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用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法

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DOI：

10.3791/63391

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2022年1月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Evolution and Medicine, School of Life Sciences, Arizona State University, 2United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology

本文内容

摘要

我们描述了用于测定蚊虫和果蝇杀虫剂敏感性的局部施用生物测定法的方法学及其重要性。本方法通量高，利用昆虫的总质量——从而能够计算基于质量归一化的致死剂量而非浓度——且相较于其他类似方法可能具有更低的变异性。

摘要

杀虫剂在公共卫生和农业中的持续使用已导致广泛的杀虫剂抗性，阻碍了防控措施的有效性。蚊虫种群杀虫剂抗性监测通常通过美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶法生物测定或世界卫生组织（WHO）管式试验进行。然而，由于昆虫与杀虫剂接触程度存在差异，这些方法可能导致死亡率数据变异性较高 昆虫、测试生物数量相对较少、种群间质量差异显著以及环境条件持续变化，导致结果存在变异性。本文介绍了经改进的表面施用生物测定法，作为一种高通量表型生物测定方法，适用于蚊虫和果蝇，可用于大量昆虫的检测 一系列杀虫剂浓度

该检测方法具有以下优势：1）确保每种生物个体均接受一致的处理并充分接触杀虫剂；2）生成高度特异的剂量-反应曲线，能够校正不同品系及性别间平均质量的差异（对于野外采集的生物样本尤为重要）；3）可计算具有严格统计学意义的半数致死剂量（LD50），这对于抗性倍数比较至关重要——这是一种区别于诊断剂量致死率检测的替代性监测方法，后者也常用于幼虫杀虫剂抗性监测。本检测方法可作为精确表型鉴定蚊虫种群的有力补充工具，并且如以果蝇为例所示，该方法可轻松适配于其他昆虫物种。我们认为，该检测方法将有助于弥合多种昆虫中杀虫剂抗性的基因型与表型之间的差距。

引言

蚊子因传播疾病每年导致超过70万人死亡，其中仅疟疾所致死亡就占一半以上1。目前预防疟疾及其他虫媒传播疾病的主要方法是使用杀虫剂，通常以长效杀虫蚊帐或室内滞留喷洒的形式应用2。然而，杀虫剂抗性在蚊子及其他媒介昆虫中普遍存在，农业害虫中也广泛存在此类抗性3,4。为了有效管理抗性问题，监测工作至关重要5。为此，亟需高准确性和高通量的抗性检测方法。目前，用于蚊子杀虫剂抗性监测最广泛使用的方法是WHO管试验6和CDC瓶式生物测定法7。对于果蝇，残留接触施药法（类似于CDC瓶式生物测定法） 是一种常用的杀虫剂生物测定方法8,9,10。然而，这些方法的数据变异性通常较高，当暴露于亚致死剂量时，同一实验室蚊子品系在CDC瓶式测定中的死亡率范围约为20–70%，在WHO管试验中为0–50%11。这种变异令人意外，因为大多数实验室品系的遗传变异有限，理论上应导致种群中杀虫剂敏感性的变异较小。尽管如此，生物测定结果中仍观察到较高水平的变异。

这种变异的潜在来源可能包括：在生物测定过程中，由于通过表面间接接触杀虫剂，导致样本间杀虫剂暴露不均、环境效应异质性、相同基因型个体之间的正常生物学差异，以及同一种群中个体质量的差异12。一种较少使用但可重复性更高的方法是点滴法生物测定。在此方法中，杀虫剂被直接施用于每只昆虫13,14，从而消除了同次测定中不同样本暴露程度不一致的影响因素。然而，由于该方法通量较低，通常不被用作蚊虫种群杀虫剂敏感性监测的常规工具。本文提出了一种改良的点滴法生物测定方案，可在实现较高通量处理的同时，校正昆虫个体质量差异带来的影响——这一参数与杀虫剂敏感性的变化密切相关12。减少因杀虫剂暴露不均导致的死亡率数据中的噪声和与质量相关的变异，将有助于更准确地开展技术性抗性监测11,15。此类数据可用于更精确地将表型抗性与遗传标记、适合度参数和/或媒介能力相关联。此外，我们还展示了如何通过在果蝇（一种体型较小的昆虫物种）上应用点滴法生物测定，轻松将该方法适配于其他昆虫物种。

上述残留接触检测方法的主要局限性在于，在同一次实验中，不同样本所接触的杀虫剂暴露量可能存在差异。在CDC瓶式生物测定和接触法中，同一次实验的不同重复之间，昆虫接触的杀虫剂暴露量也可能存在差异。昆虫暴露于分布在玻璃瓶内壁（CDC瓶式生物测定和接触法）或浸渍纸张（WHO管式试验）上的杀虫剂。玻璃和纸张表面的杀虫剂浓度是已知的，并通过筛选已知基因型的不同物种预先确定。然而，昆虫实际可吸收的杀虫剂量可能因所用表面材料、杀虫剂混合物的成分以及杀虫剂在表面材料上分布的均匀程度而存在显著差异16,17。在CDC瓶式生物测定中，瓶内壁的杀虫剂涂层依赖于各实验室和操作人员所采用的操作流程。在WHO管式试验中，经杀虫剂处理的纸张为集中生产，因此在不同实验室之间很可能具有较高的均一性。然而，在WHO管式试验中，暴露管允许样本停留在未接触杀虫剂的金属网表面，从而导致每次测试中不同样本之间的杀虫剂暴露可能存在不均一性。通过上述每种方法实际被样本摄取和吸收的杀虫剂量仍需进一步研究18。

此外，CDC瓶法生物测定、WHO管法试验和接触法通常作为阈值测定方法，仅测试一种预设的杀虫剂浓度。该方法可准确检测抗性的存在，在抗性监测中具有重要价值（尤其是在抗性扩散期间）。然而，阈值测定无法量化抗性的强度，而抗性强度可能更能够预测干预措施的效果。若在这些方法中使用多种杀虫剂浓度，则可将其用作强度测定。针对CDC瓶法生物测定和WHO管法试验，已有研究通过测试预设鉴别剂量的5倍和10倍浓度来弥补监测中的这一不足6,19。尽管使用多个剂量有助于更好地区分不同抗性种群，但3至5个（预设）剂量所提供的分辨率仍有限，难以精确计算致死浓度。此外，此类测定中常使用不同体型的蚊虫。然而，个体质量至关重要，因为较大的个体可能需要更高的剂量才能致死，其单位质量的有效剂量将远低于较小个体12。计算基于质量归一化的致死剂量（单位昆虫质量所对应的杀虫剂用量）将比常用的致死浓度（例如，单位表面积所对应的杀虫剂用量）更具参考价值，因为它考虑了不同性别、种群和基因型之间昆虫质量的差异。此类数据有助于弥合实验室与野外研究中基因型抗性与表型抗性之间的差距，同时也可为计算针对已知平均质量昆虫种群所需的施用浓度提供简便方法。

