糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因之一。组织学、血-视网膜屏障破坏检测以及荧光血管造影是研究视网膜病理生理学的宝贵技术，这些技术可进一步提高针对糖尿病视网膜病变的高效药物筛选能力。
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本文内容
摘要
摘要
糖尿病视网膜病变等后节眼病会改变视网膜的生理状态。糖尿病视网膜病变的特征包括视网膜脱离、血-视网膜屏障（BRB）破坏以及视网膜血管新生。在体大鼠模型是研究视网膜结构与功能变化的重要实验工具。我们提出在大鼠模型中采用三种不同的实验技术，以识别视网膜细胞的形态学变化、视网膜血管系统以及受损的BRB。视网膜组织学用于研究各类视网膜细胞的形态；同时通过视网膜细胞计数及不同视网膜层厚度测量进行定量分析。BRB破坏检测用于评估因BRB破坏导致的血浆蛋白向玻璃体组织的渗漏情况。荧光血管造影则通过使用FITC-葡聚糖染料对视网膜血管系统进行可视化，以研究血管新生及血管渗漏情况。
引言
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最复杂的继发性并发症之一，也是全球劳动年龄人群中可预防性失明的首要原因。在一项近期针对3240万名盲人的荟萃分析中，有83万人（2.6%）因糖尿病视网膜病变而失明1。2015年，全球范围内由糖尿病导致的视力丧失占比为1.06%（0.15–2.38），位居第七位2,3。
糖尿病视网膜病变通过眼后部组织的血管异常进行诊断。临床上根据视网膜的血管状况将其分为两个阶段：非增殖性糖尿病视网膜病变（NPDR）和增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）。高血糖被认为是糖尿病视网膜病变的主要调控因素，因为它涉及多种与视网膜神经退行性变4,5、炎症6,7以及微血管系统8相关的通路。由高血糖引发的多种代谢紊乱包括晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累、多元醇通路、氨基己糖通路以及蛋白激酶C通路。这些通路在糖尿病视网膜病变的不同阶段分别导致细胞增殖（内皮细胞）、细胞迁移（周细胞）以及细胞凋亡（视网膜神经细胞、周细胞和内皮细胞）。这些代....
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方案
本方案遵循印度 BITS-Pilani 海得拉巴校区机构动物伦理委员会提供的所有动物护理指南。
1. 视网膜组织学
- 眼球去核与固定
- 通过腹腔注射高剂量戊巴比妥（150 mg/kg）处死一只2至3月龄的糖尿病雄性Wistar大鼠，同时处死年龄匹配的对照组大鼠（14至15周龄）。注射后2-5分钟内心跳不可检测即确认死亡。
- 使用手术刀片在眼球的鼻侧和颞侧区域做切口，然后用镊子和显微剪刀沿边缘剪开，将眼球从眼眶中摘除。
注意：在处死大鼠前，应提前准备好固定液。
警告：甲醛对皮肤、眼睛、鼻腔和呼吸道具有刺激性，且因其为强效皮肤致敏剂，可能致癌。操作时应佩戴手套，并在通风橱中进行21。 - 将眼球置于培养皿中，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）充分清洗以去除血液。清除眼球周围多余的脂肪组织，以利于固定液充分渗透。
- 用镊子立即将眼球放入5 mL固定液中，确保其不粘附于玻璃瓶壁。轻轻搅动数秒后盖上瓶盖并做好标记。在室温避光条件下，将眼球在固定液中孵育24至48小时。
- 组织修整
- 固定完成后，将眼球从固定液中取出，用10 mL PBS清洗，然后置于含有10 mL、4 °C预冷PBS的培养皿中。 ....
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结果
视网膜组织学
在糖尿病视网膜中，视网膜细胞会发生变性。此外，由于水肿，视网膜各层的厚度会增加22。通过苏木精和伊红染色后获得的图像可用于细胞计数以及测量不同视网膜层的厚度，如图2中使用ImageJ所示。
血-视网膜屏障破坏检测
由于糖尿病大鼠的血-视网膜屏障（BRB）受到破坏，屏障通透性显著增加，导致血浆中的生物分子渗漏并积聚于视网膜和玻璃体中。与健康大鼠相比，糖尿病大鼠血浆向玻璃体的蛋白质渗漏量约高出三倍（图3）。蛋白质含量可采用任意试剂盒方法进行测定，例如Lowry法、双辛可宁酸（BCA）法或Bradford法（本文第2.3节中提及）。建议新鲜解剖眼球，因为处理延迟可能导致玻璃体与视网膜之间发生强粘连，难以分离。若玻璃体与视网膜分离不当，可能导致假阳性结果。
.......
