Summary
Drosophila melanogaster voksne fluer har blitt mye brukt som modellorganismer for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for antimikrobielle medfødte immunresponser og mikrobielle infeksjonsstrategier. For å fremme D. melanogaster larvestadiet som et ekstra eller alternativt modellsystem, beskrives en larval injeksjonsteknikk.
Abstract
Bruk av ukonvensjonelle modeller for å studere medfødt immunitet og patogen virulens gir et verdifullt alternativ til pattedyrmodeller, som kan være kostbare og reise etiske spørsmål. Ukonvensjonelle modeller er notorisk billige, enkle å håndtere og kultur, og tar ikke mye plass. De er genetisk mottagelige og har komplette genomsekvenser, og deres bruk gir ingen etiske hensyn. Fruktfluen Drosophila melanogaster har for eksempel gitt stor innsikt i en rekke atferds-, utviklings-, metabolisme- og immunitetsforskning. Mer spesifikt har D. melanogaster voksne fluer og larver flere medfødte forsvarsreaksjoner som deles med virveldyrdyr. Mekanismene som regulerer immunresponser har for det meste blitt avslørt gjennom genetiske og molekylære studier i D. melanogaster-modellen . Her er det gitt en ny larvalinjeksjonsteknikk, som ytterligere vil fremme undersøkelser av medfødte immunprosesser i D. melanogaster larver og utforske patogenesen av et bredt spekter av mikrobielle infeksjoner.
Introduction
Drosophila melanogaster har blitt enormt brukt i biologisk og biomedisinsk forskning i flere tiår, da det sofistikerte utvalget av genetiske og molekylære verktøy har utviklet seg jevnt for analyse av et bredt spekter av studier1,2,3,4. De evolusjonært bevarte aspektene ved utvikling, homeostase og medfødt immunitet i D. melanogaster har gjort det til en verdifull modellorganisme for å studere ulike menneskelige og insektssykdommer5,6. Spesielt har D. melanogaster-modellens grunnleggende rolle for å studere immunitet i stor grad blitt eksemplifisert i voksne fluestudier. Imidlertid har D. melanogaster larver studier også bidratt til dagens kunnskap og hovedsakelig utforsket cellulære immunresponser, spesielt for veps og nematode infeksjoner som oppstår gjennom insektet cuticle7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver har tre forskjellige typer blodceller, samlet kalt hemocytter: plasmatocytter, krystallceller og lamellocytter11,12,13. Disse cellene kan montere en rekke immunresponser når D. melanogaster larver er smittet med patogener som bakterier, sopp, virus og parasitter14,15,16. Cellulære immunresponser inkluderer direkte engulfment (fagocytose) av små molekyler eller bakterier, melanisering, innkapsling av større patogener som parasitoide egg og produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og nitrogenoksidsynthaser (NOS) 17,18,19.
I motsetning til dette er det publisert færre studier om bruk av D. melanogaster larval-modellen for å analysere humorale immunresponser. Dette skyldes hovedsakelig anvendelsen av fôringsanalyser for oral infeksjon av D. melanogaster larver og flere utfordringer forbundet med mikroinjektiv larver, inkludert presis håndtering av larver og riktig bruk av mikroneedlen, spesielt under penetrasjon20,21. Dermed har den begrensede kunnskapen om larvinfeksjon og tekniske vanskeligheter (dvs. høy dødelighet) ofte gjort D. melanogaster larvalmodellen vanskelig å bruke. En larvalmodell vil ha potensial til å identifisere nye molekylære mekanismer som vil gi ytterligere innsikt i vertspatogeninteraksjoner og induksjon av spesifikke verts medfødte immunresponser mot patogene infeksjoner.
