Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

Resumen

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Resumen

El fotopigmento acoplado a la proteína G de Drosophila rodopsina (R) está compuesto por una proteína (opsina) y un cromóforo. El proceso de activación de la rodopsina se inicia mediante la isomerización inductora de absorción de fotones del cromóforo, promoviendo cambios conformacionales de la opsina y dando como resultado un segundo estado de fotopigmento oscuro-estable (metarhodopsina, M). La investigación de este fotopigmento biestable utilizando mutagénesis aleatoria requiere métodos simples y robustos para detectar moscas mutantes. Por lo tanto, se han diseñado varios métodos para medir las reducciones en los niveles de fotopigmento funcional. Uno de estos métodos explota los desplazamientos de carga dentro del fotopigmento después de la absorción de fotones y las enormes cantidades de moléculas de fotopigmento expresadas en los fotorreceptores. Esta señal eléctrica, llamada potencial del receptor temprano (o corriente temprana del receptor), se mide mediante una variedad de métodos electrofisiológicos (por ejemplo, electrorretinograma y registros de células enteras) y es linealmente proporcional a los niveles de fotopigmento funcional. Las ventajas de este método son la alta relación señal-ruido, la medición lineal directa de los niveles de fotopigmento y la independencia de los mecanismos de fototransducción aguas abajo de la activación de rodopsina o metarhodopsina. Un método electrofisiológico adicional llamado postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota la biestabilidad del fotopigmento de Drosophila y las diferencias espectrales de absorción de los estados de pigmento R y M de la mosca. El PDA es inducido por la luz azul intensa, convirtiendo cantidades saturadas de rodopsina en metarhodopsina, lo que resulta en la falla de la terminación de la respuesta a la luz durante un tiempo prolongado en la oscuridad, pero puede ser terminado por la conversión de metarhodopsina a rodopsina utilizando luz naranja intensa. Dado que el PDA es una señal robusta que requiere una conversión masiva de fotopigmentos, incluso pequeños defectos en la biogénesis del fotopigmento conducen a un PDA anormal fácilmente detectado. De hecho, los mutantes PDA defectuosos condujeron a la identificación de nuevas proteínas de señalización importantes para la fototransducción.

Introducción

La rodopsina activada por la luz (R), que es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR), está compuesta por una proteína transmembrana 7 (opsina) y un cromóforo. En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), la absorción de fotones induce la isomerización del cromóforo 11-cis-3-OH-retinal a all-trans-3-OH-retinal¹, promoviendo el cambio conformacional de la rodopsina a metarhodopsina (M, Figura 1A). A diferencia de la rodopsina de vertebrados, la fracción predominante del cromóforo de invertebrados no se disocia de la opsina, lo que resulta en el estado de pigmento fisiológica....

Protocolo

1. Medición de la relación de respuesta de intensidad, postpotencial de despolarización prolongada (PDA) y el potencial receptor temprano (ERP) utilizando el electrorretinograma

1. Condiciones de cría adecuadas para la preparación de D. melanogaster
   1. Criar moscas D. melanogaster en botellas que contengan alimentos que contengan maíz amarillo estándar en una incubadora mantenida a una temperatura de 24 °C y en un ciclo oscuro/claro de 12 h
   2. Mantenga las botellas de mosca en la oscuridad al menos 24 horas antes del experimento.
2. Configuración general
   1. Prepare pipetas de grabación tira....

Resultados

La Figura 2 ejemplifica la robustez y facilidad de uso de la técnica ERG. Es robusto porque se registra en la mosca prácticamente intacta mediante una técnica simple de registros de voltaje extracelular que requieren una configuración electrofisiológica simple. La robustez se manifiesta mediante la obtención de registros de respuestas de luz con amplitudes relativamente grandes (en el rango de milivoltios) incluso cuando las mutaciones reducen o distorsionan fuertemente la respuesta de la lu.......

Discusión

La principal ventaja de usar la preparación de fotorreceptores Drosophila es su accesibilidad, la facilidad y precisión de la estimulación de la luz y, lo más importante, la capacidad de aplicar el poder de la genética molecular⁷. Extensos estudios genéticos han establecido Drosophila como un sistema modelo extremadamente útil para la disección genética de procesos biológicos complejos⁷. La estructura relativamente simple del genoma de Drosophila .......

