Summary
Denne artikel præsenterer en metode til spatiotemporal analyse af mobile, enkelt-molekyle Förster resonans energioverførsel (smFRET)-baserede sonder ved hjælp af widefield fluorescens mikroskopi. Den nyudviklede software toolkit gør det muligt at afgøre smFRET tidsspor af bevægelige sonder, herunder den korrekte FRET-effektivitet og de molekylære positioner, som tidsfunktioner.
Abstract
Single-molecule Förster resonans energioverførsel (smFRET) er en alsidig teknik rapportering om afstande i sub-nanometer til nanometer rækkevidde. Det har været anvendt i en bred vifte af biofysiske og molekylære biologiske eksperimenter, herunder måling af molekylære kræfter, karakterisering af kropsbygningsdynamikken i biomolekyler, observation af intracellulær colocalization af proteiner og bestemmelse af receptor-ligand interaktionstider. I en widefield mikroskopi konfiguration, eksperimenter udføres typisk ved hjælp af overflade-immobiliserede sonder. Her præsenteres en metode, der kombinerer sporing af enkeltmolekyler med skiftevis excitation (ALEX) smFRET-eksperimenter, der tillader erhvervelse af smFRET-tidsspor af overfladebundne, men alligevel mobile sonder i plasmamembraner eller glasstøttede lipid-bilayers. Til analyse af registrerede data blev der udviklet en automatiseret, open source-softwaresamling, der understøtter i) lokalisering af fluorescerende signaler, (ii) sporing af enkeltpartikler, iii) bestemmelse af FRET-relaterede mængder, herunder korrektionsfaktorer, iv) streng verifikation af smFRET-spor og (v) intuitiv præsentation af resultaterne. De genererede data kan bekvemt bruges som input til yderligere udforskning via specialiseret software, f.eks. til vurdering af sondernes diffusion eller undersøgelse af FRET-overgange.
Introduction
Förster resonans energioverførsel (FRET) har været en vigtig drivkraft i molekylær biologisk og biofysisk forskning, da det giver mulighed for undersøgelse af processer ved sub-nanometer opløsning. Da effektiviteten af energioverførsel mellem donor og acceptorfluoripher i høj grad afhænger af den interfarvede afstand i sub-nanometeret til nanometerområdet, er det effektivt blevet brugt som spektroskopisk lineal til at udforske statisk og dynamisk kropsbygning af biomolekyler1,2,3,4. Derudover har FRET-fænomenet været meget udbredt til colocalization undersøgelser af membran-associerede og intracellulære proteiner på et bulkniveau5,6. I de sidste to årtier blev metoden tilpasset til overvågning af smFRET-hændelser7, hvilket bidrog til at øge den tidsmæssige og rumlige opløsning betydeligt og løste selv sjældne delpopulationer i heterogene prøver. Udstyret med disse teknikker blev der opnået unik indsigt i dynamikken i molekylære maskiner såsom udskriftsbehandlingshastigheden af RNA polymerase II8, replikationshastighed af DNA-polymeraser9,10, nukleosomtranslokationshastighed11, udskriftssplejsning og stallingshastighed af samlede splekom12, aktiviteten af ribosomale delpopulationer13 og kinesinmotorers ganghastighed14 , for at nævne nogle få. Receptor-ligand interaktion varigheder15 og molekylære kræfter16 er blevet kvantificeret.
Intensitetsbaserede smFRET-undersøgelser er typisk afhængige af sensibiliseret emission for at måle FRET-effektivitet: en strålekløver i emissionsvejen adskiller rumligt lys, der stammer fra donor- og acceptorfluoriorter ved donor excitation, hvilket giver mulighed for kvantificering af individuelle fluorescensintensiteter. Effektiviteten kan efterfølgende beregnes som den del af fotoner, der udsendes af acceptoren med hensyn til det samlede fotonantal17. Desuden tillader acceptor excitation efter donor excitation (ALEX) måling af stoichiometri af FRET begivenheder, medvirken i forskelsbehandlingen mellem ægte lave FRET signaler fra signaler, der opstår, f.eks fra sonder byder på en fotoblecheret acceptor fluorophore18.
Enkelt-molekyle FRET eksperimenter er almindeligt udført på en af to måder. For det første belyses et lille område i prøvevolumen ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Enkelt sonde molekyler i opløsning er begejstrede, når de tilfældigvis diffus inden for brændvolumen. Med denne teknik kan hurtige fotontællingsdetektorer bruges, hvilket muliggør submikrosekundtidsopløsning. For det andet er sonder specielt immobiliseret på overflader og overvåges via widefield mikroskopi, ofte ved hjælp af total intern refleksion (TIR) konfiguration for at minimere baggrund fluorescens. Sonde immobilisering giver mulighed for meget længere optagelsestider end ved hjælp af den første tilgang. Derudover tillader det større synsfelt overvågning af flere sonder parallelt. Behovet for et kamera gør denne metode langsom i forhold til den, der er beskrevet ovenfor. Tidsopløsningen er begrænset til millisekunderne til andet område.
Hvis der kræves spor i lang tid, f.eks. til at studere dynamiske processer på et millisekund til anden gangskala, er den første metode ikke relevant, da fluorescensudbruddene typisk er for korte. Den anden fremgangsmåde mislykkes, når immobilisering ikke er mulig, f.eks. i levende celleeksperimenter med sonder, der spredes i cellemembranen. Desuden er det blevet observeret, at biologiske modelsystemer kan variere deres respons dramatisk afhængigt af mobiliteten af den kontaktede overflade16.
Mens kombinerede smFRET og single-partikel tracking eksperimenter optagelse mobile FRET sonder er blevet udført i de seneste19, der er ingen offentligt tilgængelig software til evaluering af data. Dette førte til udviklingen af en ny analyseplatform, som giver mulighed for bestemmelse af flere egenskaber af mobile fluorescerende sonder, herunder smFRET-effektivitet og stoichimetri, positioner med nøjagtighed underpixel og fluorescensintensiteter som tidsfunktioner. Metoder til filtrering af de resulterende spor ved at undersøge trinvis blegning adfærd, nærmeste nabo afstande, emission intensiteter, og andre træk blev etableret for udelukkende at vælge korrekt syntetiseret og funktionelle enkelt-sonde molekyler. Softwaren understøtter også eksperimentelle og analytiske teknikker, der for nylig blev aftalt i en multilaboratorisk undersøgelse for at producere pålidelige, kvantitative smFRET-data17. Gennemførelsen overholder navnlig de validerede procedurer for beregning af FRET-effektivitet og stoichimetri. Fluorescensintensiteter ved donor excitation i donor emission kanal IDD og acceptor emission kanal IDA anvendes til beregning af den tilsyneladende FRET effektivitet Eapp ved hjælp af Eq (1).
(1)
Ved hjælp af fluorescensintensiteten i acceptoremissionskanalen ved acceptor excitation IAA beregnes den tilsyneladende stoichimetri ved hjælp af Eq (2).
(2)
FRET-effektivitet E og stoichiometri S kan udledes af Eapp og Sapp ved at overveje fire korrektionsfaktorer.
