aliquotcellen uit de eencellige suspensie zoals berekend (stap 2.2.3) na zorgvuldige resuspensie door op en neer te pipetteren. Pelletcellen bij 600 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder de media voorzichtig met een P200-pipet zonder de celkorrel aan te raken. Plaats de celkorrel kort op ijs (~ 1 min) en resuspend de celkorrel in BME2.
OPMERKING: Restmedia kunnen de structuur en stijfheid van BME2 in gevaar brengen. Pipetteer alle media zorgvuldig af. Plaats cellen kort op ijs om de celkorrel te laten acclimatiseren en laat cellen opnieuw worden gesuspendeerd in BME2 zonder te klonteren. Houd BME2 constant op ijs om het in de vloeibare toestand te houden. Voor één 96-well plaat is 400 μL BME2 nodig voor resuspensie van de celkorrel. Resuspend celkorrels zorgvuldig, waarbij de introductie van bubbels wordt vermeden. - Kantel je voorverwarmde zwarte, heldere 96-well plaat naar je toe. Plaatcellen met 5 μL celsuspensie per put en zaaicelkoepels op de positie van 6 uur van elke put (figuur 1A). Zaai de celkoepels in de resterende binnenputten (kolommen 2-10 en rijen B-G van een 96-putplaat).
OPMERKING: Omgekeerd pipetteren18 wordt aanbevolen bij het hanteren van BME2. - Verplaats de 96-putplaat niet en incubeer vers gezaaide celkoepels in de celkweek laminaire stroomkap gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verplaats vervolgens de plaat naar de celkweekincubator en incubeer deze gedurende 10 minuten bij 37 °C.
- Voeg voorzichtig 100 μL GM per put toe aan alle putten met organoïden (kolommen 2-10 en rijen B-G van een 96-putplaat). Voeg 100 μL PBS toe aan de buitenste putjes aan de rand van de plaat.
- Cultuur BME2 ingebed organoïden in GM media bij 37 °C in de celkweek incubator gedurende een totaal van 7 dagen. Inspecteer de groei van organoïden regelmatig onder de lichtmicroscoop.
OPMERKING: Raadpleeg figuur 1B en aanvullende tabel 1 voor een voorbeeld van de verwachte groeivoortgang vanaf het zaaien tot de dag van de behandeling. - Verander de media eenmaal na 3-4 dagen cultuur: draai de plaat met de klok mee 180 ° (organoïden nu op 12 uur positie), aspirateer GM voorzichtig vanuit de tegenovergestelde positie naar organoïde koepel met behulp van een meerkanaals apparaat indien beschikbaar, en voeg vervolgens verse GM toe.
- Verwarm een nieuwe zwarte, heldere bodemplaat met 96 putten op 37 °C gedurende 10 minuten in de celkweekincubator.
3. Medicamenteuze behandeling
- Bereid een seriële geneesmiddelverdunning in LGM voor het geneesmiddel van keuze, bijvoorbeeld osimertinib, voor de behandeling van EGFR-mutante NSCLC-organoïden. Neem een negatieve controle op (LGM media + 0,1% DMSO). Bereid voldoende medicijnsupplementen van alle doses voor op basis van het aantal gezaaide putten plus experimenteel overschot.
OPMERKING: Een verdunningsreeks inclusief ≥8 doses en variërend van 1 nM-10 μM wordt aanbevolen voor gerichte remmers. - Draai de organoïdeplaat 180° met de klok mee (organoïden nu op 12 uur positie). Aspirateer GM voorzichtig met behulp van een meerkanaals apparaat bij voorkeur.
OPMERKING: Vermijd het aanraken van de organoïde koepel tijdens het aanzuigen van de GM, omdat dit kan leiden tot verlies van organoïde biomassa en impactresultaten. - Voeg 100 μL controle (bijv. LGM-media + 0,1% DMSO) of geneesmiddeloplossing per putje toe.
OPMERKING: Raadpleeg figuur 1C voor het behandelingsschema voor drugsescalatie in 96-well plaatformaat. - Incubeer behandelde organoïden bij 37 °C in de celkweekincubator gedurende 5 dagen.
