Genomomfattende profilering av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i Candida albicans: En omfattende CUT&RUN-metode og arbeidsflyt for dataanalyse

Summary

Denne protokollen beskriver en eksperimentell metode- og dataanalysearbeidsflyt for spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease (CUT&RUN) i det menneskelige sopppatogenet Candida albicans.

Abstract

Regulatoriske transkripsjonsfaktorer kontrollerer mange viktige biologiske prosesser, inkludert cellulær differensiering, respons på miljøperturbasjoner og spenninger, og vertspatogeninteraksjoner. Å bestemme den genomomfattende bindingen av regulatoriske transkripsjonsfaktorer til DNA er avgjørende for å forstå funksjonen til transkripsjonsfaktorer i disse ofte komplekse biologiske prosessene. Cleavage under mål og frigjøring ved hjelp av nuklease (CUT&RUN) er en moderne metode for genom-wide kartlegging av in vivo protein-DNA bindende interaksjoner som er et attraktivt alternativ til den tradisjonelle og mye brukte kromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) metode. CUT&RUN er egnet til et eksperimentelt oppsett med høyere gjennomstrømning og har et betydelig høyere dynamisk område med lavere sekvenseringskostnader per prøve enn ChIP-seq. Her beskrives en omfattende CUT&RUN-protokoll og tilhørende dataanalysearbeidsflyt skreddersydd for genomomfattende analyse av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i det menneskelige sopppatogenet Candida albicans . Denne detaljerte protokollen inkluderer alle nødvendige eksperimentelle prosedyrer, fra epitopmerking av transkripsjonsfaktorkodingsgener til bibliotekforberedelse for sekvensering; I tillegg inkluderer den en tilpasset beregningsarbeidsflyt for CUT&RUN-dataanalyse.

Introduction

Candida albicans er et klinisk relevant, polymorfisk menneskelig sopppatogen som eksisterer i en rekke forskjellige vekstformer, for eksempel den planktoniske (frittflytende) vekstmåten og som samfunn av tettsittende celler beskyttet av en ekstracellulær matrise, kjent som biofilmmodusen for vekst ^1,2,3. I likhet med andre utviklings- og cellulære prosesser er biofilmutvikling et viktig C. albicans virulenstrekk som er kjent for å bli kontrollert på transkripsjonsnivå av regulatoriske transkripsjonsfaktorer (TFer) som binder seg til DNA på en sekvensspesifikk måte⁴. Nylig har kromatinregulatorer og histonemodifikatorer også dukket opp som viktige regulatorer for C. albicans biofilmformasjon⁵ og morfogenese⁶ ved å formidle DNA-tilgjengelighet. For å forstå den komplekse biologien til dette viktige sopppatogenet, er effektive metoder for å bestemme den genomomfattende lokaliseringen av spesifikke TFer under distinkte utviklings- og cellulære prosesser verdifull.

Kromatin immunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-seq) er en mye brukt metode for å undersøke protein-DNA interaksjoner i C. albicans ^5,6 og har i stor grad erstattet den mer klassiske kromatin immunoprecipitation etterfulgt av mikroarray (ChIP-chip)⁹ metode. Både ChIP-seq- og ChIP-chip-metoder krever imidlertid et stort antall inngangsceller¹⁰, noe som kan være en kompliserende faktor når du undersøker TFer i sammenheng med spesifikke prøver og vekstmåter, for eksempel biofilmer samlet inn fra pasienter eller dyremodeller av infeksjon. I tillegg gir kromatinimmunoprecipitation (ChIP) analysen ofte et betydelig mengde bakgrunnssignal gjennom hele genomet, noe som krever et høyt nivå av berikelse for målet om interesse for å tilstrekkelig skille signal fra støy. Selv om ChIP-chip-analysen i stor grad er utdatert i dag, gjør sekvenseringsdybdene som er nødvendige for ChIP-seq denne analysen uoverkommelig dyrt for mange forskere, spesielt de som studerer flere TFer og / eller kromatinrelaterte proteiner.