α beskriver udsivningen af donorfluescens i acceptoremissionskanalen og kan bestemmes ved hjælp af en prøve, der kun indeholder donorfluoriorter, eller ved at analysere dele af baner, hvor acceptoren er blevet bleget. δ korrigerer for donor excitation lyskildens direkte excitation og kan måles ved hjælp af en prøve med kun acceptorfluoriorter eller ved at analysere dele af baner, hvor donoren er blevet bleget.
.
γ skalerer IDD for at rette op på divergerende detektionseffektivitet i donor- og acceptoremissionskanaler og forskellige kvanteeffektiviteter i fluorophorerne. Faktoren kan beregnes ved at analysere stigningen i donorintensiteten ved acceptor blegning i baner med høj FRET effektivitet20 eller ved at studere en prøve byder på flere diskrete FRET stater.
β skalaer IAA til at korrigere for forskellige effektivitetsgevinster af donor og acceptor excitation. Hvis γ blev bestemt via acceptor blegning analyse, β kunne beregnes ud fra en stikprøve af kendte donor-til-acceptor ratio21. Ellers giver fret-prøven med flere stater også β.
Tilsammen gør korrektionerne det muligt at beregne den korrigerede FRET-effektivitet ved hjælp af Eq (3).
(3)
og den korrigerede stoichimetri ved hjælp af Eq (4).
(4)
Ideelt set giver den korrigerede stoichimetri for et 1:1 donor-til-acceptor-forhold S = 0,5. I praksis giver et reduceret signal-til-støj-forhold en spredning af de målte værdier af S, hvilket hæmmer forskelsbehandlingen fra donorsignaler (S = 1) og acceptorsignaler (S = 0). De resulterende tidsspor kan bruges som input til en mere detaljeret analyse af enkeltmolekylets baner for at få oplysninger som spatiotemporal kraftprofiler16, mobiliteten af enkeltmolekylehændelserne22 eller overgangskinetik mellem forskellige tilstande1.
Følgende protokol beskriver eksperimentelle parametre og procedurer for smFRET-sporingseksperimenter samt arbejdsprincippet bag dataanalyse ved hjælp af den nyudviklede softwarepakke. Ved erhvervelse af eksperimentelle data anbefales det at anvende en mikroskopiopsætning, der opfylder følgende krav: i) evne til at detektere emissionen af enkeltfarvemolekyler; ii) bredfeltsbelysning: navnlig for levende celleforsøg anbefales total intern refleksion (TIR23,24,25) konfiguration; iii) geografisk adskillelse af emissionslys i henhold til bølgelængde, således at donor og acceptor fluorescens projices på forskellige områder af samme kamerachip25 eller forskellige kameraer iv) graduering af lyskilder til donor og acceptor excitation med millisekunder præcision, f.eks ved hjælp af direkte modulatable lasere eller graduering via acousto-optiske modulatorer. Dette gør det muligt stroboskopisk belysning for at minimere fotobleaching af fluorophores samt vekslende excitation til bestemmelse stoichiometrier; v) output af én fil pr. optaget billedsekvens i et format, der kan læses af PIMS Python-pakken26. TIFF-filer med flere sider understøttes især.
Protocol
1. Softwareforudsætninger
- Installer miniconda Python distribution27 (minimum kræves Python version: 3.7).
- Åbn en Anaconda-prompt i menuen Start i Windows, eller åbn en terminal, og udfør conda-aktivering , hvis du bruger Linux eller macOS.
- Aktiver det community-vedligeholdte conda-smedepakkelager28 ved at udføre følgende kommandoer:
conda config --add channels conda-forge
conda config --set channel_priority streng
conda opdatering --alle - Installer de nødvendige Python-pakker ved at udføre:
conda installere opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab - Bliv fortrolig med JupyterLab, brugergrænsefladen i analysesoftwaren (se softwaredokumentationen29).
- Installer git version kontrolsystem, som vil blive brugt senere til at downloade og opdatere analysen software. Hvis du bruger Linux, skal du bruge distributionens pakkestyringssoftware til at downloade og opdatere. Ellers skal du udføre:
conda installere git - Du kan også installere sidevogns python-pakken for at få vist datasæt efter filtreringstrin under analysen:
conda installere sidevogn
2. Måling af prøver
Figur 1: Billedopsamling. (A) Excitation sekvens. Efter optagelse af et valgfrit billede af en farvestof-lastet celle ved hjælp af 405 nm laser, donor og acceptor er ophidset skiftevis og gentagne gange for belysningstid till ved hjælp af 532 nm og 640 nm lasere, henholdsvis. Tiden mellem donor og acceptor excitation skal være lang nok til at give mulighed for billedudlæsning af kameraet. Forsinkelsestiden tdelay kan bruges til at justere erhvervelsen billedhastighed og derfor observationstiden før photobleaching. Dette panel er ændret fra 16. B) Fiducial markører anvendes til beregning af koordinattransformationerne mellem de to emissionskanaler. Matchende fiducials er angivet med farve. Flere forskudte billeder bør optages for at sikre, at hele synsfeltet er dækket. (C) Laserprofiler til flatfieldkorrektion registreres ved hjælp af en tæt mærket prøve. Acceptorprofilen registreres og fotobles, efterfulgt af erhvervelse af donorprofilen. Flere billeder skal tages i forskellige prøveområder, i gennemsnit og udjævnes for at afbøde påvirkningen af prøvefejl (f.eks. det lyse sted i midten af billedet). (D) Flatfield-korrektionskort p(x,y) beregnet ud fra 20 laserprofiler registreret som beskrevet i C. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; ImDD = donor emission billede på donor excitation; ImDA = acceptor emission billede på donor excitation; ImAA = acceptor emission billede på donor excitation. Skalalinjer = 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Når du bruger et emccd-kamera (Electron-multiplying Charge-Coupled Device), skal EM-gain'en observere signaler med et enkelt molekyle ved høje signal-til-støj-forhold (se producentens anvisninger).
- Excitationssekvens (se figur 1A for yderligere oplysninger).
- Du kan også registrere et billede til segmentering for at begrænse dataanalyse til bestemte områder i synsfeltet. For eksempel ophidse Fura-2-loaded celler ved hjælp af en 405 nm laser og fange deres emission omkring 510 nm til at evaluere kun sonder placeret i grænseflader mellem celler og understøttede lipid bilayers (SLBs). Derfor vente på tid tr at tillade kamera udlæsning.
BEMÆRK: På EMCCD-kameraer afhænger tr af antallet af linjer i det valgte interesseområde (ROI). Derfor kan det være en fordel at vælge et lille investeringsafkast, fordi det reducerer forsinkelsen mellem rammer og størrelsen af registrerede data. Derudover giver aktivering af rammeoverførselstilstand mulighed for yderligere reduktion af tr. - Alternativt ophidse donor og acceptor fluorophores gentagne gange.
- Ophidse donoren for en belysningstid till (5-10 ms er typisk kort nok til at undgå motion blur), samtidig med at udløse kameraet.
- Vent på tid tr at tillade kamera udlæsning.
- Ophidse acceptoren for, mens du udløser kameraet.
- Vent til en tid tdelay.
BEMÆRK: Dette skal være længere end tr for at muliggøre udlæsning af kameraet, men kan ellers vælges vilkårligt. Den afvejer kravene til tidsopløsning og sporlængde. - 2.2.2.1-2.2.2.4. Vælg antallet af gentagelser, der skal være stort nok til at sikre fotobleaching af mindst én fluorophore pr. sonde inden for synsfeltet, hvilket gør det muligt trinvis fotobleaching analyse for diskrimination af enkeltmolekyle signaler fra aggregater.
BEMÆRK: At vælge passende till og excitation laser intensiteter normalt kræver nogle eksperimenter: Jo længere belysning gange og jo højere laser intensiteter, jo bedre er signal-til-støj-forholdet i de resulterende billeder, men jo kortere er de resulterende tidsspor.
- Du kan også registrere et billede til segmentering for at begrænse dataanalyse til bestemte områder i synsfeltet. For eksempel ophidse Fura-2-loaded celler ved hjælp af en 405 nm laser og fange deres emission omkring 510 nm til at evaluere kun sonder placeret i grænseflader mellem celler og understøttede lipid bilayers (SLBs). Derfor vente på tid tr at tillade kamera udlæsning.
- Optag et tilstrækkeligt antal film til hvert eksempel.
3. Yderligere målinger til bestemmelse af korrektionsfaktorer
- Registrer en række tilfældigt placerede fiducialmarkører, der er synlige i begge emissionskanaler til billedregistrering (dvs. at finde den transformation, der kortlægger koordinatkanalen for donoremissionskanalen til acceptoremissionskanalen og omvendt). Se figur 1B.
BEMÆRK: Billedregistrering udføres af softwaren; se trin 6.1.4. - Mål intensitetsprofilen for både donor- og acceptor excitationslyskilder til flatfieldkorrektion (dvs. korrigere for inhomogene excitation på tværs af synsfeltet). Til dette formål skal du forberede en prøve med en høj densitet af FRET-sonder og først erhverve et billede ved acceptor excitation, efterfulgt af fotobleaching af acceptoren og efterfølgende optagelse af et billede ved donor excitation. For øget stabilitet gentages flere gange i forskellige prøveområder. Se figur 1C, D. Alternativt kan du registrere en prøve dekoreret med kun donormolekylet og en anden prøve dekoreret med kun acceptor fluorophores.
BEMÆRK: Flatfield-korrektionen udføres af analysesoftwaren. se trin 8.1.2. - Registrer en enkeltmolekyleprøve (som i afsnit 2) af en sonde uden en acceptor fluorophore for at bestemme donoremission, der lækker ind i acceptorkanalen.
BEMÆRK: Donorlækage kan også beregnes ud fra de faktiske sonders tidsspor efter acceptor blegning. Hvis der registreres et tilstrækkeligt antal af sådanne hændelser, er det ikke nødvendigt med yderligere måling. Begge indstillinger understøttes af analysesoftwaren. se Supplerende oplysninger, punkt 3.15. - Erhverve optagelser af en sonde uden en donor fluorophore til kvantificering af direkte acceptor excitation af donor excitation lyskilde.
BEMÆRK: Direkte acceptor excitation kan også udledes af de faktiske sonder tid spor efter donor blegning. Hvis der registreres et tilstrækkeligt antal af sådanne hændelser, er det ikke nødvendigt med yderligere måling. Begge indstillinger understøttes af analysesoftwaren. se Supplerende oplysninger, punkt 3.15. - Registrer en enkeltmolekyleprøve med to forskellige FRET-effektivitetsgevinster for at korrigere for donorens forskellige detektionseffektivitet og acceptoremissionskanaler og forskellige kvanteudbytte af farvestofferne.
BEMÆRK: Sådanne prøver kan for eksempel være Holliday junctions1, som svinger mellem to konformationer, eller DNA-stænger, der har FRET-par fastgjort på forskellige, veldefinerede afstande. Hvis sonder har høje og tilstrækkeligt konstante FRET-effektivitetsgevinster, kan korrektionen også beregnes ud fra acceptor blegning af hændelser af sonders tidsspor, i hvilket tilfælde der ikke er behov for yderligere målinger. Begge indstillinger understøttes af analysesoftwaren. se Supplerende oplysninger, punkt 3.15.
4. Lokaliseringsalgoritmer med enkeltmolekyle
BEMÆRK: Flere analysetrin kræver lokalisering af enkeltmolekyler. Vælg mellem en gaussisk tilpasningsalgoritme30 og center-of-mass computation31, afhængigt af signaltæthed, baggrund og signal-til-støj-forhold.
- Hvis du vil udføre gaussisk tilpasning, skal du vælge 3D-DAOSTORM30-algoritmen via de respektive brugergrænseflader.
BEMÆRK: 3D-DAOSTORM er designet til at skelne selv signaler med overlappende punktspredningsfunktioner. Selvom dette generelt er en fordel, kommer det med en advarsel: enkelte, lyse signaler identificeres lejlighedsvis som to tilstødende, hvilket kan forvirre sporingsalgoritmen og resultere i påvisning af to korte baner i stedet for en enkelt lang.
Angiv følgende parametre (for detaljer, se dokumentationen af sdt-python library32, som giver algoritmens implementering).- radius: Angiv den oprindelige σ værdi af gaussisk tilpasningsfunktion i pixel afhængigt af den effektive pixelstørrelse.
-
tærskel: Angiv en minimums amplitud (dvs. den lyseste pixelværdi, korrigeret for den estimerede lokale baggrund) for et maksimum for lokal intensitet, der skal være i form.
BEMÆRK: Tærsklen er uden tvivl den vigtigste parameter. Hvis den er for lav, kan støj betragtes som et fluorescenssignal, og lyse signaler kan være udstyret med to gaussere. Hvis de er indstillet for højt, er dæmpede signaler ikke egnede. -
model: Indstillet til 2d , så den passer til cirkulære Gaussians.
BEMÆRK: De andre modeller gælder ikke for smFRET-dataene. -
find filter: Påfør et filter, før du finder lokale maksimer for at reducere støj, hvilket er nyttigt i situationer med lavt signal-til-støj-forhold. Dette kan være i) identitet: intet filter; ii) Crocker-Grier: båndfilter fra Crocker-Grier-algoritme31,33; eller iii) Gaussian: en gaussisk sløring med σ indstillet af sigma-parameteren.
BEMÆRK: For Crocker-Grier skal den feat. størrelsesparameter være omtrent radiusen for en punktspredningsfunktion i pixels.
BEMÆRK: Montering udføres ved hjælp af ufiltrerede rådata. -
min. afstand: Sæt to potentielle signaler adskilt af færre end min. afstand pixels af en enkelt Gaussian.
BEMÆRK: Dette kan hjælpe i ovennævnte scenario, hvor et lyst signal fejlagtigt registreres som to tilstødende signaler. - størrelsesområde: Vælg minimum og maksimalt σ af anfaldene for at fjerne registreringer fra falske signaler på grund af støj.
- Vælg Crocker-Grier algoritme via de respektive brugergrænseflader til at udføre center-of-mass beregning (en raffineret algoritme31 baseret på Crocker's og Grier idé33).
BEMÆRK: Denne algoritme er meget robust selv i lav signal-til-støj scenarier og i forbindelse med signaler byder på en række intensiteter, men kan ikke passe molekyler med overlappende punkt spredning funktioner præcist.- radius: Angiv radius (i pixel) for en disk, der er stor nok til at indeholde hele punktspredningsfunktionen.
-
signal tærske.: Indstil minimum amplitud (lyseste pixel over anslået baggrund) for en lokal intensitet maksimum, der skal analyseres.
