Çift yönlü mitotik kinesin-5 Cin8, hareketlilikleri sırasında bölünen ve birleşen kümelerde birikir. Kümelerdeki birikim ayrıca Cin8'in hızını ve yönlülüğünü de değiştirir. Burada, saflaştırılmış Cin8-GFP ile motilitesi tahlilleri ve tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketli özelliklerinin analizi için bir protokol açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Mitotik bipolar kinezin-5 motorlar, iş mili dinamiklerinde temel işlevleri yerine getirir. Bu motorlar, aktif kompleksin zıt uçlarında bulunan iki çift katalitik motor alanına sahip homo-tetramerik bir yapı sergiler. Bu benzersiz mimari, kinesin-5 motorlarının antiparalel mil mikrotübüllerini (MTs) çapraz bağlamasını ve kaydırmasını sağlar, böylece iş mili kutuplarını birbirinden ayıran dışa doğru yönlendirilmiş kuvveti sağlar. Daha önce, kinesin-5 motorlarının yalnızca artı uçlu yönlendirildiğine inanılıyordu. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, birkaç mantar kinezin-5 motorunun eksi uçlu tek molekül seviyesine yönlendirildiğini ve çeşitli deneysel koşullar altında yönselliği değiştirebileceğini ortaya koymuştur. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8, bu tür çift yönlü motor proteinin bir örneğidir: yüksek iyonik mukavemet koşullarında, Cin8'in tek molekülleri, MT'lerin eksi uç yönünde hareket eder. Ayrıca, Cin8'in ağırlıklı olarak MT'lerin eksi ucunda hareketli kümeler oluşturduğu ve bu kümelenmenin Cin8'in yön değiştirmesine ve yavaş, artı uçlu yönlendirilmiş hareketliliğe maruz kalmasına izin verdiği gösterilmiştir. Bu makale, GFP etiketli kinesin-5 Cin8 ile çalışmanın tüm adımları için, S. cerevisiae hücrelerinde protein aşırı ekspresyonundan ve saflaştırılmasından in vitro tek moleküllü motilitesi testine kadar ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Burada açıklanan yeni geliştirilen bir yöntem, floresan yoğunluklarına bağlı olarak tek moleküller ve Cin8 kümeleri arasında ayrım yapmaya yardımcı olur. Bu yöntem, tek moleküllerin ve Cin8 kümelerinin hareketliliğinin ayrı ayrı analizini sağlar, böylece Cin8 hareketliliğinin küme boyutuna bağımlılığının karakterizasyonunu sağlar.
Giriş
Ökaryotik hücrelerdeki çok sayıda hareketlilik olayı, moleküler motor proteinlerin işlevi tarafından aracılık edilir. Bu motorlar sitoiskelet filamentleri, aktin filamentleri ve mikrotübüller (MTs) boyunca hareket eder ve ATP hidrolizinin kimyasal enerjisini, hücreler içindeki biyolojik hareketliliği yönlendirmek için gereken kinetik ve mekanik kuvvetlere dönüştürür. MT bazlı S. cerevisiae Cin8, iş mili MT'lerini çapraz bağlayan ve kaydıran bipolar, homotetramerik kinesin-5 motor proteinidir1. Cin8, mitoz sırasında, iş mili montajı 2,3,4'te ve anafaz
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
- Arabellek
- -Leu aa bırakma karışımı: Adenin, Uracil, Triptofan, Histidin, Lizin ve Metiyonin'in her birini 2 g karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.
- Rafinozlu maya seçici ortam (1 L): 6.7 g maya azot baz (amonyum sülfat ile), 2 g -Leu aa bırakma karışımı ve 20 g rafinozu çift damıtılmış suda tamamen çözünene kadar karıştırarak (ısıtmadan) karıştırın. 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak, çözeltiyi steril bir şişeye süzün.