Cleavage under mål og frigjøring ved hjelp av nuclease (CUT&RUN) er et attraktivt alternativ til ChIP-seq. Det ble utviklet av Henikoff lab i 2017 for å omgå begrensningene i ChIP-seq og kromatin endogen spalting etterfulgt av sekvensering ChEC-seq^11,12, en annen metode for å identifisere protein-DNA interaksjoner på et genom-bredt nivå, samtidig som det gir høyoppløselig, genom-bred kartlegging av TFs og kromatin-assosierte proteiner¹³ . CUT&RUN er avhengig av målrettet fordøyelse av kromatin i permeabiliserte kjerner ved hjelp av tethered mikrokokkkjerner, etterfulgt av sekvensering av de fordøyde DNA-fragmentene ^9,10. Ettersom DNA-fragmenter genereres spesifikt på loci som er bundet av et protein av interesse, i stedet for å bli generert over hele genomet via tilfeldig fragmentering som i ChIP-analyser, resulterer CUT&RUN-tilnærmingen i sterkt reduserte bakgrunnssignaler og krever dermed 1/10^th av sekvenseringsdybden sammenlignet med ChIP-seq^{11,13, 14}. Disse forbedringene fører til slutt til betydelige reduksjoner i sekvenseringskostnader og reduksjoner i det totale antallet inngangsceller som trengs som startmateriale for hvert utvalg.

Her beskrives en robust CUT&RUN-protokoll som er tilpasset og optimalisert for å bestemme den genomomfattende lokaliseringen av TFer i C. albicansceller isolert fra biofilmer og planktoniske kulturer. Det presenteres også en grundig dataanalysepipeline som muliggjør behandling og analyse av de resulterende sekvensdataene og krever at brukerne har minimal kompetanse innen koding eller bioinformatikk. Kort fortalt beskriver denne protokollen epitopmerking av TF-kodingsgener, høsting av biofilm og planktoniske celler, isolering av intakt permeabilisert kjerne, inkubasjon med primære antistoffer mot det spesifikke protein- eller epitopmerkede proteinet av interesse, tethering av den chimeriske A / G-mikrokokkkjernen (pAG-MNase) fusjonsproteiner til de primære antistoffene, genomisk DNA-utvinning etter kromatin fordøyelse og fremstilling av genomiske DNA-biblioteker for sekvensering.

Den eksperimentelle CUT&RUN-protokollen etterfølges av en spesialbygd dataanalysepipeline, som tar rå DNA-sekvenseringslesninger i FASTQ-format og implementerer alle nødvendige behandlingstrinn for å gi en komplett liste over betydelig beriket loci bundet av TF av interesse (målrettet av det primære antistoffet). Vær oppmerksom på at flere trinn i den beskrevne bibliotekforberedelsesprotokollen er spesielt tilpasset og optimalisert for CUT&RUN-analyse av TFer (i motsetning til nukleosomer). Mens dataene som presenteres i dette manuskriptet ble generert ved hjelp av TF-spesifikke tilpasninger av et kommersielt CUT&RUN-sett, har disse protokollene også blitt validert ved hjelp av individuelt produserte komponenter (dvs. pAG-MNase-enzym og magnetiske DNA-renseperler) og interne forberedte buffere, noe som kan redusere eksperimentelle kostnader betydelig. De omfattende eksperimentelle protokollene og dataanalyseprotokollene er beskrevet i detalj nedenfor i et trinnvis format. Alle reagenser og kritisk utstyr, samt buffer- og medieoppskrifter, er oppført i henholdsvis materialtabellen og tilleggsfil 1.

