Le présent protocole décrit la précipitation protéique à base de solvant dans des conditions contrôlées pour une récupération et une purification robustes et rapides des échantillons de protéome avant la spectrométrie de masse.
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Article de méthode
Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bien que les multiples progrès réalisés dans les instruments de spectrométrie de masse (SEP) aient amélioré l’analyse qualitative et quantitative du protéome, des approches frontales plus fiables pour isoler, enrichir et traiter les protéines avant la SEP sont essentielles à la caractérisation réussie du protéome. Une récupération faible et incohérente des protéines et des impuretés résiduelles telles que les tensioactifs nuisent à l’analyse de la SEP. La précipitation des protéines est souvent considérée comme peu fiable, longue et techniquement difficile à effectuer par rapport à d’autres stratégies de préparation d’échantillons. Ces préoccupations sont surmontées en utilisant des protocoles optimaux de précipitation des protéines. Pour la précipitation de l’acétone, la combinaison de sels spécifiques, le contrôle de la température, la composition du solvant et le temps de précipitation sont essentiels, tandis que l’efficacité de la précipitation du chloroforme / méthanol / eau dépend d’un pipetage et d’une manipulation du flacon appropriés. Alternativement, ces protocoles de précipitation sont rationalisés et semi-automatisés dans une cartouche de rotation jetable. Les résultats attendus de la précipitation des protéines à base de solvant dans le format conventionnel et de l’utilisation d’une cartouche de filtration et d’extraction jetable en deux étapes sont illustrés dans ce travail. Cela comprend la caractérisation détaillée des mélanges protéomiques par analyse ascendante LC-MS/MS. Les performances supérieures des flux de travail basés sur les FDS sont également démontrées par rapport aux protéines non contaminées.
Introduction
L’analyse du protéome par spectrométrie de masse est devenue de plus en plus rigoureuse, en raison de la sensibilité, de la résolution, de la vitesse de balayage et de la polyvalence accrues des instruments MS modernes. Les progrès de la SEP contribuent à une plus grande efficacité d’identification des protéines et à une quantification plus précise 1,2,3,4,5. Grâce à l’amélioration de l’instrumentation de la SEP, les chercheurs exigent une stratégie de préparation d’échantillons front-end cohérente capable ....
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Protocole
1. Considérations matérielles et pré-préparation de l’échantillon
- Utilisez uniquement des solvants de haute pureté (acétone, chloroforme, méthanol) (>99,5%) et des produits chimiques, exempts d’excès d’humidité.
- Préparer des solutions de chlorure de sodium et de sulfate de zinc (1 M) dans l’eau.
REMARQUE: Les solutions salines peuvent être stockées indéfiniment à température ambiante, à condition qu’elles soient exemptes de contaminants ou de croissance microbienne. - Utilisez le plus petit flacon de microcentrifugeuse en polypropylène (PP) suffisant pour retenir le volume requis d’échantillon et de solvants pour induire....
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Résultats
La figure 4 résume l’épuisement prévu des FDS à la suite d’une précipitation de protéines à base de flacon ou facilitée par une cartouche dans une cartouche filtrante jetable utilisant de l’acétone. L’incubation nocturne conventionnelle (-20 °C) dans l’acétone est comparée au protocole de précipitation rapide de l’acétone à température ambiante (étape 2), ainsi qu’aux précipitations CMW (étape 4). La FDS résiduelle a été quantifiée par le dosage des substances actives au bleu de méthylène (M.......
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Discussion
La caractérisation optimale de la SEP est obtenue lorsque la FDS résiduelle est épuisée en dessous de 10 ppm. Alors que d’autres approches, telles que le FASP et la digestion sur billes, offrent un épuisement quantitatif des FDS avec une récupération variable 31,32,33, l’objectif principal des précipitations est de maximiser la pureté et le rendement simultanément. Cela dépend de l’isolation efficace du surnageant (contenant la .......
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Déclarations de divulgation
Le laboratoire Doucette a conçu et breveté le ProTrap XG utilisé dans cette étude. AAD est également un partenaire fondateur de Proteoform Scientific, qui a commercialisé la cartouche de préparation d’échantillons.
Remerciements
Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. Les auteurs remercient Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) et SPARC BioCentre (Molecular Analysis) de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) pour leur contribution à l’acquisition de données sur la SP.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acétone | Fisher Scientific | AC177170010 | &le ; 0,002 % d’aldéhyde |
| Acétonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | Qualité HPLC |
| Bicarbonate d’ammonium | Millipore Sigma | A6141-1KG | solide |
| Bêta mercaptoéthanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Grade en biologie moléculaire |
| Bleu de bromophénol | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophénol sel bleu de sodium |
| Chloroforme | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroforme |
| Acide formique | Honeywell | 56302 | Additif éluent pour LC-MS |
| Spectromètre de masse à fusion Lumos | ThermoFisher Scientific | pour l’analyse d’un mélange protéique standard | |
| Glycérol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | Pour la biologie moléculaire, > 99 % |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | Qualité HPLC |
| Méthanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | Qualité HPLC |
| Microcentrifugeuse | Fisher Scientific | 75-400-102 | jusqu’à 21 000 XG |
| Tube microcentrifuge (1,5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | Fond effilé |
| Tube de microcentrifuge & nbsp ; ; ; ; ; ; ; ; (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | Fond arrondi |
| Conseils de micropipette ; ; ; ; ; ; ; ; (0.1-10 &mu ; L) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Pointe universelle de pipette, non stérile |
| Conseils de micropipette ; ; ; ; ; ; ; ; (1-200 &mu ; L) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Pointe universelle de pipette, non stérile |
| Conseils de micropipette ; ; ; ; ; ; ; (200-1000 & mu ; L) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Pointe universelle de pipette, non stérile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Pack Trio de micropipettes |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Poudre lyophilisée, ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; >3200 unités/mg |
| ProTrap XG | Protooform Scientific | PXG-0002 | 50 unités complètes par boîte |
| Chlorure de sodium | Millipore Sigma | S9888-1KG | Réactif ACS, >99 % |
| Dodécyle sulfate de sodium | ThermoFisher Scientific | 28312 | Solide en poudre |
| Spectromètre de masse timsTOF Pro | Bruker | pour l’analyse de l’extrait de protéome hépatique | |
| Acide trifluoroacétique | ThermoFisher Scientific | L06374. AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Grade en biologie moléculaire |
| Trypsine | Millipore Sigma | 9002-07-7 | À partir du pancréas bovin, traité par TPCK |
| Urée | Bio-Rad | 1610731 | solide |
| Eau (déionisée) | Système de purification d’eau mini Sartorius Arium | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18,2 M&Omega ; cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solide |
Références
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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Réimpressions et autorisations