Her er en enkel og effektiv protokoll som kan brukes til å injisere D. melanogaster larver med ulike patogener, som bakterier, beskrevet i detalj. Spesielt brukes D. melanogaster larver til injeksjoner med det menneskelige patogenet Photorhabdus asymbiotica og de ikke-patogene bakteriene Escherichia coli. Denne metoden kan brukes til manipulering og analyse av D. melanogasters immunresponser på ulike mikrobielle infeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly oppdrett
MERK: D. melanogaster livssyklusen er delt inn i fire stadier: embryo, larve, pupa og voksen. Generasjonstiden med optimale oppdrettsforhold i laboratoriet (~ 25 ° C, 60% fuktighet og tilstrekkelig mat) er ca. 10 dager fra befruktet egg til eclosed voksen. Hunnene legger ~ 100 embryoer per dag, og embryogenese varer ca 24 h22. Larvene gjennomgår tre utviklingsstadier (instars; L1-L3) på ~4 dager (L1 og L2: 24 timer og L3: 48 h). De første instar larver begynner å mate umiddelbart på overflaten av mediet. Andre instar larver burrow inn i mediet, mens tredje instar larver forlater mediet og vandrer opp hetteglasset vegger, på jakt etter et sted å pupariate for 24-48 h. D. melanogaster linjen som brukes til denne protokollen er Oregon R (FBsn0000276).
- Tilsett tørr mat som inneholder et maismel-soyabasert kosthold til et smalt polystyren hetteglass (25 mm x 95 mm) for å aboue 1/5 til 2/5 volum. Tilsett deretter 9 ml vann og la hetteglasset sitte i 1 min til dietten er helt hydrert.
- Tilsett ca 10 granulater av tørr bakergjær til hetteglasset og legg en blanding av minst 20 nyoppdagede mannlige og kvinnelige voksne fluer.
- Inkuber hetteglasset ved 25 °C på et 12:12-timers lys: mørk fotoperiodisk syklus.
- For å sikre livssyklusprogresjon, sjekk fly hetteglassene daglig og registrer de første utviklingsstadiene.
2. Valg av larver for infeksjon
- Velg larver med fin pensel (kamelhår er best) når de når den vandrende tredje instar-scenen den dagen infeksjonen skal utføres (figur 1).
- Vask de valgte larvene med Ringers løsning (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) i en liten Petri-tallerken (60 mm x 15 mm) ved fjerning fra det opprinnelige hetteglasset23.
- Legg larvene på filterpapir (150 mm diameter) som er litt fuktet med rundt 5 ml ringers løsning i en Petri-tallerken (100 mm x 15 mm) (figur 2A).
- Tilsett ~1 ml ringers oppløsning daglig på filterpapiret etter behov for å unngå tørrhet og larvaltørking.
3. Bakteriell forberedelse
- Kultur P. asymbiotica bakterier på Luria Bertani (LB) agar media ved 28 °C i 48 timer.
- Bruk et biosikkerhetsnivå 2-kabinett for å overføre en enkelt koloni av P. asymbiotica for å inokulere en flytende kultur i 10 ml LB-medier.
- Inkuber P. asymbiotica flytende kultur over natten ved 28 °C i en roterende shaker satt til 220 o/min.
- Kultur E. coli bakterier på en lignende måte, men utfør den første veksten på agar media og flytende kultur inkubasjon ved 37 °C over natten.
- Sentrifuger hver over natten bakteriekultur i 3 min ved 13.000 x g og 4 °C.
- Kast supernatanten og vask de resulterende bakterielle pelletsene tre ganger med 10 ml steril PBS.
- Sentrifuger pellets igjen i 3 min ved 13.000 x g og 4 °C.
- Fortynn hver pellets med steril PBS for å justere bakteriekonsentrasjonene til den optiske tettheten (600 nm) på 0,25 for P. asymbiotica og 0,015 for E. coli, som tilsvarer 100-300 kolonidannende enheter per larve av hvert bakteriepreparat, ved hjelp av et spektrofotometer.
4. Injektorpreparat
- Forbered kapillærene med 3,5" glasskapillære rør og en mikropipettetrekker. Still inn instrumentet på følgende måte: varme: 580; trekk: 143; hastighet: 25; forsinkelse: 1; trykk: 500.
- Bruk rette serrated medium point tang for å åpne glass kapillæren i den grad som vil tillate levering av eksperimentelle behandlinger samtidig som det forårsaker minimal skade på larver (figur 2B). For å optimalisere denne prosedyren mens du praktiserer injeksjoner, bruk Trypan Blue-oppløsning (fortynn lageret 0,4% med PBS til 0,2%) for å enkelt spore lekkasje mens du injiserer og overlevelsen til de blå larver.