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讨论
组织学
视网膜组织学用于观察视网膜细胞和各层结构的形态学变化。多个步骤需要优化，包括固定液的选择、固定时间、脱水以及石蜡浸润。组织大小不应超过3 mm，否则固定液渗透速度会变慢。常用的4%多聚甲醛由于其渗透压相对房水和玻璃体较高，即使在健康眼内也可能导致视网膜脱离，从而产生假阳性结果23。该溶液的高渗透压会导致体积收缩，引起组织皱缩。本方案所用的固定液为含1.25%戊二醛的1%甲醛溶液，其渗透压相对较低，可减少组织变形，最小化视网膜与视网膜色素上皮层之间的脱离，并更好地保持组织的天然结构。另一种可选的固定液是含有甲醛的乙酸和乙醇混合液。酸性环境有助于组织快速固定，而乙醇则可增强固定液的渗透能力。然而，乙醇与乙酸的比例必须优化，因为浓度过高可能分别导致组织皱缩或肿胀24。评估组织固定效果的关键参数包括是否存在视网膜脱离、视网膜各层是否完整以及组织是否发生收缩。固定过程中另一个关键因素是固定液的体积，应至少为眼球体积的20至25倍，以确保充分固定25。此.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢印度医学研究委员会（ICMR；ITR-2020-2882）对Nirmal J.博士提供的资金支持。我们还 要感谢大学拨款委员会为Manisha Malani提供初级研究奖学金，以及感谢BITS-Pilani海得拉巴校区中央分析实验室设施提供的基础设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织学 | |||
| 试剂 | |||
| 异氟烷 | Abbott | 麻醉剂 | |
| 盐酸氯胺酮 | Troikaa Pharmaceuticals | 麻醉剂 | |
| 赛拉嗪 | Indian Immunologicals Limited | 麻醉剂 | |
| 戊巴比妥钠 | Zora Pharma | 安乐死试剂 | |
| 固定液（1% 甲醛，1.25% 戊二醛） | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | 自行配制 |
| 乙醇 | Hayman | F204325 | 脱水 |
| 二甲苯 | HiMedia | MB-180 | 乙醇或石蜡的透明化 |
| 石蜡 | HiMedia | GRM10702 | 用于组织包埋 |
| 甘油 | HiMedia | TC503 | 用于制备白蛋白包被载玻片。甘油与蛋清白蛋白按1:1比例混合后涂于载玻片 |
| 盐酸 | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | 用于配制1%酸性乙醇 |
| 乙酸 | HiMedia | AS119 | 用于配制伊红染液 |
| Scott水 | Leica | 3802900 | 蓝化试剂 |
| Papanicolaou溶液1b 苏木精溶液 | Sigma | 1.09254.0500 | 细胞核染色 |
| 伊红 | HiMedia | GRM115 | 细胞质染色，0.25%溶液为自行配制 |
| DPX封片介质 | Sigma | 6522 | 视网膜切片的观察与保护 |
| 仪器设备 | |||
| 玻璃器皿 | Borosil | ||
| 角膜镊 | Stephens Instruments | S5-1200 | 解剖 |
| Colibri镊 | Stephens Instruments | S5-1135 | 解剖 |
| 弯头显微剪 | Stephens Instruments | S7-1311 | 解剖 |
| Vannas剪 | Stephens Instruments | S7-1387 | 解剖 |
| 虹膜剪 | Stephens Instruments | S7-1015 | 解剖 |
| 包埋盒 | HiMedia | PW1292 | 组织在组织学处理过程中用于固定组织 |
| 水浴锅 | GT Sonic | GT Sonic-D9 | 温度维持 |
| 石蜡包埋工作站 | Myr | EC 350 | 石蜡块制备 |
| 切片机 | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | 切片 |
| 刀片 | Leica | Leica 818 | 切片 |
| 载玻片 | HiMedia | BG005 | 承载石蜡-组织切片 |
| 盖玻片 | HiMedia | BG014C | 加入封片介质后覆盖组织 |
| 血-视网膜屏障破坏 | |||
| 试剂 | |||
| 异氟烷 | Abbott | B506 | 麻醉 |
| 干冰 | 不适用 | 不适用 | 解剖 |
| Bradford试剂 | Sigma | B6916 | 蛋白质定量 |
| 仪器设备 | |||
| 角膜镊 | Stephens Instruments | S5-1200 | 解剖 |
| Colibri镊 | Stephens Instruments | S5-1135 | 解剖 |
| 弯头显微剪 | Stephens Instruments | S7-1311 | 解剖 |
| Vannas剪 | Stephens Instruments | S7-1387 | 解剖 |
| 虹膜剪 | Stephens Instruments | S7-1015 | 解剖 |
| 玻璃器皿 | Borosil | 不适用 | |
| EDTA抗凝管 | J.K Diagnostics | 不适用 | 从全血中分离血浆 |
| 匀浆管 | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | 玻璃体匀浆 |
| 匀浆管帽 | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | 玻璃体匀浆 |
| 玻璃珠 | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | 玻璃体匀浆 |
| 匀浆仪 | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | 玻璃体匀浆 |
| 96孔板 - 透明 | Grenier | GN655101 | 蛋白质定量 |
| 酶标仪 | Molecular devices | SpectrMax M4 | 吸光度测定 |
| 离心机 | REMI | CPR240 Plus | 离心 |
| 荧光血管造影 | |||
| 试剂 | |||
| 异氟烷 | Abbott | B506 | 麻醉 |
| FITC-葡聚糖 70 kD（FITC、葡聚糖、二丁基二月桂酸锡、DMSO） | FITC、葡聚糖和二丁基二月桂酸锡来自Sigma；DMSO来自HiMedia | FITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | 自行配制 |
| Fluoroshield | Sigma | F6182 | 抗荧光淬灭封片介质 |
| 仪器设备 | |||
| 角膜镊 | Stephens Instruments | S5-1200 | 解剖 |
| Colibri镊 | Stephens Instruments | S5-1135 | 解剖 |
| 弯头显微剪 | Stephens Instruments | S7-1311 | 解剖 |
| Vannas剪 | Stephens Instruments | S7-1387 | 解剖 |
| 虹膜剪 | Stephens Instruments | S7-1015 | 解剖 |
| 玻璃器皿 | Borosil | 不适用 | |
| 载玻片 | HiMedia | BG005 | 平铺标本制备 |
| 盖玻片 | HiMedia | BG014C | 加入封片介质后覆盖组织 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | DMi8 | 平铺标本的观察 |
参考文献
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al.
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重印与许可