Materiales

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Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 mL con punta			Figura 6M
1 pinza		Dumont #5, estándar	0,1 mm x 0,06 mm, longitud 110 mm, acero inoxidable (figura 6H)
2 lentes de condensador convertidor
A/D	Dispositivo molecular	Digidata 1200	Posible sustitución: cualquier digidata de dispositivos moleculares (p. ej. 1440A) -Figura 7C
Amplificador	Electrónica casi perfecta	Posible reemplazo: Instrumentos Warner- IE251A o IE-210 (viene con cabeza)- Figura 7D
subtanque
Fuente > luz fría	Schott	KL1500 LCD	Figura 6C
Limpiaparabrisas delicados	Kimtech		Kimwipes (Figura 6K)
Portaelectrodos			Adecuado para diámetro exterior capilar de 1 mm (Figura 6N, Figura 7N y Figura 7P)
Jaula de Faraday	casero		y cortina frontal negra (Figura 7K)
Filtro (Color)	Schott	OG590, Filtro de borde	Figura 7S
Filtro (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figura 7S
Filtro (Color)	Blazers	550 nm	Figura 7S
Filtro (Color) para fuente de luz fría	Schott	RG630	Figura 6C
Filtro (Calor)	Schott	KG3	Figura 7S
Filtros (Neutro filtro de densidad)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figura 7S Sistema de
lámpara de flash	Honeywell		Figura 7U
Sistema de traviesas de mosca con inyector	Inyectar + matic		Figura 6A-B
Fuente de alimentación de la lámpara	PTI	LPS-220	Figura 7W
Detector de luz	Fototransistor casero
Guía de luz			3 mm de diámetro, 1,3 m de largo (Figura 7L,M)Fuente
			Lámpara de xenón de 75 W libre de ozono de alta presión (que funciona a 50 W), posible reemplazo: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera de fusión a baja temperatura	Hecho en		Compuesto de mezcla de cera de abejas (Tm≈ 62 y s° C) y parafina a ~3:1 para alcanzar una temperatura de fusión de ~55– 56 ° C (Figura 6J)
Soporte magnético para moscas Hecho	en		Figura 6I y Figura 7Q
Sistema de preamplificador de microelectrodos con etapa de cabeza	Electrónica		Probador de impedancia (Figura 7G)
Micromanipulador (mecánico grueso)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulador (mecánico fino)	Leitz Microsystems	Leitz Micromanipulador mecánico	Figura 7F
pCLAMP	Software de dispositivo
Placa			60 mm
Generador de impulsos	AMPI	Master 8	Figura 7A
Crema Redux para electrocardiografía	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crè me
Controlador de obturador	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Monocanal Uni-estable	Figura 7V
Sistema de obturador	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-estable Obturadores	Figura 7V
Alambre de plata	Warner Instruments		0.25– 1 mm de diámetro, necesita ser cloruro
Soldador compuesto por un filamento			0,25 mm de diámetro (Figura 6F)
Microscopio con zoom estereoscópico	Nikon	SMZ-2B	Figura 6D
Zoom estereoscópico Microscopio	Wild	Wild M5	Con ajustes de aumento de 6, 12, 25 y 50 (Figura 7E)
Filtros de jeringa	Millex		22 y micro; m Filtro de PVDF
Extractor de pipeta vertical	Sutter/ Narishige	Modelo P-97/PP-830	Utilice un extractor vertical u horizontal, según prefiera (Figura 6L)
Calentador de filamento de cera	Hecho en		Ver figura S1 (Figura 6E-G)
Sistema de lámpara de destello de xenón	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figura 7X

alargada rugosa Mesa antivibratoria Newport VW-3036-OPT-01 Figura 7H Capilares Aparato Harvard Capilares de vidrio de borosilicato 1 mm x 0,58 mm (Figura 6O)Software de dispositivo molecular Clampex CO Blindaje electromagnético (Figura 7O) de luz casa casa casi perfecta molecular de Petri de platino-iridio de casa