Protocol

1. Epitop tagging av C. albicans stammer

1. Last opp genet av interesse, sammen med sine 1 kb oppstrøms og nedstrøms flankesekvenser, fra Candida Genome Database til primer design verktøyet (se tabell over materialer). Design en guide RNA (gRNA) ved å markere 50 bp oppstrøms og nedstrøms fra stop codon, og klikk på gRNA-markeringsverktøyet til høyre. Velg Utformings- og analyseveiledninger. Bruk genomet Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) og et NGG (SpCas9, 3' side) protospacer tilstøtende motiv (PAM) for guideparametrene, og klikk Fullfør. Figur 1 beskriver arbeidsflyten for epitopmerking av et C. albicans-gen av interesse med forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP).
   1. På den påfølgende siden bekrefter du målområdet for gRNA-design og trykker på den grønne knappen. Sorter gRNAer etter poengsum for mål.
      MERK: Primer designverktøyet beregner resultater på mål og utenfor målet for å kvantifisere gRNAenes spesifisitet. En ideell guide har en poengsum på målet på >60, en off-target score på ~ 33, og overlapper stoppkodonen. Dette muliggjør høy gRNA-spesifisitet mens du ablating gRNA målretting etter GFP-integrasjon. En gRNA med en off-target score på ~ 50 indikerer allelic variasjon; Dermed vil bare ett allel bli anerkjent av gRNA.
   2. Legg sekvensene (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') og (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') til henholdsvis 5' og 3' endene av 20 bp gRNA-målsekvensen, og opprett en 60 bp primer/oligonucleotide. Alternativt kan du kopiere 20 bp-sekvensen til gRNA-kalkulatoren levert av Nguyen et ^al.15. Bestill 60 bp tilpasset gRNA oligonukleotid.
   3. Forsterk det "universelle A-fragmentet" med 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGCGTTTAAACCGCC-3') og 100 mM AHO1098 (15'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') og det "unike B-fragmentet" med det tilpassede 60 bp gRNA oligonukleotidet (100 mM) fra trinn 1.1.2. og 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGTTTAAACACCG-3') ved hjelp av henholdsvis pADH110 (plasmid depot-ID# 90982) og pADH139 (plasmid depot-ID# 90987), som mal-DNA. Bruk PCR-reaksjons- og sykkelforholdene i tabell 1.
      MERK: pADH139 er spesifikk for stammer som bærer den heterologe Candida maltosa LEU2-markøren . Hvis du bruker en stamme med en enkelt kopi av C. albicans LEU2-genet , erstatt pADH119 (plasmid depot-ID # 90985) i stedet for pADH139.
   4. Bekreft vellykket forsterkning ved å sjekke 5 μL av PCR på en 1% agarose gel. Se etter fragmentamplikoner på ~1 kB A og B.
   5. Bland 1 μL hvert av A- og B-fragmentene og sy dem sammen ved hjelp av PCR-reaksjons- og sykkelforholdene i tabell 2 for å lage et C-fragment i full lengde.
   6. Tilsett 0,5 μL 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') og 0,5 μL 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') til hver PCR-reaksjon, bland godt ved pipettering, og fullfør sykkelforholdene som er oppført i tabell 3.
      MERK: Ved bruk av pADH119 i stedet for pADH139, erstatt AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTC-3') i stedet for AHO1453.
   7. Bekreft riktig søm og forsterkning av C-fragmentet ved å sjekke 5 μL av PCR på en 1% agarose gel. Se etter en amplikon på ~ 2 kb. Oppbevar C-fragmentet ved -20 °C til det er klart til bruk.
      MERK: Hvis søm og forsterkning resulterer i flere, uspesifiserte bånd eller smøring, utfører du en PCR-opprydding av A- og B-fragmentene og gjentar fra trinn 1.1.5.
2. Legg til hele CTG-optimalisert monomerisk eGFP med linkersekvens (RIPLING)¹⁶ (pCE1, plasmid depot-ID# 174434) umiddelbart oppstrøms for stoppkodonen til genet av interesse ved hjelp av primerdesignverktøyet, og skape en C-terminal oversettelsesfusjon. Bruk denne konstruksjonen til å designe oligonukleotider for å forsterke donor-DNA (dDNA) fra pCE1.