使用基于单位质量标准化的半数致死剂量（LD50）还具有多项其他优势。在人类和兽医毒理学中，以 mg/kg（= ng/mg）表示特定化合物毒性的评估是标准做法14，且 LD50 值通常可在材料安全数据表中找到。致死剂量还可实现不同化学物质对同一物种，或同一化学物质对不同物种毒性的直接比较20，并有助于对新型杀虫剂和化学品进行高质量评价13。此外，与基于诊断剂量致死率结果得出的抗性比值相比，LD50 能提供更具意义且更准确的抗性比值，后者可能高估种群中存在的抗性水平。因此，该检测方法适用于常规监测项目，可通过基于更多样本量计算得出的单位质量标准化致死剂量，实现比其他生物测定推荐样本量更严格的抗性监测21。

局部施用法已被用于蚊虫和蝇类的杀虫剂敏感性监测，作为在已知或怀疑存在抗性情况下的标准杀虫剂敏感性生物测定的替代方法22,23，同时也用于某些害虫昆虫的监测24，以更准确地评估抗性特征和杀虫剂的内在毒性21。在局部施用生物测定中，杀虫剂被直接施加于每只昆虫个体，从而最大程度减少杀虫剂暴露量的变异。本文介绍了一种经过轻微改进和优化的方法，可在短时间内对大量昆虫施加杀虫剂处理，同时控制昆虫体重因素22。这种高通量且具有良好重复性的方法，可作为常规杀虫剂敏感性监测的有力补充工具。

方案

注意：杀虫剂可能对人类、动物和环境造成危害25。强烈建议采取预防措施，接受相关培训，并使用个人防护装备。务必遵守所使用的所有杀虫剂和溶剂的材料安全数据表中的规定。

1. 标本后处理

  1. 饲养3至5日龄的成年蚊虫。
    注意：以下方案反映的是 埃及伊蚊 饲养，严格遵循联合国粮食及农业组织指南26.
    1. 在27℃下饲养蚊子的所有生命阶段 ± 1 °C 和 75 ± 5% 相对湿度，12小时光照与12小时黑暗交替循环。
    2. 将蚊卵浸入去离子水中，并加入酵母以孵化蚊卵26或将浸没的卵放入真空室中处理30分钟。
      注意：两种方法均可降低水中的氧气含量，并促进孵化27.
    3. 在托盘中为刚孵化的仔鱼提供鱼食（或等效饲料，如研磨的猫粮颗粒），并尽量保持各托盘间的仔鱼密度一致，因为仔鱼密度会影响其发育。12 （例如，每盘200-250条幼虫，盛有总计1.5 L水）
    4. 每隔一天喂食幼虫一次，直至其进入蛹期（约7-10天），根据需要增加食物量。
      注意：投喂过少会导致幼虫生长受阻，且幼虫间可能发生相互捕食；投喂过多则可能导致幼虫死亡，使水质恶化。
    5. 蛹发育完成后，每天将其转移至成蚊饲养笼中的水碗内，并提供10%蔗糖溶液 随意.
    6. 记录成虫羽化的第一天。在开始羽化两天后，将剩余的蛹从笼中移除。
      注意：雄性蚊子羽化速度较快。需分别记录雄蚊和雌蚊的羽化情况，并确保每次试验均有足够数量的雄蚊和雌蚊可供使用。
    7. 移除蛹后等待3天，以获得用于测试的3-5日龄蚊虫。
  2. 果蝇后部（大致遵循苏黎世大学的实验方案）28).
    1. 后部 果蝇 保存在23℃的菌种保藏瓶中的菌株 ± 1 °C 和 60 ± 5% 相对湿度，12小时光照与12小时黑暗交替循环。
      注意： 果蝇 储存瓶中应含有 75 mL 标准果蝇培养基，先将液态培养基倒入瓶底，然后静置过夜使其凝固。
    2. 每两周将果蝇转移至装有新鲜培养基的新培养瓶中，以防止种群过度拥挤和霉菌生长。操作时，使用手持式二氧化碳（CO₂）装置麻醉果蝇，2）分配器将麻醉后的果蝇转移至置于冰袋或冷却板上的称量纸上，使用细头画笔将果蝇刷入新的培养瓶中。操作过程中务必使培养瓶保持水平，以防止果蝇落入培养基中溺亡。

2. 采用重量法配制杀虫剂制剂

  1. 在通风橱内使用精度为 0.1 mg 的分析天平，采用重量法配制第一种储备液。
    注意：重量法通过质量来测量所添加杀虫剂和溶剂的量。常规方法（体积法）在配制第一种储备液时需使用分析天平测量所添加的（固体）杀虫剂的量；然而，所添加溶剂的量以及后续所有稀释步骤均仅通过体积测量。重量法具有更高的准确性，因此更受推荐。
    1. 确定第一种储备液的目标杀虫剂浓度和目标体积（若使用 15 mL 锥形管，建议最大体积为 10 mL，以防止在冷冻储存时发生溢出），并根据公式（1）计算所需添加的杀虫剂有效成分（AI）的量：
       figure-protocol-1 （1）
    2. 准备一个储存管（体积较大时推荐使用 15 mL 锥形管，体积为 1 mL 或更小时推荐使用 1.5 mL 微量离心螺口管），并标注杀虫剂和溶剂名称、目标浓度及配制日期。将管子和管盖置于天平上的支架或固定器中，归零天平。
    3. 称取步骤 2.1.1 中确定的所需量的固体或液体杀虫剂有效成分（例如，代表性数据中使用的溴氰菊酯）至管中，并记录质量。
    4. 将天平归零，向管中加入所需体积的溶剂（相当于目标体积），立即盖紧管盖，记录质量。加入溶剂（此处使用丙酮）后应立即盖紧管盖，以避免蒸发，并混匀溶液。
    5. 记录室温。某些溶剂（如丙酮）的体积（以及相应的密度）会随温度发生显著变化。
    6. 若需立即储存，应用 Parafilm 封住管盖（以减少蒸发），将管子置于管架/固定器中（保持直立，防止泄漏），用铝箔包裹（防止紫外线照射），再放入可密封的塑料袋中（进一步减少蒸发），最后将袋子置于 -20 °C 冰箱中。若不立即储存，应确保管盖已拧紧，并用铝箔或避光容器覆盖。
    7. 通过将所添加杀虫剂有效成分的质量除以所添加溶剂的体积（若杀虫剂为液体形式，还需加上所添加杀虫剂的体积），计算储备液的实际浓度（mg/mL）。为计算所添加溶剂（或液体杀虫剂）的体积，应将所添加的质量除以在记录温度下对应的已知密度。
    8. 通过将所添加的总质量（杀虫剂和溶剂）除以所添加的总体积（溶剂和杀虫剂，若杀虫剂为液体形式），计算储备液的密度（g/mL）。将液体质量转换为体积的方法见步骤 2.1.7。
  2. 通过 10% 稀释法对初始储备液进行逐级稀释。如有需要，可利用这些逐级稀释液建立初步的剂量-反应曲线，以确定生物测定中目标杀虫剂浓度范围。
    1. 计算每个管中需添加的杀虫剂储备液体积和溶剂体积（例如，将 1 mL 杀虫剂储备液加入 9 mL 溶剂中，得到 10 mL 的稀释液，其浓度为前一浓度的 10%）。
    2. 将储备液涡旋混匀 10 秒。将已预先标记的第一个稀释管置于天平上归零。使用移液器将所需体积的储备液加入第一个稀释管中。立即盖紧两个管子的管盖，并记录第一个稀释管中的质量。
    3. 再次将第一个稀释管归零，加入所需体积的溶剂。立即盖紧管盖，记录所添加溶剂的质量，并涡旋混匀第一个稀释液 10 秒。
    4. 对后续各稀释管重复步骤 2.2.2 和 2.2.3。
    5. 按照步骤 2.1.6 所述方法储存所有稀释液。
    6. 按照步骤 2.1.7 的方法计算各稀释液的实际浓度。
    7. 通过将所添加的总质量（杀虫剂溶液和溶剂）除以所添加的总体积（杀虫剂溶液和溶剂），计算每种杀虫剂稀释液的密度。对于每次逐级稀释，使用前一级杀虫剂稀释液的密度，根据公式（2）计算新稀释液的密度：
      figure-protocol-2 （2）
  3. 可选：通过逐级稀释法配制浓度增量更小的杀虫剂稀释液。
    1. 借助初始逐级稀释的剂量-反应曲线、先前试验或已发表文献，选择各新溶液的浓度和体积。
      注意：所选浓度应使死亡率范围在 0–100% 之间，且至少包含该范围内的三个浓度，以便进行概率单位（Probit）分析。
    2. 将逐级稀释液作为储备液，用于配制新的稀释液，并按照步骤 2.2 在 10 倍稀释液之间制备新的稀释液。
  4. 可选：对杀虫剂溶液进行分装。若配制了较大体积的杀虫剂溶液，建议将其分装至 1.5 mL 螺口管中，以避免因频繁操作和暴露于光线下而导致储备液污染、蒸发或降解。
    1. 从最低浓度开始分装，并逐步向高浓度进行，以减少潜在污染。每次分装前，先将各储备液涡旋混匀 10 秒，然后打开管盖，将所需体积（例如 0.5 mL）移取至已预先标记的螺口管中。
    2. 将分装后的溶液储存于避光容器中，并置于 -20 °C 冰箱中。
      注意：建议定期（每月）用新分装的小份样品直接从储备杀虫剂稀释液中替换旧的分装样品。这将限制污染在其他实验中传播，或因样品在实验台使用过程中发生蒸发或紫外线降解而引起的变化。只要杀虫剂溶液储存得当（参见步骤 2.1.6）并保存在 -20 °C 冰箱中，本方案可在此处暂停，并可在数年后重新启动。
  5. 在储存前使用永久性记号笔标记液面，以监测溶剂蒸发情况。每次取出杀虫剂溶液进行分装时，均应标记液面位置。

3. 准备局部施用生物测定工作区

注意：建议在台式昆虫操作帐篷中进行操作，以便更轻松地捕捉逃逸的蚊子或苍蝇。昆虫操作帐篷的图片见补充图S1。

  1. 从冷冻箱中取出所需的杀虫剂溶液，立即涡旋振荡，并将其放入避光容器中，在室温下放置，使杀虫剂恢复至室温后再使用。
    注意：在较低温度下，杀虫剂活性成分可能从溶剂中析出。此外，丙酮的体积会随温度变化，可能导致施用的杀虫剂剂量发生改变。混合溶液并使其恢复至室温有助于确保使用杀虫剂溶液时的一致性。
  2. 根据材料表中所列，在昆虫操作帐篷内准备好表面施药试验所需的所有工具和材料。
  3. 使用分析纯丙酮清洗注射器筒和针头，每次丙酮分装液完成5次清洗。共使用5份独立的丙酮分装液，总计完成25次清洗。注射器和重复移液器部件参见补充图S2。
    1. 准备5个微量离心管，每管加入0.5 mL丙酮。
    2. 从第一个管中吸取0.025 mL丙酮至注射器筒内，然后迅速推动活塞将丙酮排入废液容器中。重复此操作四次，共完成同一份丙酮分装液的5次清洗。随后，将注射器筒完全吸入空气，并将空气及可能残留的丙酮排入废液容器中。重复此操作两次，共完成三次“空气清洗”。
    3. 对剩余的4管丙酮重复步骤3.3.2。
    4. 通过轻微向后拉动活塞（约5 mm），在注射器筒内活塞与针头顶部之间形成一个气腔。
      注意：该气腔可防止活塞接触杀虫剂溶液，减少杀虫剂残留转移。
    5. 将注射器放置一旁，待表面施药时使用。
  4. 建立一个包含待施用剂量的对照表，并根据随机数字或字母生成器分配随机编号（参见补充文件1）。
  5. 用随机编号标记塑料饲养杯，以便进行盲法死亡率评估。
    注意：如有需要，本方案可在此暂停，并在之后的某一天或时间重新开始。若暂停时间超过数小时，建议重复步骤3.3以确保注射器清洁，并将杀虫剂溶液放回冷冻箱保存；在对昆虫施药前约一小时再次取出，并重复步骤3.1。