- Fyll kapillæren med mineralolje ved hjelp av en plast, engangs 20 ml sprøyte med en hypodermisk nål (22 G, 25 mm lengde).
- Sett opp nanoliterinjektoren og ta oljen ut av kapillæren (figur 2C).
- Fyll kapillæren med ønsket bakteriepreparering for injeksjon. Ta løsningen fra en dråpe (~20 μL) som er plassert på parafilm. I denne protokollen ble 50,2 nL av to bakteriebestander injisert.
5. Larve injeksjon
- Bedøv D. melanogaster larver ved hjelp av karbondioksid i ~ 2 min før prosedyren.
- Overfør forsiktig de bedøvede larver til et filterpapir fuktet i Ringers løsning som forberedelse til injeksjon under et stereomikroskop. Larvene vil være sløv eller passive på dette tidspunktet.
- For å injisere larver, bruk fast trykk på dorsalsiden av den bakre enden (trakeal spirakler er tydelige i den bakre enden kontra svarte munnstykker i den fremre enden) ved hjelp av tang (figur 2D).
- Sett nålen horisontalt mot larvens bakre ende, nær kutikylen. En vellykket injeksjon vil ikke resultere i en lekkasje av den injiserte løsningen fra larver (figur 3).
- Fjern tangene som ble brukt til å legge press på larvens hale før du trekker nålen tilbake. Hvis de ikke fjernes først, kan tangene tvinge hemolymfe og / eller tarmen ut av larver fra sårstedet.
- Infiser riktig antall larver for studien som utføres. I denne spesielle protokollen ble 20 larver for hver eksperimentell tilstand injisert.
- Bruk tang, overfør forsiktig de injiserte larver til et eget fuktig filterpapir i en Petri-tallerken (10 larver per tallerken) eller et mat hetteglass (avhengig av formålet med eksperimentet) for å tillate utvinning.
- Legg Petri-rettene eller hetteglassene i en inkubator ved 25 °C. Hvis larver holdes i en Petri-tallerken, legg til Ringers løsning etter behov for å forhindre uttørking.
6. Registrering av overlevelse/dødelighet
- Registrer antall døde og levende D. melanogaster larver i henhold til de angitte eksperimentelle tidspunktene. Levende larver vil fortsette å utvikle seg til pupper og voksne.
- Bruk statistiske programmer, for eksempel Prism, til å angi rå overlevelses-/dødelighetsdata, analyser dem med log-rank (Mantel-Cox)-testen, og representer resultatene i tall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når det utføres riktig, viser injeksjoner av D. melanogaster larver en bakteriespesifikk effekt. Overlevelsesdataene ble samlet inn på flere tidspunkter etter infeksjoner av P. asymbiotica (stamme ATCC43943), E. coli (stamme K12) og PBS (figur 4). Mens D. melanogaster larver er utsatt for P. asymbiotica, som kompromitterer overlevelse raskt, larver injisert med E. coli eller PBS kontroller viser langvarige overlevelser24,25,26. Spesielt, i forhold til larver smittet med P. asymbiotica, som viser en 57% overlevelsesrate 24 timer etter injeksjon, viser larver injisert med E. coli en overlevelsesrate på 85% samtidig.