   1. Design en fremre oligonukleotid med 18-22 bp homologi til linkersekvensen og >50 bp homologi til 3' enden av den åpne leserammen (ORF).
      MERK: 18-22 bp homologi skaper en glødetemperatur for forsterkning mellom 55 °C og 58 °C. Hvis oligonukleotidet i full lengde danner primer dimers, justerer du homologien til koblingssekvensen/GFP-en eller genomet tilsvarende.
   2. Lag en omvendt oligonukleotid med 18-22 bp homologi til 3' enden av GFP og >50 bp homologi til nedstrøms noncoding sekvens av ORF som skal merkes.
   3. Bestill disse oligonukleotidene og forsterk dDNA ved hjelp av pcr-sykkelforholdene i tabell 4.
3. Design to sett med koloni-PCR (cPCR) oligonukleotider for å bekrefte integrasjonen av GFP ved å forsterke over flankeintegrasjonsstedene. Velg først det fremre dDNA oligonukleotidet ved hjelp av primerdesignverktøyet og klikk på Primer-knappen til høyre.
   1. Klikk opprett primere | Veiviser | Tm Param og bekreft at algoritmen er satt til SantaLucia 1998. Klikk Bruk merket område for å angi koordinatene for det fremre oligonukleotidet som er utformet i 1.2.1 som målsekvens.
   2. Sett den optimale primertemperaturen til 55 °C og maksimal amplikonstørrelse til 900 bp, og klikk på Generer primere-knappen øverst til høyre.
   3. Velg oligonukleotidparet med lavest straffepoeng og bekreft at primerne forsterker seg over 5's integrasjonsside. Forsikre deg om at den fremre cPCR-primeren ligger oppstrøms for den fremre dDNA-primersekvensen og den omvendte cPCR-primeren helt innenfor eGFP-koden eller koblingssekvensen.
   4. Gjenta trinn 1.3-1.3.3. med omvendt dDNA oligonukleotid for å lage det andre settet med cPCR oligonukleotider som forsterker seg over 3'integrasjonsstedet. Forsikre deg om at den fremre cPCR-primeren ligger helt innenfor eGFP-koden eller koblingssekvensen og den omvendte cPCR-primeren nedstrøms for den omvendte dDNA-primersekvensen.
   5. Bestill disse oligonukleotidene.
4. Fordøye 2500 ng pADH140, som inneholder Cas9 (plasmid depot-ID # 90988), med begrensningsenzym for hvert gen som skal GFP-merket. Sett det totale volumet av hver fordøyelse på 15 μL; justere volumet av vann tilsvarende basert på pADH140 plasmidkonsentrasjonen. Bruk fordøyelsesbetingelsene som er angitt i tabell 5. Oppbevar den fordøyde plasmiden ved -20 °C til den er klar til bruk.
   MERK: Hvis du transformerer en stamme med en enkelt kopi av C. albicans LEU2-genet , i stedet for den heterogene C. maltosa LEU2-markøren , erstatter du pADH137 (plasmid depot-ID # 90986) i stedet for pADH140.
5. Denature 12 μL av 10 mg/ml laks sperm DNA for hvert gen som vil bli GFP-merket ved 99 °C i 10 min og raskt avkjøles til ≤4 °C. Oppbevars ved -20 °C til den er klar til bruk.
6. Strekk en C. albicans LEU2 hemizygot nourseothricin-sensitiv belastning på gjær peptone dextrose (YPD) plater og inkuber ved 30 °C i to dager.
7. Velg en enkelt koloni og overfør den til 4 ml flytende YPD. Inkuber i 12-16 timer ved 30 °C med risting ved 250 o/min.
8. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD₆₀₀) av nattkulturen (12-16 t) i et spektrofotometer ved hjelp av en engangs cuvette (1 ml, 1 cm banelengde).
9. Fortynn nattkulturen i en Erlenmeyer-kolbe til en OD₆₀₀ av 0,1 i YPD. Stå for 5 ml per reaksjon og inkluder ytterligere 5 ml for kontroll av OD₆₀₀ senere.
   MERK: Kulturens volum avhenger av antall transformasjonsreaksjoner.
10. Inkuber den fortynnede nattkulturen i en ristende inkubator ved 30 °C med risting ved 250 o/min til den når en OD₆₀₀ av 0,5-0,8.
11. Sentrifuge ved 4000 × g ved romtemperatur i 5 min; fjern og kast supernatanten.
12. Resuspend cellepellet i 1 ml sterilt vann via skånsom pipetteblanding med filterspisser og overfør til et sterilt 1,5 ml mikrofugerør.
13. Pellet cellene ved sentrifugering ved 4000 × g ved romtemperatur i 1 min; fjern og kast supernatanten. Resuspend i 1 ml sterilt vann og gjenta for totalt to vasker.
14. Resuspend pellet i 1/100^th av volumet som brukes i trinn 1.10. For eksempel, hvis 15 ml ble brukt, resuspend pellet i 150 μL sterilt vann.
15. I et eget rør for hver transformasjonsreaksjon blander du 50 μL C-fragment, 50 μL dDNA, 2500 ng begrensningsenzymfordøyd pADH140 og 10 μL denaturert laksesperm-DNA.
16. Tilsett 50 μL av celleslammet fra trinn 1.14 og bland ved pipettering.
17. Lag et lager av plateblandingen (Tilleggsfil 1) for n + 1 transformasjoner.
18. Tilsett 1 ml av plateblandingen til celle/DNA-blandingen og bland ved å invertere 5 ganger.
    MERK: Trykk på bunnen av rørene mens du inverterer for å løsne eventuell gjenværende væske.
19. Plasser blandingen i en inkubator ved 30 °C over natten (12-16 timer) uten å riste.
20. Varmsjokk cellene i 15 min ved 44 °C i et vannbad.
21. Sentrifuger 1,5 ml mikrofunksjonsrør ved 5000 × g ved romtemperatur i 2 minutter.
22. Fjern PLATE-blandingen ved vakuumaspirasjon ved hjelp av sterile pipettespisser, og pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten.
23. Resuspend cellepellet i 1 ml YPD, pellet ved sentrifugering ved 4000 × g ved romtemperatur i 1 min, og fjern og kast supernatanten. Gjenta for en ny vask, resuspend cellepellet i 1 ml YPD, og overfør suspensjonen til en 10 ml rundbunn, engangskulturrør som inneholder ytterligere 1 ml YPD (2 ml sluttvolum). Gjenopprett cellene ved 30 °C med risting ved 250 o/min i 5 timer.
24. Sentrifuger rørene ved 4000 × g ved romtemperatur i 5 min; fjern og kast supernatanten.
25. Resuspend cellepellet i 100 μL sterilt vann og plate på YPD supplert med 200 μg/ml nourseothricin (NAT200). Inkuber ved 30 °C i 2-3 dager.
26. Aliquot 100 μL av 20 mM NaOH inn i brønnene på en 96-brønns PCR-plate, med hver brønn som tilsvarer en individuell koloni som vokste på NAT200-platene. Bruk en steril tannpirker eller pipettespiss, velg individuelle transformerte kolonier, dem på en ny NAT200-plate, og virvle de resterende cellene til en brønn med 20 mM NaOH. Gjenta for de resterende koloniene for å lage cellelyset som brukes som DNA-mal for cPCR-reaksjonen.
27. Forsegle PCR-platen og inkuber i 10 min ved 99 °C i en termosykler med oppvarmet lokk.
28. Sett opp to cPCR-reaksjoner med oligonukleotider designet i trinn 1.3-1.3.5. Skaler opp antall reaksjoner etter behov. Utfør PCR-reaksjonen med cellelyset fremstilt i trinn 1.26 etter sykkelforhold og PCR-reaksjonsblandinger fra tabell 6. Kjør 10-20 μL fra hver brønn på en 1% agarose gel. Se etter kolonier med forsterkning av de to cPCR primer settene som indikerer riktig innlemmet GFP dDNA.
29. Restreak-kolonier som innlemmet GFP på syntetiske komplette (SC) medier som manglet leucin. Inkuber i en 30 °C inkubator i 2-3 dager. Velg individuelle kolonier og på YPD og YPD supplert med 400 μg/ml nourseothricin (NAT400)-plater. Identifiser kolonier som ikke vokser på NAT400-plater etter 24 timer som de som har mistet CRISPR-komponentene.
30. Kontroller at GFP-koden beholdes ved å gjenta trinn 1.25-1.28 ved hjelp av celler fra YPD-patchplaten. Hvis de riktige båndene er til stede, inokulerer du i 4 ml YPD og vokser over natten (12-16 t), som beskrevet i trinn 1.7.
31. Bland nattkulturen til den nye GFP-merkede stammen med filtersterilisert 50% glyserol i et 1:1-forhold i et sterilt kryorør. Oppbevars ved -80 °C og hviler på YPD-plater etter behov.
    MERK: Det anbefales å validere GFP-merkede stammer ved å bekrefte kjernefysisk lokalisering av den taggede TF via fluorescerende mikroskopi og bekrefte en villtype fenotype i en passende fenotypisk analyse.