BEMÆRK: Hvis støjen er indstillet for lavt, kan den betragtes som et fluorescenssignal. Hvis de er indstillet for højt, er dæmpede signaler ikke egnede. -
masse tærske.: Angiv den samlede minimumintensitet (summen af baggrundskorrigerede pixelværdier) for et signal, der skal analyseres.
BEMÆRK: Samme overvejelser som ovenfor gælder.
5. Initialisering af software
- Hent analysescripts. I en Anaconda-prompt skal du navigere til en mappe for at gemme analysen (bruge cd-kommandoen ) og udføre
git klone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git målmappe- Erstat destinationsmappen med et beskrivende navn 14_Force, f.eks.
BEMÆRK: Analysesoftwaren ender i denne mappe. sikre, at denne mappe ikke findes på forhånd. Det anbefales at downloade en kopi af analysescripts til hvert eksperiment. På denne måde er det muligt at revidere analysen senere, huske de anvendte parametre og foretage ændringer.
- Erstat destinationsmappen med et beskrivende navn 14_Force, f.eks.
- Kopier Jupyter-notesbøger (01. Tracking.ipynb, 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb) i den nyoprettede mappe (fremover benævnt rodmappen). Hvis det er første gang, du bruger softwaren, skal du hente dem fra undermappen i rodmappen til notesbøgerne.
BEMÆRK: Hvis lignende datasæt allerede er blevet analyseret, kan kopiering af notesbøgerne fra et tidligere eksperiment være en praktisk mulighed, da parametrene muligvis kun har ændret sig lidt. - Start JupyterLab-serveren ved at udføre følgende kommando i Anaconda-prompten for at åbne et webbrowservindue, der viser JupyterLab.
jupyter lab
BEMÆRK: Browseren er kun grænsefladen, mens processen, der kører i Anaconda-prompten , udfører det faktiske arbejde. Som følge heraf har lukning af browservinduet kun minimal effekt; sessionen kan gendannes ved at få adgang til http://localhost:8888. Men hvis jupyterlab-processen afbrydes i prompten eller lukker prompten, afsluttes analysen, hvilket fører til tab af ikke-gemt arbejde. - Brug venstre rude i browservinduet JupyterLab til at navigere til rodmappen. Dobbeltklik på 01. Tracking.ipynb for at starte den første notesbog. Efter lanceringen skal du kigge efter en ny fane, der vises, som viser kasser, såkaldte celler, python-kode.
BEMÆRK: Alle Jupyter-notesbøger har kommentarer, der beskriver funktionaliteten i hver kodecelle. Derudover kan dokumentation for hvert metodekald vises ved at placere tekstmarkøren umiddelbart før åbningen ( og trykke på Skift+Tab. - Se figur 2 for at få en oversigt over dataanalyseprocessen.
Figur 2: Oversigt over en typisk analysepipeline. Bemærk, at filtreringstrin er underlagt tilpasning i henhold til det eksperimentelle design. Dette tal er ændret fra 16. Forkortelse: FRET = Förster resonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
BEMÆRK: Eksempeldata til at afprøve softwaren kan downloades fra https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files
6. Lokalisering, sporing og fluorescensintensitetsanalyse af enkelte molekyler (01. Tracking.ipynb).
- Brug 01. Tracking.ipynb Jupyter notebook til pålidelig analyse af fluorescensintensitetsværdier for enkeltmolekylesignaler, som er skræddersyet til præcis kvantificering, især af svage signaler, der ofte forekommer i FRET-målinger (f.eks. på grund af lave donorsignaler ved høje FRET-hændelser og omvendt).
BEMÆRK: Til dette formål implementeres direkte integration af pixelintensiteterne i de rå data med korrektion for den lokale baggrund. Du kan finde skærmbilleder af hvert analysetrin og beskrivelse af funktionskaldsparametre i Supplerende oplysninger.- Angiv belysningssekvensen for at tillade valg af donor- og acceptor excitationsrammer samt rammer til billedsegmentering fra optagede billedsekvenser.
BEMÆRK: Da softwaren tillader behandling af data registreret med vilkårlige belysningsprotokoller, er det nødvendigt at angive, hvilken ramme i en billedsekvens der blev erhvervet, mens spændende hvilken type fluorophore; se Supplerende oplysninger, punkt 1.2, trin 3. Rammenumrene for den oprindelige billedsekvens bevares. - Beskriv og indlæs datasæt. Analyser flere datasæt på én gang, forudsat at de blev optaget ved hjælp af de samme belysningsindstillinger. Tildel et id og et mønster, der svarer til de respektive billedsekvensfilnavne, til hvert datasæt. Derudover definere specifikke datasæt til særlige formål, såsom optagelser af fiducial markører til billedregistrering, excitation lys profiler til flatfield korrektion, og eventuelt donor-only og acceptor-only prøver til at bestemme korrektion faktorer.
- Vælg emissionskanaler i rå billeder, hvis begge kanaler blev optaget ved hjælp af et enkelt kamera. Til dette skal du bruge den relevante grafiske widget til at vælge de relevante områder til donor- og acceptoremission.
- Lokalisere fiducial markører i begge emissionskanaler og udføre billedregistrering. Brug den medfølgende brugergrænseflade til at finde de relevante parametre for lokaliseringsalgoritmen for både donor- og acceptoremissionskanalerne. Se afsnit 4 for at få oplysninger om understøttede lokaliseringsalgoritmer.
BEMÆRK: Tilfældigt distribuerede fiducial markører kan identificeres på tværs af emissionskanaler ved den rumlige fordeling af deres nærmeste naboer (Figur 1B). En brugerdefineret implementering af algoritmen foreslået til selektiv flybelysningsmikroskopi34 i sdt-python-biblioteket matcher automatisk placeringen af hver markør i donoremissionskanalen med positionen i acceptoremissionskanalen. En transformation T kortlægning af donor emission kanalens koordinater til acceptor emission kanal koordinater findes via en lineær mindst kvadrater passer til en affin transformation til markører positioner35. RANSAC bruges til at tage højde for outliers, f.eks. forkert matchede positioner fra det forrige trin. - Lokalisere FRET-sonder uafhængigt af donor og acceptor excitation i alle rammer og flette resultater i en tabel, der indeholder det oprindelige rammenummer, 2-dimensionelle koordinater og et id, der henviser til kildebilledfilen.
BEMÆRK: Til dette formål giver softwaren brugergrænseflader til at finde passende muligheder for lokaliseringsalgoritmen.- Lokalisere FRET sonder på donor excitation i summen af de billeder, der er opnået fra donor emission ImDD og acceptor emission ImDA, som næppe afhænger af FRET effektivitet. Du kan finde oplysninger om mulighederne for lokaliseringsalgoritmen i afsnit 4.
BEMÆRK: Hvert sumbillede beregnes ved at transformere ImDD ved hjælp af transformationen T, der tidligere er opnået fra billedregistrering og tilføjet pixelwise til ImDA. - Lokalisere sonder ved acceptor excitation i acceptor emission kanal ImAA (se afsnit 4 for detaljer om lokalisering algoritmer).
- Lokalisere FRET sonder på donor excitation i summen af de billeder, der er opnået fra donor emission ImDD og acceptor emission ImDA, som næppe afhænger af FRET effektivitet. Du kan finde oplysninger om mulighederne for lokaliseringsalgoritmen i afsnit 4.