4. Uitlezing door luminescentie-gebaseerde overlevingstest
- Oogst- en overlevingsuitlezing
- Voer de overlevingstest uit volgens Reference19.
- Ontdooi reagens (zie Materiaaltabel) 's nachts bij 4 °C. Breng reagens voor gebruik gedurende 30 minuten in een waterbad op kamertemperatuur in evenwicht en meng door om te keren.
- Voeg een gelijk volume van het reagens toe aan elke put (100 μL per put). Meng grondig door op en neer te pipetteren, waarbij de pipetpunt op de plaats van de organoïde koepel wordt geplaatst. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Breng met behulp van een meerkanaalspijlpet ongeveer 75% (150 μL) van het lysaat (stap 4.1.1.2) over op een nieuwe witte, ondoorzichtige bodemplaat met 96 putten.
OPMERKING: Het overbrengen van 75% van de lysaten naar een nieuwe plaat zorgt voor de afwezigheid van bellen in de latere uitlezing zonder de testgevoeligheid te beïnvloeden. - Incubeer nog eens 25 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Registreer luminescentie met behulp van een ELISA-plaatlezer (integratietijd 0,25-1 s/per put) (zie Materialentabel).
- Sla gegevens op in een geschikt formaat, bijvoorbeeld een gegevenstabel met alle onbewerkte leesbewerkingen en registratie van de plaatlay-out en de gebruikte geneesmiddelen.
- Voer de overlevingstest uit volgens Reference19.
- Data-analyse met behulp van statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen)
- Maak een nieuwe XY-tabel en voeg gegevens in een XY-indeling in: Rijen (X) zijn negatieve controle gevolgd door escalerende medicijndoses, met doses als log [Inhibitor] in molaire concentratie. Kolommen (Y) zijn uitleeswaarden die replicaties bevatten die samen met kolommen zijn gestapeld.
OPMERKING: De concentratie van de negatieve controle moet worden aangegeven als een minimale waarde (gegeven 0 is niet mogelijk in logschaal), bijvoorbeeld log [Inhibitor], M = -10. - Normaliseer waarden door Analyseren > Normaliseren te selecteren en de volgende parameters te gebruiken: normaliseer elke subkolom afzonderlijk, Y = 0 als 0 %, "laatste waarde in elke subkolom (of eerste, afhankelijk van wat groter is)" als 100 %, resulteert in percentages, grafiek de resultaten.
- Pas de niet-lineaire regressiecurve aan op genormaliseerde gegevens door Analyse > XY-analyses > Niet-lineaire regressie > Dosisrespons - Inhibitie > log (inhibitor) vs . genormaliseerde respons - Variabele helling te selecteren.
- Rapporteer resultaten als een tabel van IC50-waarden die zijn uitgevoerd na niet-lineaire regressieanalyse en grafiek van de responscurve inclusief genormaliseerde gegevenspunten als gemiddelde +/- standaarddeviatie en aangepaste regressiecurve.
- Maak een nieuwe XY-tabel en voeg gegevens in een XY-indeling in: Rijen (X) zijn negatieve controle gevolgd door escalerende medicijndoses, met doses als log [Inhibitor] in molaire concentratie. Kolommen (Y) zijn uitleeswaarden die replicaties bevatten die samen met kolommen zijn gestapeld.