2. Prøvepreparering av biofilmkulturer

1. Streak C. albicans GFP-merket stamme (er) på YPD agarplater og inkuber ved 30 °C i 2-3 dager. Ved hjelp av en enkelt isolert koloni fra agarplaten inokulerer du til 4 ml YPD flytende medium. Inkuber ved 30 °C med risting over natten (12-16 timer). Bestem OD₆₀₀ for overnattingskulturen(e).
   MERK: Det anbefales å bruke tre biologiske repliker per prøve for CUT&RUN-eksperimentene.
2. Inokuler en steril 12-brønns ubehandlet cellekulturplate med nattkulturen til en endelig OD₆₀₀ på 0,5 (tilsvarende 2 × 10⁷ celler/ml) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium til et endelig volum på 2 ml. Inkuber i 90 min ved 37 °C i en mikroplateinkubator med risting ved 250 o/min.
   MERK: Det anbefales å bruke en 12-brønns cellekulturplate per stamme med en godt uinokulert som en middels alene forurensningskontroll. Denne protokollen har blitt brukt med så lite som 1/10^th av en 12-brønns cellekulturplate godt (eller så få som 5 millioner celler). Ved å bruke et høyere antall celler øker totale DNA-utbytter, noe som vanligvis resulterer i sekvenseringsbiblioteker av høy kvalitet.
3. Fjern uadhered celler ved aspirasjon ved hjelp av sterile pipettespisser festet via fleksibel plastrør til et vakuumfelleapparat. Vask de festede cellene en gang med 2 ml steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Tilsett 2 ml fersk RPMI-1640 medium til brønnene og inkuber i 24 timer ved 37 °C med risting ved 250 o/min.
   MERK: Bytt pipettespisser mellom brønner med ulike stammer og/eller forhold. Ikke skrap bunnen av brønnen med spissen mens du aspirerer.
4. På slutten av 24 timers inkubasjon samler og samler du væske- og biofilmmaterialet fra hver av de 11 inokulerte brønnene i et enkelt, sterilt 50 ml konisk rør. Gjenta etter behov med uavhengige bassenger hvis du behandler mer enn én belastning eller veksttilstand samtidig.
   MERK: Skrap bunnene og kantene på hver brønn med en pipettefiltertupp for å løsne celler som forblir festet til overflaten. Bruk pipetten til å homogenisere biofilmene.
5. Pelletsprøver ved sentrifugering ved 4000 × g ved romtemperatur i 5 min. Dekanter så mye av supernatanten som mulig, og pass på å minimere forstyrrelse av pelletsen. Frys pelletsen i flytende nitrogen og oppbevar den ved -80 °C umiddelbart etter oppsamling, eller fortsett direkte til trinn 4 (isolering av kjerner).

3. Prøvepreparering av planktoniske kulturer

1. Streak C. albicans GFP-merket stamme (er) på YPD agarplater og inkuber ved 30 °C i 2-3 dager. Ved hjelp av en enkelt isolert koloni fra agarplaten inokulerer du til 4 ml YPD flytende medium. Inkuber ved 30 °C med risting over natten (12-16 timer). Bestem OD₆₀₀ for overnattingskulturen(e).
2. Back-fortynnet natt kulturer til OD₆₀₀ av 0,1 i 50 ml RPMI-1640 flytende medium og inkubere ved 30 °C med risting ved 225 o/min i 2-5 timer til OD₆₀₀ er mellom 0,5 og 0,8.
   MERK: Celler bør gå gjennom minst to doblinger før de høstes. Forholdene som brukes til planktonkulturer kan justeres etter behov.
3. Pellet prøvene ved sentrifugering på 4000 × g ved romtemperatur i 5 min. Dekanter så mye av supernatanten som mulig, og pass på å minimere forstyrrelse av pelletsen. Frys pelletsen i flytende nitrogen og oppbevar den ved -80 °C umiddelbart etter oppsamling, eller fortsett direkte til trinn 4 (isolering av kjerner).

4. Isolering av kjerner

MERK: På eksperimentets dag, lag fersk ficollbuffer, tilsett 2-mercaptoetanol og proteasehemmer til aliquot(er) av resuspensionbufferen, og tilsett proteasehemmer til aliquot(er) av SPC Buffer (se Tilleggsfil 1). For å resuspendere pellets, forsiktig pipette ved hjelp av enten 200 μL eller 1 ml pipettespisser for å unngå å skade cellene eller kjernene. Før du begynner kjerneisolasjonen, slå på varmeblokken for å forvarme den til 30 °C. Alle pipettespisser og rør for resten av denne protokollen skal være sertifisert DNA/RNA og DNase/RNase-free, og bruk av filtertips anbefales for alle påfølgende pipetteringstrinn.