4. 为局部生物测定准备样品。操作流程参见图1

  1. 排序 并称重 的 蚊子
    1. 使用由吸气驱动的吸虫器吸取实验所需数量的3至5日龄成蚊（额外多取若干以弥补损伤个体）。将吸虫器尖端插入锥形管（每管最多放入100只蚊虫），并在尖端外包裹棉花，轻轻呼气并轻敲吸虫器，使蚊虫转移至管中。取出吸虫器尖端后，用棉花塞住管口，再盖上管盖。避免一次性吸入或装入过多蚊虫，以免对蚊虫造成额外应激，导致死亡。
    2. 将装有蚊子的管子置于至少10分钟，以短暂击倒蚊子 4 °C 或将其埋入冰盒中的冰块下。
      注意：蚊子可以保存在 2 °C 数小时内死亡率极低29；但最好尽量缩短蚊虫在冰上的时间，以减少潜在的不利影响。
    3. 将击倒的蚊子转移至昆虫操作帐篷中，小心地将蚊子倾倒至放置于冰上的塑料托盘（如培养皿）中。每次倾倒约50只蚊子，以确保每只蚊子均接触下方低温托盘并保持击倒状态。
    4. 用镊子轻轻夹住蚊子的足（或翅膀）按性别进行分选，并将不同性别的蚊子分别放入不同的盛放容器中。分选过程中统计每种性别的蚊子数量，达到所需数量时即停止。分选时应剔除受伤个体（如缺失足部）、体型异常偏大（如腹部异常膨大）或体型过小（肉眼即可明显识别为小于该种群平均体型）的蚊子。
      注意：通过附肢抓握蚊虫可减少对其柔软的主要身体部位（如腹部）的结构损伤。
    5. 记录每杯蚊虫的重量 使用精度为0.1 mg的分析天平。
      1. 将一个空杯子加上培养皿作为盖子放在天平上，归零天平。将蚊子倒入容器中，盖上盖子，然后将容器放回天平上。
      2. 在评分表上记录标本的总重量和数量（参见 补充文件 2立即将装有样本的容器放回冰上，以保持其处于静止状态。
      3. 重复步骤 4.1.5.1–4.1.5.2，直至所有样本杯均完成称重。
    6. 将准备好的蚊子用冰上标记有随机编号的杯子分成每组20-25只。转移蚊子时，应尽量减少镊子造成的应激和物理损伤。理想情况下，使用镊子夹取蚊子仅1-2次：一次用于分拣/称重，可能第二次用于转移到实验杯中。
      注：每杯蚊虫数量以20-25只为宜，此数量足以满足一个重复实验的需求，便于评估死亡率，且不会因密度过高导致杯内蚊虫产生密度相关的应激或死亡。
  2. 排序 并称量果蝇的重量
    1. 使用 CO₂ 麻醉果蝇2 7 秒。
      注意：如果果蝇暴露于CO2 超过7秒后，它们在苏醒时可能会出现爬行和飞行困难30.
    2. 将果蝇倒入包裹在实验台纸中的冰袋上，用细头画笔分离并计数雄性和雌性果蝇。
    3. 使用画笔轻轻挑取选定的果蝇，放入一个干净的空培养瓶中。选择数量相等的雄性和雌性果蝇（例如，15只雄性和15只雌性），并在培养瓶上标注品系名称和果蝇总数（例如，Canton-S，30只果蝇）。
      注意：果蝇实验中应保证雌雄果蝇数量相等，因为雄性果蝇在脱离雌性环境后，彼此之间的攻击性可能增强31因此，为了避免非杀虫剂导致的死亡或损伤，最好使用数量相等的雄性和雌性果蝇（或完全不使用雄性果蝇）。
    4. 使用分析天平记录每瓶果蝇的重量。
      1. 将一个空瓶（用随机编号标记，参见步骤3.4）与一个用作盖子的培养皿一起放在天平上，并对天平去皮。
        注意：建议使用玻璃小瓶处理果蝇，因为玻璃可显著减少静电。
      2. 使用CO₂麻醉对应于该管随机编号的果蝇瓶2 7 秒。
      3. 将果蝇倒入称量纸上，利用纸张作为漏斗将果蝇导入小瓶中。将培养皿的盖子盖在装有果蝇的小瓶上方，并将整个装置置于天平上。
      4. 在记分表上记录标本的总重量和数量，然后立即将装有果蝇的试剂瓶（瓶盖保持盖紧以防果蝇逃逸）放入盛有冰块的托盘中。
      5. 对每瓶果蝇重复步骤 4.2.4.1–4.2.4.4。
  3. 上述步骤完成后，立即进入下一节。

5. 样品给药

  1. 用适当的杀虫剂浓度装填注射器。从最低浓度剂量开始，依次对每组生物使用逐渐升高的浓度剂量。为避免浪费，仅装填所需体积的杀虫剂，并额外加入推荐的 2 µL。
  2. 将样本倾倒至置于冰上托盘中的称量纸上。使用洁净、无杀虫剂的画笔或棉签将聚集在一起的样本分开，以便于逐个给药。对于蚊虫，还需使用画笔确保每个样本仰卧，使其腹面朝上。
  3. 使用注射器将一滴杀虫剂溶液（对照组使用丙酮）施加于蚊虫的胸部和腹部腹面区域，或果蝇的背面区域。对于果蝇等体型较小的昆虫，使用 10 µL 注射器施加 0.2 µL 的液滴；对于蚊虫，则使用 25 µL 注射器施加 0.5 µL 的液滴。
    注意：主要身体部位（如头部、胸部和腹部）与附肢（如翅膀、腿或喙）在杀虫剂敏感性方面无显著差异32。因此，只要药滴施加在主体躯干上，施用位置无需完全精确。选择蚊虫的胸部和腹部腹面作为施药部位，是因为它们在击倒后常仰卧；而选择果蝇的背面，是因为它们在击倒后常腹面朝下。施药部位的这种较低特异性有助于提高本方法的通量。
  4. 立即把样本倒回标记好的塑料杯中，并用网罩和橡皮筋覆盖杯口。将杯子放入存放托盘，并在杯上注明在此过程中死亡、受损或逃逸的样本（以便在最终统计该杯样本数量时予以排除）。对于第一个杯子，记录完成给药的时间。
  5. 更换用于放置样本的称量纸，以避免不同剂量之间的杀虫剂污染。
  6. 重复对每个杯子进行给药，直至所有样本均已被施加相应浓度的杀虫剂，并记录全部样本完成给药的结束时间。
  7. 通过浸湿的棉球为每个杯子提供 10% 蔗糖溶液，并将杯子放置一旁，待次日评估死亡率。将蚊虫储存在 27 ± 1 °C、相对湿度 75 ± 5% 的条件下5，果蝇则储存在 23 ± 1 °C、相对湿度 60 ± 5% 的条件下。
    注意：挤压棉球时需小心，避免过湿或过干。棉球应保持湿润但不滴水。杯内滴落的糖水可能导致样本死亡，从而影响杀虫剂死亡率的评估。