- Udfør måling af sporings- og fluorescensintensitet.
- Angiv belysningssekvensen for at tillade valg af donor- og acceptor excitationsrammer samt rammer til billedsegmentering fra optagede billedsekvenser.
Figur 3: Måling af intensitet med enkelt molekyle. (A) For et fluorophore, der er placeret ved den orange pixel, bestemmes dens ikke-korrigerede intensitet Iuncorr ved at opsummere alle pixels intensiteter i en disk (gule og orange pixels), der er stor nok til at dække alle pixels, der påvirkes af signalet: 
. Den lokale baggrund beregnes som gennemsnittet af pixel i en ring (blå pixel) omkring disken: 
, hvor nring er antallet af pixel i ringen. Fluorescensintensiteten I er resultatet af at trække baggrunden fra den ikke-korrigerede intensitet, I = Iuncorr - b × ndisk, hvor ndisk er antallet af pixels på disken. Cirkelradius angives via feat_radius-parameteren i sporingsmetoden. Ringens bredde angives af parameteren bg_frame. Hvis punktspredningsfunktionen for ét signal overlapper med baggrundsringen i et andet (bundpanel), udelades de berørte pixel (rød) fra lokal baggrundsanalyse. Hvis topunktsspredningsfunktioner overlapper hinanden, kan fluorescensintensiteterne ikke beregnes pålideligt og kasseres derfor. (B, C) Simuleringer viser, at anvendelsen af en gaussisk sløring med en standardafvigelse på 1 pixel forbedrer signal-til-støj-forholdet op til en faktor på tæt på 2 ved lave fluorescensintensiteter (B) og indfører næsten ingen fejl (let undervurdering på mindre end 1%, (C))16. Desuden er den relative fejl (dvs. (Imeas - Itruth)/Itruth, hvor Itruth er den grundlæggende sandhed, og Imeas er resultatet af analysen) konstant over hele intensitetsområdet og går derfor op i forholdsmetriske mængder som f.eks. Alle grunde er baseret på tidligere offentliggjort arbejde16. Forkortelser: SNR = signal-til-støj-forhold; FRET = Förster resonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Vælg passende indstillinger for trackpy36algorithm bruges til at forbinde FRET sonde lokaliseringer i baner. Indstil især den maksimale søgeafstand fra den ene ramme til den næste og antallet af på hinanden følgende rammer, for hvilke et signal kan gå uopdaget, hvilket kan forekomme på grund af blegning eller ubesvarede lokaliseringer.
BEMÆRK: Disse huller udfyldes via interpolation mellem forudgående og efterfølgende stillinger. Disse interpolerede positioner er markeret og bruges først senere til at læse intensitetsværdier, men ikke til diffusionsanalyse. Spor analyseres i koordinatsystemet for acceptoremissionskanalen. For analyse af fluorescensintensitet (trin 6.1.6.2) omdannes sporene desuden til donoremissionskanalens koordinatsystem ved hjælp af den inverse transformation T-1, der opnås via billedregistrering (se trin 6.1.4). - Vælg indstillinger for beregningsalgoritmen for fluorescensintensitet (se Figur 3A for at få flere oplysninger). Angiv i) radius for en disk, der, når den er centreret om et signals placering, indeholder alle pixel, der påvirkes af det pågældende signal, og ii) bredden af en ring omkring hver disk, der bruges til at bestemme den lokale baggrund.
BEMÆRK: For at reducere støj i de opnåede intensitetsmålinger påføres en gaussisk sløring med en standardafvigelse på 1 pixel på billederne (Figur 3B, C).
- Brug analysesoftwarefunktionen til at behandle ekstra billeddata fra billedsekvenser.
- Uddrag yderligere billeder, der er optaget for at lette segmentering (se trin 2.2.1, markeret med s i excitationssekvensen (se Supplerende oplysninger, afsnit 1.2, trin 3).
- Bestem donor- og acceptor excitationslysprofiler på tværs af synsfeltet fra billeder, der er optaget på en tæt mærket prøve (se trin 3.2).
BEMÆRK: Den pixel-for-pixel middelværdi beregnes ud fra billederne til beregning af lysprofilerne. Kameraets oprindelige plan trækkes fra. Billeder sløres ved hjælp af et gaussisk filter for at reducere virkningerne på grund af prøve urenheder. Endelig opdeles de resulterende billeder pixelvis efter deres maksimale værdi for at få profilen p(x,y) tilknytningskoordinater på intervallet [0,1].
7. Visualisering af FRET baner (valgfrit)
- Brug inspektørapplikationen til at vise spor med enkeltmolekyler i rå billeddata og de tilsvarende fluorescensintensiteter og tilsyneladende FRET-effektivitetsgevinster og stoichiometrier.
BEMÆRK: Dette er et værdifuldt værktøj til at vurdere gyldigheden af valgte parametre og manuelt acceptere eller afvise individuelle tidsspor. Se Supplerende oplysninger for et skærmbillede og detaljerede brugsoplysninger.
8. Analyse og filtrering af enkeltmolekyledata (02. Analysis.ipynb)
- Brug 02. Analysis.ipynb Jupyter notesbog til analyse og filtrering af de enkeltmolekyledata, der er opnået via 01. Tracking.ipynb notesbog. Se nedenstående trin for en typisk analysepipeline.
BEMÆRK: Forskellige videnskabelige spørgsmål og eksperimentelle design kan kræve justeringer af indstillingerne. Brugen af Jupyter notebooks tillader nem tilpasning ved at udelade, omarrangere og ændre analysetrin. Du kan finde skærmbilleder af hvert analysetrin og en beskrivelse af funktionskaldsparametrene i Supplerende oplysninger.- Udfør indledende filtreringstrin.
- Kassér signaler med overlappende punktspredningsfunktioner, da det er vanskeligt at bestemme deres fluorescensintensiteter pålideligt.
- I tilfælde af inhomogene belysning skal du kun acceptere signaler, der er placeret i velbelyste områder inden for synsfeltet for at sikre et godt signal-til-støj-forhold.
- Hvis du studerer intramolekylær FRET, begrænse analysen til de baner til stede fra begyndelsen af billedet sekvens for at sikre, at alle blegning trin registreres og kan evalueres korrekt senere i løbet af trinvise photobleaching analyse.
BEMÆRK: Når der udføres eksperimenter med intermolekulære FRET-sonder, hvori donor og acceptorfluoripher ikke er en del af et præformt kompleks, er det muligvis ikke muligt at begrænse analysen til i første omgang at præsentere baner.
- Udførelse af flatfieldkorrektion, som anvender excitationslyskildeprofilerne, der er opnået i trin 6.1.7.2, til at vende de positionsafhængige fluorescensintensitetsvariationer forårsaget af inhomogene belysning.
BEMÆRK: Fluorescensintensiteten I(x,y) af en sonde på positionen (x,y) korrigeres via
; se figur 1C, D. - Beregne den tilsyneladende FRET-effektivitet Eapp (dvs. den del af energien, der overføres fra donorfluoriphe til acceptorfluoriphe) og den tilsyneladende stoichiometri Sapp (dvs. antallet af donorflufluoriheste divideret med det samlede antal fluorophorer inden for et diffraktionsbeskenseret sted).