1. Resuspend pellet(er) i 1 ml romtemperatur Resuspension Buffer og overfør til et sterilt 1,5 ml mikrofugerør. Pellet ved 2000 × g ved romtemperatur i 2 min i en bord-topp sentrifuge og fjerne supernatanten.
   MERK: Fjern supernatanten med pipettespissen på enten 200 μL eller 1 ml, og pass på at pelletsene forstyrres.
2. Resuspend pellet(e) i 200 μL av romtemperatur Resuspension Buffer. Fra den resuspenderte pellet, overfør en 5 μL aliquot til et nytt PCR-rør og oppbevar det ved 4 °C for senere bruk.
   MERK: Denne aliquoten vil bli brukt som en kontroll under et påfølgende kvalitetskontrolltrinn for å evaluere kvaliteten på de isolerte kjernene.
3. Pellets ved 2000 × g i 2 minutter og fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Gjenta vasketrinnet to ganger med 200 μL resuspensionbuffer.
4. Sentrifuge ved 2000 × g ved romtemperatur i 2 min og fjern supernatanten. Tilsett 300 μL resuspensionbuffer og 10 μL lyticaseoppløsning (50 mg/ml, se materialtabellen). Inkuber i 30 min ved 30 °C i en varmeblokk.
   MERK: Alternativt kan et vannbad som er oppvarmet til 30 °C også brukes i stedet for en varmeblokk. Spheroplasting forholdene som brukes her har blitt optimalisert for å være effektive for både gjær og hyphal celler av C. albicans. Det anbefales å optimalisere spheroplasting forholdene når du bruker denne protokollen på C. albicans celler med mutasjoner som påvirker celleveggintegritet eller andre cellulære morfologier. I løpet av dette 30 min inkubasjonstrinnet har brukeren muligheten til å fullføre trinn 5 (Concanavalin A Bead Activation) på forhånd for å spare tid.
   1. KRITISK TRINN: Etter 30 min inkubasjon trinn, overføre en 5 μL aliquot inn i et nytt PCR-rør. Til 5 μL isolerte kjerner og 5 μL aliquot av intakte celler lagret ved 4 °C fra trinn 4.2, tilsett 1 μL kalorihvit (et fluorescerende celleveggfargestoff) og 1 μL SYTO 13 (en nukleinsyreflekk). Inkuber ved 30 °C i mørket i 30 minutter.
   2. Inspiser integriteten og renheten til de isolerte kjernene visuelt ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Se etter isolerte kjerner som viser fremtredende fargede intakte kjerner (ved hjelp av et 488-509 nm eksitasjonsfilter) og sørg for at det ikke er noen celleveggfarging av kaloriveggens hvite fargestoff (ved hjelp av et 390-420 nm eksitasjonsfilter). I de intakte kontrollcellene, se etter fremtredende celleveggfarging av kalorihvit fargestoffet (ved hjelp av et 390-420 nm eksitasjonsfilter) og farget intakte kjerner (ved hjelp av et 488-509 nm eksitasjonsfilter).
5. Sentrifuge ved 2000 × g ved 4 °C i 5 minutter og fjern supernatanten. Resuspend pellet i 500 μL iskald resuspension buffer ved hjelp av 1 ml filter tips ved pipettering forsiktig opp og ned 5 ganger. Sentrifuger ved 2000 × g ved 4 °C i 5 minutter, og fjern supernatanten ved hjelp av en 1 ml pipette. Resuspend pellets med 1 ml nylaget iskald Ficoll Buffer.
   MERK: Hold prøvene og bufferne på isen fra dette punktet fremover.
6. Sentrifuger prøvene ved 5000 × g ved 4 °C i 10 minutter og fjern supernatanten. Resuspend pellet i 500 μL iskald SPC Buffer.
   MERK: Fra dette punktet og fremover håndterer du kjernene ekstremt forsiktig for å unngå å skade dem.
7. Sentrifuger prøvene ved 5000 × g ved 4 °C i 10 minutter og fjern så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre pelletsen. Plasser rørene som inneholder de pelleterte kjernene på isen, og fortsett til trinn 5. Hvis trinn 5 allerede var fullført på forhånd i trinn 4.4, fortsett til trinn 6 eller snap-frys pelletsene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C umiddelbart etter innsamling.

5. Concanavalin En perle aktivering

MERK: Dette er et kritisk trinn. Fra dette tidspunktet har brukerne muligheten til å fortsette med protokollen ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig CUT&RUN-sett eller kildenøkkelkomponenter individuelt og forberede buffere internt. Hvis du bruker det kommersielle settet, er alle buffere og reagenser som brukes nedenfor inkludert i settet med mindre annet er angitt. Individuelle katalognumre for sourcing reagenser uavhengig er også gitt i materialtabellen. Kjøl ned alle buffere på is før bruk. Når trinn 5 er fullført, anbefales det å gå videre til trinn 6 umiddelbart. Unngå flere fryse-tining av isolerte kjerner som det er kjent for å øke DNA-skade og kan føre til dårlig kvalitet resultater.