6. 评估死亡率

  1. 在开始杀虫剂暴露后24小时记录样本死亡率。根据世界卫生组织（WHO）的描述6，若蚊虫能够飞行并保持直立姿态，则归类为存活；若无法移动或出现共济失调（无法站立或起飞），则归类为死亡。果蝇的死亡率评估采用相同的判定标准8,33。
    注意：如需评估延迟死亡率，可在48小时和72小时时再次进行死亡率评估，并每日更换糖水。
  2. 记录死亡率后，将所有装有样本的容器放入密封袋中，置于冰箱冷冻至少1小时，以确保所有样本均已死亡，然后再进行处理或后续使用（如分子或化学分析）。

7. 进行重复实验

  1. 在新的一组样本上重复步骤 3-6，注意每天在同一时间进行重复实验，因为杀虫剂的敏感性可能随一天中的时间而变化34。
  2. 每种浓度至少进行 3 次重复实验，以准确估算致死剂量（LD50，即杀死 50% 样本的剂量）。若观察到变异性较高，应增加重复次数。
  3. 在收集完所有数据后完成分析。

8. 分析结果

  1. 在电子表格程序中记录数据，并使用随机 ID 编码对数据进行解盲（参见步骤 3.4）。将数据保存为文本文件（示例数据见补充文件 3），用于在统计软件 R35 中进行分析（示例 R 代码见补充文件 4），或使用其他选定软件36。
  2. 在软件程序中完成以下分析。示例 R 代码见补充文件 4。
    1. 根据下方公式（3）计算每单位标本质量（mg）所接受的杀虫剂剂量（ng）：
      figure-protocol-3 （3）
    2. 计算死亡率，并应用 Abbott 公式37，根据各对照组中观察到的死亡率对死亡率进行校正37。或者，也可使用 Schneider-Orelli（1947）公式对死亡率进行校正38。无论对照组死亡率如何，均应对所有数据应用上述任一校正方法（如先前所述37并已实施39），除非对照组数据异常偏高（见下文讨论）。
      注：Abbott 公式及其等效替代方法（如 Schneider-Orelli 公式）会按对照组未观察到的死亡程度对死亡率值进行比例性调整，且不会降低已达到 100% 死亡率的样本杯中的死亡率。更多详情请参阅相关文献引用。
    3. 将校正后的死亡率数据转换为概率单位（probit）值40，并在杀虫剂剂量与转换后的死亡率数据之间进行线性回归分析。使用卡方检验评估线性模型的拟合优度。
      注：在进行概率单位转换前，需将死亡率为 0（0% 死亡率）或 1（100% 死亡率）的数据从数据集中移除。这是由于概率单位转换本身的性质所决定的。因此，最终绘图中的数据将不包括阳性或阴性对照，或其他经 Abbott 校正后导致死亡率为 0% 或 100% 的任何数据。
    4. 根据已发表的方法39,41,42，按标本品系、种群和/或性别分别计算 LD50 及其 95% 置信区间（CIs）。
    5. 注：若两个品系的 95% 置信区间 无重叠，则表明这两个品系的剂量反应存在显著差异。
    6. 如适用，通过将目标品系的 LD50 除以参考/对照品系的 LD50 来计算抗性比值（RRs）。

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图1局部应用实验方案示意图 局部应用实验方案始于（A) 在冰上分选样本，随后进行（B) 在分析天平上称量样品，(C）用杀虫剂溶液处理样本，以及（D) 暴露于杀虫剂后，提供10%蔗糖溶液，静置24小时 随意 （通过浸湿的棉球），随后进行死亡率评估。红色箭头指示杀虫剂对蚊子（左）和果蝇（右）的目标施用位置。注意：图像未按比例绘制。 请点击此处以查看该图的放大版本。

结果

这些代表性结果包括两种不同的埃及伊蚊（Ae. aegypti）品系：洛克菲勒（ROCK）品系，以及来自佛罗里达州的已知具有击倒抗性突变 F1534C 和 V1016I（IICC 基因型）的野外分离品系。此外，还包含黑腹果蝇（Drosophila melanogaster，Canton-S 品系）。

图2 和 图3 展示了根据上述实验方案测试的不同品系及性别的每种生物体的剂量-反应关系。在每个蚊虫品系内，雄蚊与雌蚊之间的剂量-反应曲线未观察到显著差异（ROCK 品系：t = 1.70，p = 0.098；IICC 品系：t = 0.64，p = 0.527），因此将每个蚊虫品系中两性别的数据合并分析。ROCK 和 IICC 品系的质量标准化 LD50 分别为 0.008 ng/mg（95% CI：0–0.104）和 0.336 ng/mg（95% CI：0.235–0.438）。这些值的 95% 置信区间无重叠，表明两个品系的剂量反应存在显著差异。IICC 品系相对于 ROCK 品系的抗性比（RR）为 41.7，根据世界卫生组织（WHO）标准，属于高度抗性5。对于 Canton-S 果蝇，其质量标准化 LD50 为 0.213 ng/mg（95% CI：0–0.490）。