BEMÆRK: Ved at afbilde E vs. S for hvert datapunkt er det muligt at skelne mellem ændringer i de målte FRET-effektivitetsgevinster som følge af ændringer i donor-acceptorafstanden fra ændringer som følge af ændringer i stoichimetrien18. Dette giver mulighed for differentiering mellem E = 0 på grund af farvestofadskillelse fra E = 0 på grund af fraværet af en aktiv acceptor. E-S-grunde anvendes gennem hele analysen som et redskab til kvalitetsvurdering; se figur 4 som et eksempel. - Udfør trinvis analyse af fotobleaching for diskrimination mellem enkelt molekylære sonder og aggregater. Vælg at acceptere en af følgende indstillinger.
BEMÆRK: Til dette formål anvender analysesoftwaren en brugerdefineret implementering32 af changepointdetekteringsalgoritmen PELT37 separat på fluorescensintensiteten ved donor excitation (IDD + IDA) og acceptor excitation (IAA).- Vælg mulighed 1, hvori acceptor fluorophor blegemidler i et enkelt trin, mens donoren viser ingen delvis blegning (dvs. der er ingen blegning skridt til ikke-nul intensitet).
BEMÆRK: Denne mulighed afviser yderligere baner, hvor donoren bleger før acceptoren i et enkelt trin. Mulighed 1 er det foretrukne valg i tilfælde af høje acceptor photobleaching satser. - Vælg mulighed 2, hvori donor blegemidler i et enkelt trin, mens der ikke er nogen delvis acceptor blegning.
BEMÆRK: Denne mulighed afviser yderligere baner, hvor donoren bleger efter acceptoren i et enkelt trin. Mulighed 2 er det foretrukne valg i tilfælde af høje donorfotobleachingshastigheder. - Vælg mulighed 3, hvori enten fluorophor blegemidler i et enkelt trin, mens den anden ikke delvist blegemiddel.
BEMÆRK: Løsningsmodel 3 giver større fleksibilitet end løsningsmodel 1 og 2 og vil være den foreslåede præference for dataanalyse. - Vælg mulighed 4, hvori donor og acceptor fluorophores viser enkelttrins fotografering eller slet ingen fotografering.
BEMÆRK: Mulighed 4 foretrækkes i tilfælde af lave fotobleaching satser.
- Vælg mulighed 1, hvori acceptor fluorophor blegemidler i et enkelt trin, mens donoren viser ingen delvis blegning (dvs. der er ingen blegning skridt til ikke-nul intensitet).
- Beregn korrektionsfaktorerne for donoremissionslækage i acceptorkanalen α, direkte acceptor excitation δ, detektionseffektivitet γ og excitationseffektivitet β 17.
- Brug korrektionsfaktorerne til at beregne FRET-effektivitet E ud fra den tilsyneladende effektivitet Eapp og stoichimetrien S fra den tilsyneladende stoichiometri Sapp.
- Udfør yderligere filtreringstrin. Vælg kun datapunkter fra før den første blegning begivenhed i hver bane. Derudover acceptere kun baner med mindst 75% af datapunkter opfylder 0,35 < S < 0,6 for at begrænse analysen til enkelt-molekyle sonder (numre er justerbar).
BEMÆRK: De øvre og nedre grænser for bør vælges i henhold til spredningen af befolkningen af interesse versus de populationer, der skal udelukkes fra analysen (f.eks donor-only og acceptor-only populationer). Baseret på erfaring viste 0,35 < S < 0,6 sig at være et godt valg for mange eksperimentelle situationer. - Udfør billedsegmentering via globale eller adaptive tærskelmetoder35 på de relevante hjælpebilleder (se trin 2.2.1 og 6.1.7) for at begrænse analysen til forskellige områder inden for synsfeltet.
BEMÆRK: Dette giver f.eks. mulighed for eksklusiv evaluering af sonder i en celle-SLB-grænseflade eller på en mønstret struktur.
- Udfør indledende filtreringstrin.
; se figur 1C, D.9. Plotte resultater og yderligere analyse (03. Plot.ipynb)
BEMÆRK: Se supplerende oplysninger for skærmbilleder af Jupyter notebook og beskrivelse af funktion opkald parametre.
- Opret E-S-plots for at kontrollere, at signaler om forkert stoichimetri er blevet identificeret og fjernet korrekt.
- Plot histogrammer af FRET effektivitetsgevinster at give et veletableret overblik over FRET effektivitet distributioner. Grupper histogrammerne til bekvem sammenligning af resultater fra forskellige eksperimenter.
- Vurder dataene yderligere (f.eks. diffusionsanalyse, konvertering af FRET-effektivitet til kræfter i eksperimenter ved hjælp af molekylære kraftsensorer eller overgangsanalyse) i notesbogen, der udnytter videnskabelige Python-biblioteker.
BEMÆRK: Data kan også eksporteres i mange filformater som input til anden analysesoftware.
Representative Results
En række oplysninger på lavt og højt niveau kan udtrækkes fra smFRET-spor afhængigt af eksperimentets videnskabelige spørgsmål. Her præsenteres eksempler på analyserørledninger med analoge og digitale sonder: en peptidbaseret molekylær kraftsensor16 og en DNA-sonde med stokastisk skift af dens kropsbygning38. Se figur 5 for udformningen og arbejdsprincippet for disse sonder.
Efter lokaliserings- og sporingsalgoritmerne er blevet udført som beskrevet i protokollen, tilbyder pakken flere datavisualiseringsværktøjer til optimering af de indledende parametre og efterfølgende filtertrin: (i) visualisering af individuelle smFRET-hændelser, (ii) valgfri billedsegmentering til analyse af data i visse interesseområder, (iii) overvågning af filtertrin via FRET-effektivitet vs. stoichimetri (E-S) plots. Visualiseringen af enkeltmolekyledataene er præsenteret i figur 6.
Endelig repræsenteres de filtrerede FRET-hændelser af et E-S-plot og et FRET-effektivitets histogram (figur 4). E-S-plottet er et nyttigt værktøj til optimering af de ovennævnte filtreringstrin og undersøgelse af det endelige resultat. Delvist blegede eller ufuldstændigt mærkede FRET-sensorer kan udelukkes ved deres stoichimetriværdi. Mobilitetsparametre kan undersøges ved at afbilde en individuel banesti i et x-y-plot (figur 6) eller et gennemsnitligt kvadratforskydningsplot (FIGUR 4). Den første metode er især nyttig til kræsen mobil fra immobiliserede hændelser, mens sidstnævnte bruges til at beregne diffusionskoefficienten.