- Lizis tamponu: 50 mM Tris, 30 mM Borular, 500 mM KCl,% 10 gliserol, 1,5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM MgCl 2, 0,1 mM ATP ve% 0,1 Triton X-100'den oluşan ü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deney, tek MT'ler üzerinde farklı küme boyutlarındaki çift yönlü motor protein Cin8'in hareketlilik özelliklerini araştırmayı amaçlamaktadır. Cin8-GFP'nin temsili motilitesi, motorun zaman içindeki uzamsal konumunun gösterildiği Şekil 5A'daki kimograflardan da belirgindir.
Cin8-GFP'nin hareketli özelliklerinin analizi için, ilk olarak, MT'ye bağlı her bir hareketli Cin8-GFP parçacığına küme boyutu atanır (adım 4.3) ve daha sonra incelenen Cin8 parçacıklarının konu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, çift yönlü kinezin-5 Cin8 ile tek moleküllü motilite testi için bir protokol ve motilitenin analizi sunulmuştur. C-terminalindeki doğal nükleer lokalizasyon sinyalini (NLS) içeren tam uzunluktakiCin8 18 , yerli konakçı S. cerevisiae'den arındırılmıştır. Cin8 bir nükleer motor proteini olduğundan, S. cerevisiae hücrelerinin sıvı azot altında öğütülmesi, hücre lizisi için en etkili yöntem olarak bulunmuştur. Lizisten sonra, metal afinitesi ve boyut dışlama kromatograf.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu araştırma kısmen İsrail Bilim Vakfı hibesi (ISF-386/18) ve L.G.'ye verilen İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı hibesi (BSF-2019008) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Adenin | FORMEDIUM | DOC0230 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biyotinillenmiş-BSA | Sigma | A8549 | |
| Kazein | Sigma | C7078 | |
| Katalaz (C40) | Sigma | C40 | |
| Kreatin-Kinaz | Sigma | C3755 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Chroma | için floresan filtre seti | : ET-EGFP (FITC/Cy2) | |
| Chroma | için floresan filtre seti | : ET-CY3/TRITC | |
| Floresan ters mikroskop | Zeiss | Axiovert 200M | |
| Galaktoz | Tivan Biotech | GAL02 | |
| Glikoz | Sigma | G8270 | |
| Glikoz Oksidaz | Sigma | G7141 | |
| Gliserol | Sigma | G5516 | |
| GlisilGlisin | Merck | G0674 | |
| GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
| GTB | Hücre İskeleti | BST01-010 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
| ImageJ-FIJI yazılımı | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | sürüm 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] Windows 10 | |
| için İmidazol | Sigma | I0125 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Lekesi | Abcam | ab119211 | |
| Lens | Zeiss | 100x/1.4 yağ DIC objektif | |
| Lizin | FORMEDIUM | DOC0161 | |
| Magnezyum Klorür | Sigma | M8266 | |
| Metiyonin | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
| Neo | Andor Teknolojileri | sCMOS kamera | |
| NeutraAvidin | Life | A2666 | |
| Ni-NTA Agaroz | Invitrogen | R901-15 | |
| Fosfo-Kreatin | Sigma | P1937 | |
| Borular | Sigma | P1851 | |
| Pluronik asit F-127 (poloksamer) | Sigma | P2443 | |
| Potasyum Klorür | Sigma | P9541 | |
| Rafinoz | Tivan Biotech | RAF01 | |
| Boyut Dışlama kromatografi cihazı | GE Healthcare | AKTA Saf | |
| Spektrofotometre | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
| Superose-6 10/300 GL | GE Sağlık | 17-5172-01 | |
| Tris | Roshe | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Triptofan | Duchefa Biyokimya | T0720.0100 | |
| Tübülin proteini | Hücre iskeleti | T240 | |
| Tübülin, biyotinile | Hücre İskeleti | T333P | |
| Tübülin, TRITC Rhodamine | Hücre İskeleti | TL530M | |
| Urasil | Sigma | U0750-100G | |
| Maya nitrojen bazı | FORMEDIUM | CYN0401S | |
| α-GFP antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC8036 | |
| β-merkaptoetanol | Sigma | M3148 |
Kaynaklar
- Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
- Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham