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图2：通过点滴法生物测定获得的蚊虫代表性数据。 根据上述方案使用溴氰菊酯和蚊虫进行点滴法生物测定所获得的代表性剂量-反应数据：（A）雌性 Ae. aegypti ROCK（n = 880）和 IICC（n = 550）品系；（B）雄性 Ae. aegypti ROCK（n = 880）和 IICC（n = 569）品系。溴氰菊酯测试浓度范围为 0.00075 ng/µL 至 9.68705 ng/µL，x 轴表示每只蚊虫平均质量（mg）所施加的溴氰菊酯剂量（ng）。y 轴以比例形式显示死亡率。每组数据点群中穿过数据的黑线代表对应品系和性别特异性的线性回归曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：通过局部施用生物测定法获得的果蝇代表性数据。 根据上述方案，使用溴氰菊酯和果蝇（D. melanogaster Canton-S 品系，n = 1014）进行局部施用生物测定所得到的代表性剂量-反应数据。溴氰菊酯的测试浓度范围为 0.00499 至 5.02876 ng/µL，横轴表示每单位平均果蝇质量（mg）所施加的溴氰菊酯剂量（ng）。纵轴显示死亡率的比例。黑色线条代表线性回归结果。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：台式昆虫操作帐篷。 台式昆虫操作帐篷用于在进行表面施用实验时更方便地捕捉逃逸的蚊子或苍蝇。图中结构在 A 中为关闭状态，在 B 中为打开状态。该结构由聚氯乙烯（PVC）管和细网眼织物制成。请点击此处下载此文件。

补充图 S2：注射器与重复加样装置单元。 用于昆虫给药的注射器与重复加样装置单元。主要部件包括 1）针头，2）注射器筒体，3）推杆，4）重复加样器，以及 5）重复加样按钮。请点击此处下载该文件。

补充文件 1：随机化脚本：用于为每次实验的所有杯子生成无偏标签的随机化脚本。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：死亡率评分表：用于辅助死亡率评估的死亡率评分表。该表格还包含用于记录方案中提及的所有其他重要信息的位置，例如杀虫剂施用的开始和结束时间。请点击此处下载该文件。

补充文件 3：示例死亡率数据：用于生成图 2的示例数据文件。各列标题说明如下：“id” = 每个数据点的识别代码；“species” = 物种名称（例如，Aedes aegypti）；“insecticide” = 局部施用的杀虫剂名称（例如，Deltamethrin）；“strain” = 蚊株名称（例如，ROCK）；“date” = 局部施用开始日期；“sex” = 蚊虫性别；“age” = 蚊虫年龄（young = 3–5 日龄；old = 4 周龄）；“total.mosq” = 批次中称重的蚊虫总数；“weight” = 批次内所有蚊虫的总重量（mg）；“concentration” = 杀虫剂浓度（µg/mL）；“syringe” = 注射器液滴体积（mL）；“dose” = 施用于每只蚊虫的杀虫剂有效成分含量（ng）；“total” = 每杯中蚊虫数量；“dead” = 每杯中死亡蚊虫数量。请点击此处下载该文件。

补充文件 4：R 分析代码：可用于完成概率分析（参见方案第 8 步所述）的示例 R 代码。该 R 代码可配合代表性结果（可通过补充示例数据文件获取）一起使用。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种适用于蚊子和果蝇的局部施用检测的改进方案。该方法所需专用设备极少，因此可轻松修改后用于野外工作及其他生物的研究。下文将详细说明本方案的关键步骤、可能的修改方法、故障排除建议、方法的局限性及其重要意义。

实验方案中的关键步骤： 本方案中有三个关键步骤，若操作不当，将极大影响生物测定的结果：杀虫剂浓度的准确性、试虫击倒情况以及死亡率评估。

杀虫剂浓度准确性：
准确配制杀虫剂溶液对于获得可重复的剂量-反应曲线和有意义的结果至关重要。在文献中，无论是CDC瓶法生物测定7还是点滴法应用13,14,43，通常采用体积法配制杀虫剂溶液。然而，本文所述的重量法由于引入了（与温度相关的）密度参数，考虑了温度的影响，因而具有更高的内在准确性，可实现更精确的溶液配制。

标本击倒：
击倒标本是本方法的关键步骤之一，有助于准确施用杀虫剂并进行称重测量。然而，击倒生物体不可避免地存在造成物理应激和损伤的风险，此前已有研究证实30。因此，在击倒标本时应谨慎操作，注意确保：i）每个标本的击倒时间相近，ii）击倒持续时间尽可能短，iii）所有标本采用一致的击倒方法。此外，建议在施用杀虫剂前单独测试击倒方法，以确认该方法有效，且不会导致对照组死亡率超过10%。初学者在初次测试时可能耗时较长，从而延长击倒时间。因此，在解读首次实验结果时应格外谨慎。

死亡率评估：
评估死亡率可能具有挑战性，尤其是当杀虫剂并未完全杀死蚊子或苍蝇，而仅仅是将其击倒或致残时。因此，了解杀虫剂对靶标生物的影响，并对死亡标准有明确定义至关重要。 "死亡的" （或基因敲低）的生物体。此外，建议由同一人评估不同剂量组和重复组之间的死亡率，以减少变异。

方案修改：以下描述的多种修改可用于改进本方案的通用性和可操作性。

将检测方法适用于体型更小或更大的昆虫：
使用体型更小或更大的样本时，建议相应地减少或增加杀虫剂的施用体积。例如，我们将蚊子实验方案调整用于果蝇时，将0.5 µL的剂量减少至0.2 µL。请确保根据所选的剂量体积选用合适规格的注射器。

将检测方法应用于野外昆虫：
使用野外昆虫时，昆虫个体大小可能存在更大差异。因此，建议将昆虫按较小群体（例如，每杯）分别称重，而不是以大群体（例如，一次实验所用的全部昆虫）整体称重。这有助于反映因野外昆虫质量差异而导致的杀虫剂敏感性潜在变化。

设备改装：
昆虫操作帐篷：可在由PVC管和蚊帐网简单搭建的昆虫操作帐篷内完成样本给药。该帐篷可作为封闭房间（例如昆虫饲养室）的替代方案，有助于避免在可能进行昆虫饲养的区域产生杀虫剂污染。这种昆虫操作帐篷易于搭建且成本低廉（约70美元）。此外，也可购买专用的昆虫操作笼（约425美元）。

冷藏台：可使用冰袋或冰盘来麻醉标本和/或保持标本处于麻醉状态。

培养箱：建议使用培养箱来饲养标本，并在杀虫剂处理后将标本保持24小时。如果无法获得培养箱，也可自行构建。构建培养箱所需的设备包括保温容器、加湿器、加热电缆、温湿度控制器以及光源，总成本约为170美元，该方案基于并扩展了先前的方法44。

持杯：尽管使用塑料杯来分类和盛放处理后的样本，但涂蜡的纸杯或玻璃容器也可作为合适的替代品。

生物体及生活史阶段的修饰：
该方法具有高度适应性，可用于其他载体、昆虫和/或节肢动物，例如Culex quinquefasciatus蚊子32、家蝇32和蟑螂45，也可用于非成虫生活史阶段，例如蚊子幼虫46。

局部施用位置的调整：
本方法描述了将杀虫剂施用于蚊虫的腹胸部及腹部区域（果蝇则施用于背部）。然而，只要暴露部位保持一致，也可采用其他施用位置。保持一致性非常重要，因为杀虫剂的敏感性可能因施用位置不同而有所差异32。

故障排除建议：该方法包含若干在初始阶段具有挑战性的步骤。以下列出了一些可能遇到的最常见问题。

杀虫剂溶液泄漏/挥发：
杀虫剂通常溶解于丙酮中，丙酮是一种高度挥发性的化合物。这意味着丙酮在室温下会迅速蒸发，导致杀虫剂浓度随时间升高。如果发现杀虫剂溶液出现泄漏或蒸发现象，应重新配制溶液，确保管盖拧紧，并再次确认是否严格遵循储存规程（例如是否使用了封口膜，以及试管是否直立存放）。若泄漏问题持续存在，可尝试减少试管中的液体体积，以预留更多空间，适应丙酮在不同温度下体积的变化。此外，若使用丙酮作为溶剂，应确保试管材质适用于丙酮储存（例如FEP、TFE和PFA塑料）。若使用疏水性杀虫剂，应将溶液储存于玻璃小瓶中（因为疏水性杀虫剂易吸附于塑料表面） 玻璃比塑料更不易渗透）。储存前标记溶液的弯月面位置以监测蒸发情况也是一种良好做法。

称量生物体时微量天平出现重量漂移：
如果天平读数发生漂移（缓慢上升或下降），可能是由于静电所致。在塑料器皿中称量生物体时最常出现此类漂移，因为塑料容易携带静电荷。为避免此问题，可在被称量的塑料容器下方放置称量纸，或使用玻璃等非塑料材质的容器进行称量。

异常死亡率结果：
死亡率结果可能出现异常的情况有多种，例如在对照组中观察到较高的死亡率，或在所有杀虫剂剂量下均出现较高或较低的死亡率。请查看以下各种情况，以针对每种情形进行故障排查。

对照组死亡率过高
如果对照组出现较高的死亡率（10%或以上），应评估击倒方法以及标本暴露于击倒条件的时间长度。如有可能，应缩短标本的击倒时间。导致对照组死亡率升高的其他潜在因素包括：i）检查培养箱设置是否正确——异常的温度和/或湿度可能导致死亡率升高，应使用独立的数据记录仪检测温度和湿度；ii）评估昆虫操作过程，过度或粗暴地处理昆虫可能导致较高的死亡率；iii）检查用于处理对照组的100%丙酮或实验仪器上是否存在杀虫剂污染。应更换丙酮，并用丙酮或乙醇彻底清洁所有仪器。为避免污染，应频繁更换手套，防止液体溢出，并定期清洁仪器。请注意，在补充文件3中，对照组（仅使用丙酮）的容器内最多仅有两只蚊子死亡。该水平的死亡率不被视为过高（低于10%），因此无需担忧。

所有暴露组均出现高死亡率（但对照组未出现）
使用较低浓度的杀虫剂或较小的剂量体积进行测试。所使用的剂量可能超过了不会引起死亡的最低剂量。可通过设置多个10倍梯度稀释浓度来确定合适的剂量范围，并排除污染的可能性。为避免污染，应从最低浓度开始施加剂量，并逐步向最高浓度进行。此外，务必定期使用丙酮和/或乙醇清洁所有使用过的设备，施加到样本上的剂量应非常微小，即使极轻微的交叉污染也可能影响实验结果。

所有暴露组的死亡率均较低
使用更高浓度的杀虫剂。所使用的剂量可能均过低，不足以在种群中引起死亡。为确定正确的剂量范围，应将样本暴露于若干个更高10倍浓度梯度的剂量中。确保杀虫剂溶液未过期或降解（可能由于高温或光照暴露所致）。如果溶液已过期或怀疑已降解，请重新配制溶液，并确保遵循正确的储存条件。

不同重复组/天之间的死亡率不一致
昆虫暴露于杀虫剂的时间点可能影响其表现出的抗性水平，尤其是代谢抗性34。每天在相同的时间窗口内重复本实验方案，以避免因时间差异成为导致死亡率变化的潜在变量。其他可能导致重复组间死亡率不一致的因素包括：i) 不同实验间昆虫的饲养条件存在差异。确保所有个体处于相同的年龄范围，并在相同的温度、相似的饲养密度和食物供应条件下培育。ii) 杀虫剂浓度随时间降解 或因丙酮挥发而 导致浓度升高。应重新配制溶液，并确保适当的储存条件。iii) 死亡率评分不一致。应由同一人进行死亡率评分，或制定明确的评分流程供团队成员统一使用。采用盲法评分以减少死亡率判定中的偏倚。

昆虫粘附在分拣托盘表面的问题：
丙酮会与本实验方案中使用的塑料材料（如培养皿）发生反应。若在培养皿或类似的塑料表面使用丙酮，标本很可能粘附于表面。可通过在分拣托盘内铺垫称量纸或使用非塑料材质的分拣托盘来避免此类粘附现象。此外，分拣托盘或盛放杯的塑料表面产生冷凝水，也可能导致昆虫粘附在水珠上；或者标本温度过低，可能冻结在表面。应调整击晕方法，以减少冷凝水的形成，同时防止 标本温度过低或冻结（例如，在标本与塑料分拣托盘之间放置称量纸）。

R 分析错误：
收集死亡率数据后，在分析过程中可能会出现多种问题。导致 R 代码无法对数据文件执行操作的最常见原因是数据格式与代码不匹配（例如，列标题和/或空单元格）。如果出现更严重的问题，请参考 Rstudio 内置的 R 帮助页面35。

上述局部施药方法的局限性：
通过局部施药方式吸收杀虫剂无法模拟自然暴露情况：
在昆虫主要体表进行局部施药并非杀虫剂吸收的自然途径。在实际环境中，昆虫主要通过足部在接触杀虫剂处理表面的整个过程中吸收药剂，或通过翅膀接触微小的气溶胶颗粒47,48，而非通过腹面快速暴露。然而，直接施加已知剂量的杀虫剂能够准确建立昆虫对杀虫剂的表型反应，这对于遗传学和进化研究，或在不同空间和时间尺度上比较昆虫对杀虫剂的敏感性至关重要。因此，该方法适用于检测技术性抗性，但无法直接衡量实际抗性（即在田间条件下实际干预工具的有效性15）。但需要注意的是，目前的标准方法（例如 WHO 试管试验和 CDC 瓶式生物测定）同样无法捕捉或模拟田间气溶胶（如喷雾）杀虫剂暴露的情况。

局部施用试验仅可用于评估具有接触吸收作用的杀虫剂：
该方法适用于通过接触和吸收起效的杀虫剂，不适用于胃毒型杀虫剂，例如常用于诱杀性毒糖饵中的硼酸49。

该方法的意义：
局部施用法通过计算致死剂量（而非浓度）并测量技术性（而非实用性）抗性，进一步拓展了杀虫剂生物测定中已确立的标准15。以下是该方法相较于现有杀虫剂敏感性测定方法的优势与局限性。

致死剂量计算：
该方法用于确定杀虫剂的致死剂量，而非美国疾病控制与预防中心（CDC）和世界卫生组织（WHO）生物测定中用于确定区分剂量的致死浓度11。致死剂量更具意义，因为它是已知可引发死亡反应的杀虫剂量化剂量。相比之下，致死浓度并未考虑生物体实际摄入的杀虫剂量。在使用致死剂量计算时，可更准确地观察和量化不同性别或体型依赖的敏感性差异，使该测量方法具有更高的适用性。

技术抗性：
该方法用于评估技术抗性，即在标准化、受控环境中测得的抗性。此类测量适用于监测杀虫剂抗性的传播情况，并将表型抗性与潜在的抗性标志物相关联15。由于采用点滴法生物测定所导致的死亡率变异较小，因此更有利于识别新的抗性标志物。然而，由于该方法使蚊虫接触杀虫剂的方式不符合自然暴露条件，因此不适用于评估特定干预措施在特定人群中的实际效果。对于此类实际抗性的测定，需要采用其他生物测定方法15。

样本适用性：
该方法可通过简单调整击倒方式和/或杀虫剂剂量、体积和/或浓度（如上所述），应用于其他重要的节肢动物，例如农业害虫（如科罗拉多马铃薯甲虫）、家居害虫（如蟑螂和床虱）或传粉昆虫（如蜜蜂）。其易于调整的特性有助于在不同研究领域之间类比杀虫剂抗性研究。采用半数致死剂量（LD50）而非半数致死浓度（LC50）进行评估，可实现不同物种间的准确比较。

成本：
与美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲生物测定法和世界卫生组织（WHO）管测试类似，表面施用测定法的运行成本极低（参见材料表）。所需关键设备为注射器（约70美元）和分配器（约100美元），这些设备可在多次测定中重复使用。

所需样本数量：
每次进行点滴法测定实验时，每个处理杯中至少应使用 20–25 个样本。建议每项实验至少测试五种杀虫剂浓度，每种浓度至少设置三个重复。总体而言，完成一次完整的测试至少需要 300–375 个样本，这一数量与使用 WHO 筒法或 CDC 瓶法进行抗药性强度测试所需的样本量相当。然而，若点滴法生物测定能够实现更小的变异度，则相同数量的样本可能提供更强的统计效能，用于比较不同空间或时间下的敏感性数据。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国国家科学基金会向SH提供的职业奖资助，项目编号为2047572。我们感谢Damien Rivera在果蝇饲养及局部施用试验样品制备方面的协助，感谢威斯康星大学麦迪逊分校的Ganetzky博士提供Canton-S果蝇品系，感谢美国疾病控制与预防中心提供Rockefeller品系，以及感谢美国农业部医学、农业与兽用昆虫学中心提供IICC近交系品系。图1使用BioRender.com制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Thomas Scientific20A00L068丙酮分装储存
1.5 mL 螺口管Thomas Scientific1182K23杀虫剂稀释液储存
15 mL 锥形管VWR339651杀虫剂稀释液储存
20 mL 玻璃闪烁瓶Fisher Scientific0334125D果蝇称重
25 μL 注射器Fisher Scientific14815288局部施药器
丙酮Fisher ScientificAC423240040ACS 级，纯度 99.6%，4 L
Aedes aegypti（IICC 品系）USDA CMAVENA杀虫剂抗性
Aedes aegypti（Rockefeller 品系）CDCNA杀虫剂敏感
分析天平Fisher Scientific14-557-409精度达 0.1 mg
吸虫器Amazon6.49986E+11蚊虫采集装置
实验台纸VWR89126-794置于工作台面下方
棉签AmazonB092S8JVQN用于昆虫分选
脱脂棉球AmazonB0769MKZWT用于蔗糖溶液
移液器分配器Fisher Scientific1482225重复移液器
Drosophila melanogaster（Canton-S 品系）威斯康星大学麦迪逊分校NA杀虫剂敏感
细头毛笔AmazonB07KT2X1BK用于昆虫分选
果蝇培养瓶Fisher ScientificAS355用于果蝇饲养与分选
手持式 CO2 麻醉装置Fisher ScientificNC1710679用于击倒昆虫
暂存杯AmazonB08DXG7V1S透明塑料杯
冰袋AmazonB08QDWMMW5用于击倒果蝇
制冰盒Amazon9301085269用于击倒昆虫
昆虫镊子AmazonB07B4767WR昆虫镊子
杀虫剂Sigma-Aldrich Inc45423-250MG溴氰菊酯
标签贴纸AmazonB07Q4X9GWX3/4" 彩色圆点贴纸
标签胶带AmazonB00X6A1GYK白色胶带
网布AmazonB07F2PHHWV用于覆盖暂存杯及昆虫操作帐篷
培养皿Fisher ScientificFB0875712H371100 mm × 15 mm
PVC 管Lowe’s23971昆虫操作帐篷材料
橡皮筋AmazonB00006IBRU用于固定杯口网罩
蔗糖AmazonB01J78INO0白砂糖
称量纸VWR12578-1654" × 4"

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用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法
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