Figur 4: Eksemplarisk output. (A) FRET-effektiviteten er plottet versus stoichimetri (E-S plot) for en population af molekylær kraft sensor (venstre panel) dekorere en glas-støttet lipid bilayer og anstrengt af en T-celle. Kun én befolkningssky er synlig. Det respektive histogramme af FRET-effektivitetsgevinster er et eksempel på forskellen mellem en kraftsensorpopulation i nærvær og fravær af celler (mellempanel). Der kan ikke observeres skift til lavere FRET-effektivitet i sensorpopulationen i nærværelse af T-celler, hvilket indikerer lidt eller ingen kraftafhængig strækning af sensormodulet. MSD-plottet af disse eksperimentelle forhold bekræfter, at kraftsensorpopulationen under en T-celle bevæger sig betydeligt langsommere end deres ubundne modstykker (højre panel). (B) Den samme analyse blev udført med Holliday junction DNA-sensor dekorere en glas-understøttet væske lipid bilayer. E-S-plottet viser tydeligt to populationer, som også er synlige i FRET-effektivitets histogrammet. Msd-plottet angiver tilstedeværelsen af en sensorpopulation i hurtig bevægelse. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; MSD = gennemsnitlig firkantet forskydning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Design og arbejdsprincip for intramolekylære FRET-sonder. (A) Analog peptidsensor til kvantificering af mekaniske molekylære kræfter. Donoren og acceptor fluorophores er kovalent fastgjort til hver ende af peptid rygraden. Sensormodulet er sted-specifikt fastgjort til en bestemt ligand, som igen binder en celle-resident overflade receptor af interesse (her, et antistof fragment specifikt anerkender beta-kæden af T-celle receptor). Ved receptor-ligand bindende, kraft udøves, og sensoren modulet udvider og i sidste ende viger tilbage efter bond kavalergang. Dette panel er ændret fra 16. (B) Digital DNA-sensor til kvantificering af FRET-overgange. FRET-sensoren består af fire DNA-strenge, der danner et Holliday-kryds. Donoren og acceptorfluoriphen er kovalent fastgjort til to tråde. Holliday-vejkryds skifter ofte deres kropsbygning afhængigt af de omgivende bufferforhold. Den stokastiske skift af disse konformationer kan overvåges ved at kvantificere FRET-effektiviteten af de enkelte sonder. Forkortelser: TCR = T-cellereceptor; FRET = Förster resonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Eksempler på lokalisering og sporing af FRET-sonder. (A) FRET-effektiviteten og stoichimetrien af individuelle hændelser beregnes ved at kvantificere intensiteten af donorfluoriphe ved donor excitation (D → D), acceptor fluorophore ved donor excitation (D → A) og acceptor fluorophore ved acceptor excitation (A → A). Nærmeste nabofiltrering forhindrer bias ved at overlappe punktspredningsfunktioner for lukke emittittere. Billedsegmentering giver brugeren mulighed for at vælge visse smFRET-hændelser, der er lokaliseret inden for et interesseområde (f.eks. en celle eller en mikropattern). Som et eksempel på billedsegmentering blev T-celler farves med Fura-2 (vist til venstre) og udsat for adaptiv tærskeling for at identificere cellekanterne (orange prikket linje). Skalastænger = 5 μm. (B) smFRET baner ved hjælp af molekylær kraftsensoren. Individuelle baner kan plottet i x-y-flyet , visualisere deres diffusion og lokalisering (venstre panel). Desuden kan hver bane intensiteter plottes over tid for at identificere FRET overgange eller blegning trin (midterste panel viser den røde bane fra venstre panel). Den resulterende FRET effektivitet og stoichiometri kan visualiseres på samme måde (højre panel). (C) smFRET baner ved hjælp af Holliday krydset DNA-sensor. HBSS + 12 mM MgCl2 blev brugt som buffer under målingerne. Bortset fra den tilsyneladende acceptor blegning skridt nær sekvensen slutningen af disse eksempler, kan hyppigheden af FRET overgange for hver sensor bestemmes. Holliday-krydsene skifter deres kropsbygning med en høj frekvens, mens molekylær kraftsensoren ikke udviser FRET-overgange. Disse oplysninger gør det muligt at justere forsøgsbetingelserne, såsom forsinkelsen mellem rammerne, for at øge eller reducere antallet af observerede overgange. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; smFRET = enkeltmolekyle FRET; HBSS = Hanks afbalancerede saltopløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende information: Lokalisering og sporing af enkelte molekyler (01. Tracking.ipynb). Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne artikel beskriver en pipeline til automatiserede optagelser og kvantitativ analyse af smFRET-data, der stammer fra mobile, men overfladebundne sondemolekyler. Det supplerer de to fremherskende tilgange til smFRET eksperimenter, der involverer enten overflade-immobiliserede sonder eller sonder diffusing i opløsning ind og ud af en konfocal excitation volume17. Det giver den korrekte FRET effektivitet og de molekylære positioner som en funktion af tiden. Det kan derfor bruges som input til specialiserede analyseprogrammer, f.eks. til at kvantificere overgangs kinetik1, FRET-histogrammer39 eller todimensionel diffusion22.
Softwaren frigives under en gratis og open source-licens, der er godkendt af Open Source Initiative, der giver brugeren den evige ret til gratis brug, ændring og omfordeling. Github blev valgt som udviklings- og distributionsplatform for at gøre det så nemt som muligt at få softwaren og deltage i udviklingsprocessen ved at rapportere fejl eller bidrage med kode40. Skrevet i Python, softwaren afhænger ikke af proprietære komponenter. Valget af Jupyter notebooks som brugergrænseflader letter inspektionen af data på hvert analysetrin og giver mulighed for at skræddersy og udvide rørledningen specielt til det eksperimentelle system ved hånden. Den sdt-python bibliotek32 tjener som fundament og gennemfører funktionalitet til at evaluere fluorescens mikroskopi data, såsom enkelt-molekyle lokalisering, diffusion analyse, fluorescens intensitet analyse, farve kanal registrering, colocalization analyse, og ROI håndtering.
I princippet kan enkeltpartikelsporing udføres i en-, to- eller tredimensionelle systemer. Her blev enkeltmolekyleanalysepipelinen skræddersyet til studiet af 2D-mobile systemer. Dette valg afspejler tilgængeligheden af enkle systemer, såsom planar-støttede lipid bilayers (SLBs), til at præsentere mobile fluorescerende sonder. Sådanne lipid bilayer systemer er typisk består af to eller flere fosfolipider moieties, hvor bulk fraktion bestemmer de vigtigste fysisk-kemiske parametre i SLB (såsom fase og viskositet), og den mindre fraktion giver fastgørelsessteder for biomolekyler. Disse vedhæftede filer kan være biotinylerede fosfolipider til avidin- eller streptavidin-baserede proteinplatforme eller nikkel-NTA konjugerede fosfolipider til proteinplatforme med histidin tags41. Valget af den rette platform til at forbinde proteiner med SLB afhænger af det videnskabelige spørgsmål. Læserne kan henvise til litteraturen16,38,42 for eksempler på succesfuldt anvendte strategier. Massefylden af sonder i prøven skal være tilstrækkelig lav til at undgå overlappende punktspredningsfunktioner. typisk anbefales mindre end 0,1 molekyler pr. μm2. Se afsnittet om repræsentative resultater (især figur 6) for et eksempel, der viser en passende sondetæthed. Analysemetoden gælder også for enkelt fluorescerende mærkede proteinmolekyler, der spredes i plasmamembranen i levende celler.
Et kritisk aspekt af smFRET eksperimenter er produktion og karakterisering af FRET sonder selv. Når de vælger fluorophorer til et FRET-par, skal deres Förster-radius matche de forventede interfarveafstande43. Farvestoffer, der er resistente over for fotobleaching, foretrækkes, da de giver langtidsspor. Men for forhøjede blegningshastigheder kan en fluorophore-art bruges til at genkende multiemitterhændelser, der stammer fra colocalized molekyler via trinvis fotobleachinganalyse; se trin 8.1.4 i protokolafsnittet. Fluorophorepar skal være sted-specifikt og kovalent fastgjort til molekyler af interesse, danner intra- eller intermolekylær FRET par.