Representative Results
Aanzienlijke uitdagingen bij het vaststellen van NSCLC-organoïden zijn opgemerkt7. Het is dus opwindend om recent werk te zien dat longkankerorganoïden vaststelt en ze gebruikt voor geneesmiddelenbehandelingstests20,21,22. EGFR-mutaties zijn goed voor 11,3% van de NSCLC-gevallen23. Gerichte behandeling met EGFR-remmers vertegenwoordigt de eerstelijnsbehandelingsoptie in EGFR-mutant NSCLC en heeft de algehele overleving en behandelingsveiligheid bij patiënten verbeterd24. Dit werk bepaalde de gevoeligheid voor de door de FDA goedgekeurde EGFR tyrosinekinaseremmer osimertinib24,25 in EGFR-mutante NSCLC-organoïden. EGFR-mutante NSCLC-organoïden werden gegenereerd uit chirurgische resectie- of tumorbiopsiemonsters van NSCLC-patiënten en bevestigden de geïndiceerde oncogene mutatie te herbergen door DNA-sequencing. Zoals hierboven beschreven, werden EGFR-mutante NSCLC-organoïdemodellen behandeld met escalerende doses osimertinib en PDO-levensvatbaarheid beoordeeld door luminescentie-gebaseerde celoverlevingsuitlezing vijf dagen na de start van de behandeling. Terwijl EGFR-mutant (EGFRdel19)-positieve TH107-organoïden gevoeligheid vertoonden voor behandeling met osimertinib met een half-maximale remmende concentratie (IC50) van 56 nM (figuur 2A), waren EGFR-mutant (EGFRL858R)-positieve TH116-organoïden resistent tegen behandeling met osimertinib met een IC50 van meer dan 1 μM (figuur 2B). De gevoeligheid van EGFRdel19-positieve TH107 NSCLC ging gepaard met significante transcriptionele veranderingen, waaronder een vermindering van de expressie van celcyclus-geassocieerde genhandtekeningen en een toename van de expressie van apoptose-geassocieerde genhandtekeningen (aanvullende figuur 2A,B). Als referentie worden responsgegevens voor de gevoelige EGFRdel19-positieve NSCLC-cellijn PC9 gepresenteerd (figuur 3A,B). Dit laatste omvat overlevingsanalyse tot escalerende doses osimertinib door een op 2D-luminescentie gebaseerde overlevingstest (figuur 3A) en de studie van signaleringsonderdrukking op het niveau van EGFR-MAPK-signalering door Western blot (figuur 3B). Over het algemeen benadrukken deze gegevens de nauwkeurigheid van het huidige protocol voor het bepalen van de respons op geneesmiddelen en het onderscheid tussen gevoelige en resistente NSCLC PDO-modellen. Verdere analyses van EGFRL858R-positieve TH116 organoïde en beschikbare klinische monsters zijn nodig om mogelijke resistentie-geassocieerde veranderingen te bepalen.
Figuur 2: Behandelingsresponscurve van EGFR-mutante NSCLC-organoïdemodellen op escalatie van osimertinib. (A) Osimertinibrespons in het gevoelige EGFRdel19-positieve TH107 NSCLC-organoïdemodel. (B) Osimertinibrespons in het resistente EGFRL858R-positieve TH116 NSCLC organoïde model. Gegevenspunten worden gepresenteerd als genormaliseerde waarden die de gemiddelde +/- standaarddeviatie weergeven, met een niet-lineaire regressiecurve die door de gegevens is gepast. TH107, n = 6 technische replicaties per datapunt. TH116, n = 4 technische replicaties per datapunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijkende gegevens voor de behandelingsrespons op osimertinib in een gevoelige EGFR-mutante NSCLC-cellijn en organoïde modellen gekweekt in verschillende media. (A) Osimertinibrespons in de gevoelige EGFRdel19-positieve NSCLC-cellijn PC9, bepaald door standaard 2D-CTG-assay. (B) Signaalonderdrukking in de PC9-cellen na tweedaagse behandeling met osimertinib (2 μM). (C) Osimertinibrespons in de gevoelige EGFRL858R-positieve TH330 NSCLC organoïde modelcultuur in LGM en GM media. (D) Osimertinibrespons in het resistente AZ021 NSCLC-organoïdemodel in LGM- en GM-media. Bevestiging van de oncogene EGFRL858R-mutatie in AZ021 faalde en kan oorzakelijk zijn voor het ontbreken van osimertinibrespons. Voor A en C-D worden gegevenspunten gepresenteerd als genormaliseerde waarden die de gemiddelde +/- standaarddeviatie weergeven, met een niet-lineaire regressiecurve die door de gegevens is gepast. PC9, n = 3 technische replicaties per datapunt. TH330, n = 5 technische replicaties per datapunt. AZ021, n = 6 technische replicaties per datapunt. Een Wilcoxon-rangtest werd uitgevoerd op genormaliseerde gegevens om de statistische significantie te bepalen. Voor TH330 (C), LGM vs. GM, ** p = 0,0078. Voor AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Representatieve celanalysatorresultaten voor de beoordeling van de tel- en levensvatbaarheid van EGFR-mutante organoïdemodellen. TH107 en TH107BC verwijzen naar verschillende organoïde modellen en A en B naar biologische replicaties. Voor elk model en elke biologische replicatie worden drie technische replicaties geteld; ze vertonen allemaal ≥95% levensvatbaarheid. Een representatief beeld tijdens het tellen van cellen wordt aan de rechterkant weergegeven, met robuuste levensvatbaarheid en eencellige dissociatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Gensetverrijkingsanalyse (GSEA) met behulp van bulk RNA-sequencinggegevens verkregen voor EGFR-mutant TH107 NSCLC-organoïden, waarbij onbehandelde controle (DMSO) en cellen behandeld met Osimertinib gedurende 3 dagen (OSI_D3) worden vergeleken. (A-B) Na gerichte behandeling zullen gevoelige cellen celcyclus G1-arrestatie ondergaan en de actieve proliferatie staken. Aangezien een expressie van G2M-celcyclusgenen geassocieerd is met actieve proliferatie, wordt een nominale verrijking van expressie in de onbehandelde controle (DMSO) verwacht. Voor apoptose-gerelateerde genen wordt een nominale verrijking in behandelde cellen (OSI_D3) verwacht. Beide zijn bevestigd in het EGFR-mutant TH107 NSCLC organoïde model behandeld met Osimertinib: (A) GSEA voor Hallmark G2M expression signature (links) toont verrijking in dmso-behandelde cellen. Nominale verrijkingsscore (NES): +1.708, FDR < 0.0001. (B) GSEA for Hallmark Apoptosis expression signature (rechts) toont verrijking in met Osimertinib behandelde cellen. NES: -1,075, FDR: ns, 0,3275. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Combinatorische medicamenteuze behandeling in EGFR-mutant TH330 organoïde model behandeld met Osimertinib escalatie in aanwezigheid van een tweede additieve remmer in een vaste concentratie. Resistentie-geassocieerde veranderingen in EGFR-mutant NSCLC, d.w.z. SRC- en AXL-activering26,27,28, waren farmacologisch gericht door combinatorische behandeling met SRC-remmer Saracatinib (100 nM) of AXL-remmer R428 (500 nM), n = 6 technische replicaties per gegevenspunt. Beide combinatorische behandelingen resulteerden in een verhoogde behandelingsrespons, met betekenis voor de combinatie van Osimertinib met SRC-remmer Saracatinib. Statistische significantie werd geëvalueerd door Wilcoxon rank test: Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Verandering van organoïdegrootte van zaaien (d0) tot 7 dagen na de behandeling (d7). (A) Groeiontwikkeling in EGFRdel19-positieve NSCLC-organoïde TH107. (B) Groeiontwikkeling in EGFRL858R-positieve NSCLC-organoïde TH330. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Dit manuscript ontwikkelt en beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor het beoordelen van medicijngevoeligheid in NSCLC-afgeleide 3D PDO-modellen. Naast geneesmiddelengevoeligheidsstudies is verdere karakterisering van beschikbare organoïdemodellen nodig om de onderliggende oorzaken voor verschillen in geneesmiddelgevoeligheid te bepalen. Dit kan genetische profilering van organoïden en patiëntmonsters en andere beschikbare analyses voor organoïden omvatten, zoals immunohistochemische kleuring voor differentiatiemarkers en algemene cellulaire signaleringsbiomarkers en fysiologie13,29.
Kritieke stappen in het protocol
Het protocol dat hierin wordt beschreven, biedt een gestandaardiseerde workflow die nauwkeurige en reproduceerbare analyse van de gevoeligheid van geneesmiddelen mogelijk maakt wanneer deze zorgvuldig wordt gevolgd. Bijzondere voorzichtigheid is geboden bij de volgende stappen: TrypLE- en DNAse I-vertering tijdens het genereren van eencellige suspensies, zaaien van eencellige suspensies in BME2, monitoring van organoïdegroei tot behandeling, mediaveranderingen en verstoring en lysis van BME2 ingebedde organoïden tijdens luminescentie-gebaseerde celoverlevingsuitlezing. (1) Hoewel aanvullende DNAse I-vertering na tryple-gebaseerde dissociatie van organoïden niet essentieel is voor het uitbreiden van organoïdemodellen tijdens regulier kweekonderhoud, mag DNAse I-vertering niet worden weggelaten bij het zaaien voor experimenten met medicijnescalatie, omdat dit zorgt voor een betere scheiding van organoïdeclusters in eencellige suspensies en nauwkeurige celtelling. (2) Het zaaien van eencellige suspensie in BME2 is een cruciale stap gezien de stolling van BME2 bij kamertemperatuur. Er moeten dus maximaal 1-2 rijen tegelijk worden gezaaid en monsters moeten op ijs worden geplaatst voordat extra rijen worden gezaaid. Van belang is dat cellen op en neer moeten worden gepipetteerd wanneer het zaaien wordt voortgezet om een homogene celsuspensie mogelijk te maken. (3) Organoïde groei moet zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens de 7-daagse uitbreiding van zaaien tot behandeling. Een voorbeeld van de verwachte ontwikkeling is te zien in figuur 1B en aanvullende tabel 1. Van belang is dat het beoordelen van veranderingen in organoïdegrootte door middel van brightfield-microscopie en beeldanalyse zoals weergegeven in figuur 1B een nauwkeurige evaluatie van verschillen in organoïdegroei en verdubbelingstijden mogelijk kan maken. Verdubbelingstijden kunnen een impact hebben op de respons op drugs, zoals onlangs besproken in de literatuur30. Als de organoïdegroeisnelheid het gepresenteerde voorbeeld aanzienlijk overschrijdt, kan een kortere expansietijd tot het begin van de behandeling en een kortere behandelingsduur worden overwogen. (4) Bovendien moet bijzondere aandacht worden besteed aan het veranderen van media om aanzuigende organoïden te voorkomen. De zaaipositie van BME2 ingebedde organoïden op de 6 uur positie zorgt voor een veilige aspiratie van media wanneer platen met de klok mee 180 ° worden gedraaid en media worden geaspireerd op de tegenovergestelde positie van de organoïden. (5) Ten slotte is een grondige lysis van in BME2 ingebedde organoïden tijdens de overlevingsuitlezing essentieel om nauwkeurige resultaten vast te leggen. Volgens de instructies van de fabrikant moeten monsters herhaaldelijk op en neer worden gepipetteerd, idealiter met behulp van ongefilterde tips, om een goede lysis te garanderen. Incubatietijden moeten worden gevolgd zoals beschreven. Verder zorgt het overbrengen van 75% van het lysaat (in plaats van het totale volume) naar een witte, ondoorzichtige bodemplaat met 96 putten voor de uiteindelijke uitlezing met behulp van een ELISA-plaatlezer voor een passende beoordeling, omdat dit hetzelfde volume in elke put garandeert en de afwezigheid van luchtbellen die kunnen worden geïntroduceerd door krachtig pipetteren.
Van belang is dat profilering van geneesmiddelresponsen in BME2-ingebedde organoïdeculturen een hogere standaarddeviatie kan vertonen dan waargenomen in reguliere cellijnculturen (figuur 2, figuur 3A). De hogere standaarddeviatie is gebaseerd op verschillende factoren, waaronder een verhoogde kans op kleine variaties in het zaaien bij het werken met BME2 en verschillen in individuele organoïde groeisnelheden tussen putten gedurende de initiële groeiperiode van 7 dagen. Er moeten dus gelijke of meer dan vier technische replicaties per geneesmiddelconcentratie worden gezaaid.
Het belangrijkste is dat de aanwezigheid van kwaadaardige cellen die de oncogene drivermutatie dragen en beperkte besmetting door normale luchtwegepitheelcellen zorgvuldig moeten worden geëvalueerd. Uitdagingen bij NSCLC-vestiging kunnen de uitgroei van normale luchtwegepitheelcellen bevorderen7. Copy number profiling of PCR- en sequencing-gebaseerde benaderingen om de aanwezigheid van de oncogene drivermutaties te bevestigen zijn de voorkeursmethoden om de kwaliteit van NSCLC-organoïde culturen te waarborgen.
Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Media en respectievelijke groeifactoren die worden toegevoegd aan basismedia-oplossingen kunnen de respons van geneesmiddelen op gerichte remmers aanzienlijk beïnvloeden. Ze activeren bypass-receptoren en signaalroutes die de respons van geneesmiddelen beïnvloeden en beperken (bijv. FGF, HGF, EGF)26. Hoewel een groeifactorrijke en op maat gemaakte media optimaal kan zijn voor het uitbreiden van de organoïdecultuur, moeten medicijnescalatie- en gevoeligheidsbeoordelingen worden uitgevoerd in een media met verminderde groeifactor, zoals hierboven beschreven. Dit is gebaseerd op interne ervaring met het vergelijken van verschillende mediaformuleringen en geneesmiddelresponsgegevens (figuur 3C). Hoewel media-oplossingen de mate van gevoeligheid voor bepaalde medicamenteuze behandeling kunnen beïnvloeden en IC50-waarden kunnen verschuiven, zijn robuuste fenotypen van gevoeligheid of resistentie duidelijk, ongeacht de mediaformulering (figuur 3C, D). Bovendien wordt algemene consistentie in de mediaformulering en profilering van geneesmiddelresponsen in organoïde culturen aanbevolen en moet een gelijke of meer dan vier technische replicaties per concentratie worden gezaaid. Dit is met name belangrijk om bandbreedtes in gevoeligheid versus. resistentie voor de remmer van belang.
Beperkingen van de methode
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de gevoeligheid van NSCLC 3D-kankerorganoïdemodellen voor gerichte remmers wanneer van de patiënt afgeleide kankercellen worden gekweekt. Aanvullende experimenten, waaronder farmacodynamische analyse met betrekking tot pathway-inhibitie en sequencinganalyse voor de aanwezigheid van het driver-oncogen en secundaire mutaties, zijn nodig voor een gedetailleerde karakterisering van geneesmiddelresistentie en gevoeligheid. Verder worden omstanderfactoren zoals micromilieustimuli afgeleid van interacties of uitgescheiden factoren door niet-kanker omstandercellen in de tumormicro-omgeving niet meegenomen en zijn nieuwe protocollen nodig wanneer co-kweek organoïde modellen met immuun- of stromale cellen worden geprobeerd. Recent werk heeft het gebruik van organoïde modellen benadrukt om tumormicro-omgevingsinteracties en profielresponsen op immuuncheckpointremmers, zoals anti-PD-L1-behandeling13,31, samen te vatten.
De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande / alternatieve methoden
3D kanker organoïde modellen recapituleren de genetische diversiteit en determinanten van de behandelingsrespons aanwezig in de oorspronkelijke tumor4,5,6. Met name ruimtelijke en temporele heterogeniteit kan tumorevolutie bevorderen, en parallelle opkomst en de sequentiële ontwikkeling van tumorsubklonen kunnen optreden32,33. Intratumor heterogeniteit is significant voor de selectie van meer veerkrachtige tumorcellen onder therapeutische druk9,34,35. Het protocol dat hier wordt verstrekt, maakt een snelle beoordeling mogelijk van gevoeligheden voor behandeling met gerichte remmers in patiënt-nabije monsters. Organoïdemodellen hebben dus voordelen ten opzichte van meer conventionele homogene cellijnmodellen zonder genetische diversiteit of langetermijnstudies met cellijnen of van de patiënt afgeleide xenografts. Verder maakt het huidige protocol het mogelijk om op te schalen naar meerdere behandelingsarmen en gecombineerde behandelingsbenaderingen met weinig beperkingen met betrekking tot kosten en analytische capaciteit. Als zodanig maakt het toevoegen van een tweede geneesmiddel van belang in een vaste dosis, terwijl de primair gerichte remmer wordt geëscaleerd en vergeleken met de escalatie van de primair gerichte remmer alleen, een efficiënte evaluatie van de potentiële combinatorische effecten en met minimale extra biomassa die nodig is (aanvullende figuur 3). Vergeleken met op beeldvorming gebaseerde beoordelingen die worden gebruikt om de ontwikkeling van organoïden en de respons op geneesmiddelen te volgen, heeft de hier beschreven op luminescentie gebaseerde celoverlevingstest een vergelijkbare gevoeligheid met minimale apparatuur en vereiste training.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Het ontwikkelen van een gestandaardiseerde pijplijn die het mogelijk maakt om kankerorganoïde modellen op te stellen van patiëntmonsters en de daaropvolgende medicijngevoeligheden profilering heeft een aanzienlijk klinisch toepasbaarheidspotentieel. Ex vivo farmacologische profilering heeft erkenning gekregen bij het detecteren van kwetsbaarheden en resistente kenmerken in tumoren, correlerend met de behandelingsrespons bij patiënten36,37. Het is veelbetekenend dat ex vivo profilering van geneesmiddelgevoeligheden kan helpen bij de selectie van behandelingen in de kliniek en het ontwerp van rationele combinatiebehandelingen die resistentiemechanismen aanpakken. Over het algemeen kan deze aanpak helpen om verbeterde gepersonaliseerde strategieën voor moleculaire therapie of combinatorische behandelingsregimes mogelijk te maken. Dit laatste kan helpen om de tolerantie- en resistentiemechanismen van geneesmiddelen vroegtijdig aan te pakken en de klinische respons te verdiepen om de resultaten van de patiënt in de toekomst te verbeteren.
Disclosures
T.G.B. is adviseur van Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences en ontvangt onderzoeksfinanciering van Novartis, Strategia, Kinnate en Revolution Medicines.
Acknowledgments
We danken de laboratoria van Jeroen P Roose (UCSF) en Calvin J Kuo (Stanford) voor hun inbreng met betrekking tot organoïde cultuur en protocolontwikkeling. Verder bedanken we Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) voor protocollen en input voor het opzetten van monsters. Dit onderzoeksproject werd uitgevoerd met steun van de NIH [U54CA224081]. F. Haderk werd ondersteund door de Mildred Scheel postdoctorale fellowship van de German Cancer Aid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
| A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
| B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
| BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
| BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
| Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
| Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
| GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
| hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
| hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
| hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
| hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
| Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
| Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
| Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
| Multichannel pipette | |||
| N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
| Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
| Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
| Pipettes (different sizes) | |||
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
| SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
| Vacuum pump and tubing | |||
| Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |
References
- de Bono, J. S., Ashworth, A. Translating cancer research into targeted therapeutics. Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Dijkstra, K. K., et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Reports. 31 (5), 107588 (2020).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Bivona, T. G., Doebele, R. C. A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers. Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Tashiro, T., et al. In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer. PLoS One. 12 (3), 0174151 (2017).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Hysenaj, L., et al. SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator. bioRxiv. , (2021).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Promega Corporation. CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay. Promega Corporation. , (2021).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communication. 10 (1), 3991 (2019).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communication. 12 (1), 2581 (2021).
- Shi, R., et al. Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).
- Collisson, E. A., et al. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).
- Ramalingam, S. S., et al. Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC. New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).
- Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).
- Rotow, J., Bivona, T. G. Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC. Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).
- Zhang, Z., et al. Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer. Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).
- Kanda, R., et al. Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling. Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).
- Bruun, J., et al. Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity. Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. Organoid models of tumor immunology. Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Rambow, F., et al. Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma. Cell. 174 (4), 843-855 (2018).
- Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer. Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).
- Frismantas, V., et al. Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia. Blood. 129 (11), 26-37 (2017).
- Drusbosky, L. M., et al. Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study. Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).