Figur 1: Valg av Drosophila melanogaster larver til injeksjon. Livssyklusen til Drosophila melanogaster, fra eggbefruktning til voksenliv, tar ca 10 dager. Under larvevekst spiser larver til de er klare til å pupere og bytte til voksne. For injeksjonseksperimenter velges tredje instar larver, som forlater kulturmediet og vandrer opp veggene i hetteglasset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skildring av Drosophila melanogaster larval injeksjon prosedyre. (A) Vandrende tredje instar larver er valgt, vasket med Ringers løsning, og plassert på filterpapir i en Petri-tallerken som forberedelse til injeksjon. (B) Ved hjelp av tang er glasskapillæren ødelagt for å tillate levering av eksperimentelle behandlinger. (C) Den programmerbare nanoliterinjektoren er satt opp som forberedelse til injeksjon under et stereomikroskop. (D) For å injisere larver påføres trykk på dorsalsiden av larvens hale ved hjelp av tang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Illustrasjon av å levere bakterieceller inn i Drosophila melanogaster larver gjennom mikroinjeksjon. Dorsalsiden av den bakre enden stabiliseres ved hjelp av tang. Deretter settes kapillæren horisontalt mot larvens bakre ende, nær neglebåndet. Etter injeksjonen fjernes tangene før de forsiktig trekker kapillæren for å forhindre hemolymflekkasje fra sårstedet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Overlevelse av Drosophila melanogaster larver etter injeksjon av patogene og ikke-patogene bakterier. Oregon R larver av D. melanogaster ble injisert med 50,2 nL Photorhabdus asymbiotica (ATCC43943), Escherichia coli (K12) eller PBS. Mens PBS- og E. coli-kontroller ikke viste noen betydning i overlevelsesforholdene, kompromitterte P. asymbiotica-injeksjoner flyoverlevelse raskt. Hver overlevelseskurve består av målinger fra tre uavhengige forsøk, hver med 20 larver (*** p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila melanogaster er blant de mest verdifulle, eksperimentelt manipulerte modellene som brukes til undersøkelser av medfødt immunitet og patogenese av ulike mikrobielle infeksjoner. Dette skyldes sin enkle og raske livssyklus, enkel vedlikehold i et laboratorium, veletablert evolusjonær genetikk og mangfoldig genetisk verktøykasse. Tidligere metoder for D. melanogaster larver injeksjoner, for eksempel bruk av en hybrid mikrofluidisk enhet eller en Narishige mikromanipulator, krever høyt spesialisert utstyr og kan være kostbart21,27. I den nåværende protokollen, for å utvide bruken av D. melanogaster, skisseres en enkel injeksjonsteknikk som representerer en effektiv og rask metode for å levere bakterier inn i hemocoel av D. melanogaster larver. Den essensielle delen av teknikken som er beskrevet her er selve injeksjonen av ønsket patogen eller andre flytende stoffer ved hjelp av en mikroinjektor. I tillegg til å beskrive denne essensielle operasjonen, beskriver vi også tilbehørsmetoder som dyrking og dyrking av bakterier og håndteringsmaterialer.
Den viktigste fordelen med denne metoden er at nålen holdes omtrent parallelt med larven, og holdingen gjøres med svært lite press på larven, og reduserer dermed muligheten for hemolymflekkasje, dødelig skade eller utilstrekkelig levering av ønsket stoff. Nålen settes deretter inn mot den bakre enden av larven for å fullføre injeksjonen. Den nøyaktige måten å holde larven på, måten å sette inn nålen på, hastigheten som ønsket stoff injiseres på, og retningen for tilbaketrekking av nålen er alle saker som best kan forbedres ved praksis. Det mest utfordrende trinnet å overvinne er å trekke nålen ut av larven uten noen resulterende lekkasje av essensielle organer. Men med presisitet og erfaring blir vanskeligheten som oppstår i løpet av dette trinnet mindre.
Denne teknikken er også et utmerket verktøy i flere applikasjoner for å introdusere en rekke stoffer på en jevn måte som kan gjentas flere ganger, og dermed gi konsistente resultater. Den raske dødeligheten observert i P. asymbiotica-infiserte larver gjenspeiler den høye virulensen av denne bakteriestammen til insekter24,25,26. P. asymbiotica er godt dokumentert for å uttrykke virulensgener under infeksjon som øker bakteriell overlevelse og patogenitet mot insektverter ved å hemme hemocyttmigrasjon og fagocytose24,25. Også forventet er larver motstandsdyktige mot injeksjoner med de ikke-patogene bakteriestammene til E. coli samt injeksjoner med PBS, og bekrefter dermed tidligere resultater i dette forskningsfeltet26. Derfor oppnås mikroinjeksjon uten noen negativ effekt på dyrets levedyktighet, slik at den kan brukes i molekylære og immunologiske studier for å utforske patogenesen av et bredt spekter av mikrobielle infeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Institutt for biovitenskap ved George Washington University (GWU) for kritisk lesning av manuskriptet. GT ble støttet gjennom et Harlan sommerstipend fra GWU. Alle grafiske figurer ble laget ved hjelp av BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes - plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