Kombinationen af smFRET med andre lettilgængelige teknikker kan øge dens rumlige opløsning ud over diffraktionsgrænsen (via STED44). SmFRET tracking algoritme præsenteret her udvider tilgangens anvendelighed til nye eksperimentelle indstillinger og modelsystemer. Dette omfatter undersøgelser af i) kinetiske ændringer i stoichiometri af mobile biomolekyler, ii) dynamisk sammenslutning af mobile biomolekyler, iii) hastigheden af enzymatiske reaktioner hos frit diffuserende reaktanter og (iv) kinetik af kropslige ændringer af mobile biomolekyler. De to første eksempler kræver modelsystemer, der viser intermolekylær FRET, dvs. donor og acceptor, er konjugeret for at adskille biomolekylære enheder af interesse. Sidstnævnte eksempler kan gøre brug af biosensorer, der bærer donor og acceptor inden for samme molekylære enhed (intramolekylær FRET).
Intramolekylære FRET-baserede sensorer kan give indsigt i iboende kropslige ændringer af biomolekyler1,2,3,4, kropslige ændringer forårsaget af endogene eller ekstern kraftbelastning (molekylære kraftsensorer16) eller ionkoncentrationer i nanomiljøet, såsom calcium45 og pH46 . Afhængigt af modelsystemet og den foretrukne forankringsplatform kan sådanne smFRET-hændelser enten spores i 2D eller 3D: (i) planarsporing af smFRET-hændelser kan anvendes til kvantificering af receptor-ligand-interaktionstider inden for en plasmamembran, sammenslutningen af membranforankrede signalforstærkningskaskader og stoichiometriændringerne i overfladereceptorer; ii) volumensporing af smFRET-hændelser kan anvendes til intra- eller intermolekulære FRET-sonder i levende celler eller i in vitro-rekonstituerede systemer.
SmFRET-sporingsmetoden blev udviklet hovedsageligt med intramolekulære FRET-sonder i tankerne. Disse sonder har et fast og velkendt antal fluorescerende etiketter, et faktum, der blev udnyttet til at afvise data fra agglomererede og forkert syntetiserede (f.eks. ufuldstændigt mærkede) molekyler samt fra sonder, hvor en af fluorophorerne er blevet fotoblecheret. Men ved at justere filtreringstrinnene kan metoden også anvendes på intermolekulære FRET-sonder. For eksempel, i stedet for kun at acceptere molekyler med en enkelt donor og en enkelt acceptor fluorophore, kunne man undersøge de rumlige baner af donor og acceptor farvestoffer og vælge, for eksempel for co-diffusing donor-acceptor baner.
Da 3D-DAOSTORM-algoritmen har støtte til bestemmelse af et signals position langs den optiske akse via bygningsfejlen på grund af en cylindrisk linse i emissionsstrålevejen, kunne 3D-eksperimenter let integreres i analysepipelinen. I dette tilfælde vil acceptorsignalet ved acceptor excitation tjene til at bestemme stoichimetrien og den aksiale position. Analysesoftwaren kan også anvendes til at evaluere data fra eksperimenter med immobiliserede sonder ved at udnytte sin store grad af automatiserings- og filtreringsordninger. Faktisk blev smFRET effektivitet datasæt fra Holliday vejkryds immobiliseret på gel-fase bilayers38 analyseret ved hjælp af en tidlig version af softwaren.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den østrigske Videnskabsfond (FWF) projekter P30214-N36, P32307-B, og af Wien Science and Technology Fund (WWTF) LS13-030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS) | Avanti Polar Lipids | 790404P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective | Zeiss | 000000-1084-514 | |
| Axio Observer microscope body | Zeiss | ||
| Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET570/60m | donor emission filter |
| Bandpass filter | Chroma Technology Corp | ET675/50m | acceptor emission filter |
| conda-forge | conda-forge community | community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda | |
| Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5 | MENZEL | ||
| Dichroic mirror | Semrock Inc | FF640-FDi01-25×36 | separation of donor and acceptor emission |
| Dichroic mirror (quad band) | Semrock Inc | Di01-R405/488/532/635-25×36 | separation of excitation and emission light |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | for imaging buffer |
| fret-analysis | Schütz group at TU Wien | Python package for smFRET data analysis; version 3 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher Scientific | 11524766 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264 | for imaging buffer |
| iBeam Smart 405-S 405 nm laser | Toptica Photonics AG | ||
| iXon Ultra 897 EMCCD camera | Andor Technology Ltd | ||
| Lab-Tek chambers (8 wells) | Thermo Fisher Scientific | 177402PK | for sample preparation and imaging |
| Millenia Prime 532 nm laser | Spectra Physics | ||
| miniconda | Anaconda Inc. | Python 3 distribution. Min. version: 3.7 | |
| Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression) | Addgene | 20860 & 20859 | |
| OBIS 640 nm laser | Coherent Inc | 1185055 | |
| Optosplit II | Cairn Research | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5253 | for imaging buffer |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| sdt-python | Schütz group at TU Wien | Python library for data analysis; version 17 | |
| TetraSpek bead size kit | Thermo Fisher Scientific | T14792 | Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration |
| USC500TH Ultrasound bath | VWR | for SUV formation |
References
- McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. Structural dynamics of individual holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).
- Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), 235 (2018).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).
- Wu, P. G., Brand, L. Resonance energy transfer: Methods and applications. Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).
- Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
- Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex. Methods. 120, 115-124 (2017).
- Lee, J. -B., et al. Single-molecule views of MutS on mismatched DNA. DNA repair. 20, 82-93 (2014).
- Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).
- Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
- Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. How kinesin waits between steps. Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).
- Göhring, J., et al. Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements. Nature Communications. 12 (1), 2502 (2021).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669 (2018).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
- McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).
- Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- Asher, W. B., et al. Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells. Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).
- Joo, C., Ha, T. Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy. (12), Cold Spring Harbor. 1223-1237 (2012).
- Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).
- Joo, C., Ha, T. Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET. Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).
- Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. Soft-matter/pims: PIMS v0.5. , https://github.com/soft-matter/pims (2020).
- Anaconda Inc. Miniconda. , https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html (2021).
- conda-forge community. The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem. , (2015).
- JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation. , https://jupyterlab.readthedocs.io/en/stable/user/notebook.html (2021).
- Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy. Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).
- Gao, Y., Kilfoil, M. L. Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions. Optics Express. 17 (6), 4685 (2009).
- Schrangl, L. sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1). , Zenodo. (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
- Bradski, G. The OpenCV library. Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).
- Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0. Zenodo. , 4682814 (2021).
- Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. Optimal detection of changepoints with a linear computational cost. Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).
- Schrangl, L., Göhring, J., Schütz, G. J. Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories. The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328 (2018).
- Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
- Schrangl, L. Single-molecule FRET analysis software (3.0). Zenodo. , (2021).
- Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
- Platzer, R., et al. Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy. Nature Communications. 11 (1), 4993 (2020).
- Johnson, I., Spence, M. The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. , Life Technologies Corporation. (2010).
- Szalai, A. M., et al. Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET. Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process. New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).