1. Resuspend forsiktig concanavalin A (ConA) perler ved hjelp av en pipette. Overfør 22 μL ConA per prøve som skal behandles i et enkelt mikrofunksjonsrør på 1,5 ml. Plasser røret på et magnetisk stativ til perleslammet er klart; fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette.
   MERK: Når du utfører CUT&RUN for totalt 10 prøver, for eksempel, overfør 220 μL av ConA perle suspensjon til en 1,5 ml mikrofuge rør.
2. Fjern røret som inneholder ConA-perlene fra magnetstativet, og tilsett umiddelbart 200 μL iskald beadaktiveringsbuffer og bland forsiktig med en pipette. Plasser røret på magnetstativet til perleslammet er klart; fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Gjenta dette trinnet for totalt to vasker.
3. Resuspend perlene i 22 μL iskald perleaktiveringsbuffer per prøve av kjerner som skal behandles. Hold perlene på is til det er nødvendig.
   MERK: Gjennomstrømningen til de påfølgende trinnene avhenger av antall og kapasitet på magnetiske rørstativer som er tilgjengelige. Behandling av 32 prøver i to rørstativer med 16 brønner er et håndterbart tall for de fleste brukere av denne protokollen. Høyere gjennomstrømning er imidlertid mulig for mer erfarne brukere, eller hvis robotiserte væskehåndteringssystemer er tilgjengelige.

6. Binde kjerner til aktiverte perler

MERK: Kjøl ned alle buffere på is før bruk. Alle buffere supplert med proteasehemmere skal tilberedes friskt på eksperimentets dag. Det anbefales å bruke 0,2 ml striperør i de påfølgende trinnene.

1. Resuspend den pelleterte kjernen fra trinn 4 i 100 μL iskald SPC Buffer og overfør til en ny 8-rørs 0,2 ml stripe. Tilsett 20 μL av de aktiverte perlene til hver prøve og forsiktig pipette for å blande. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter uten agitasjon.
2. Plasser rørene på magnetstativet til slammet er klart; fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Fjern rørene fra magnetstativet, og tilsett 200 μL iskald vaskebuffer til hver prøve. Resuspend perlene ved forsiktig pipettering opp og ned 5 ganger. Overfør 100 μL aliquots fra hver prøve til en ny 8-rørs 0,2 ml stripe.
   1. KRITISK TRINN: Del hver CUT&RUN-prøve i to separate aliquots. Bruk en av aliquots for negativ kontroll antistoff (f.eks, IgG negativ kontroll antistoff) og den andre for målet antistoff mot protein av interesse (f.eks, anti-GFP antistoff).
      MERK: Begge prøvene er nødvendige for at beregningsrørledningen skal kunne identifisere berikelsessignaler som er spesifikke for TF av interesse. En ekstra kontroll ved bruk av anti-GFP-antistoffer med en ukodet stamme kan også utføres. Denne kontrollen har vist resultater som kan sammenlignes med bruk av IgG-antistoffer i en GFP-merket stamme. Derfor, for enkelhets skyld, anbefales det å bruke standard IgG-kontroll for alle eksperimenter.

7. Primær antistoffbinding

MERK: pAG-MNase fusjonsprotein binder seg godt til kanin, geit, esel, marsvin og mus IgG antistoffer¹⁷. Generelt er de fleste kommersielle ChIP-seq-sertifiserte kommersielle antistoffer kompatible med CUT&RUN-prosedyrer. Mengden primært antistoff som brukes avhenger av antistoffets effektivitet, og titrering av antistoffet (f.eks. 1:50, 1:100, 1:200 og 1:400 endelig fortynning) kan være nødvendig hvis antistoffet av interesse ikke tidligere er testet i ChIP- eller CUT&RUN-eksperimenter. Kjøl ned alle buffere på isen før bruk. Alle buffere som brukes til antistoffbindingstrinn, bør tilberedes friskt på eksperimentets dag.

1. Plasser rørene på et magnetisk stativ og vent til slammet er helt klart; fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Tilsett 50 μL av antistoffbufferen og bland forsiktig ved pipettering.
2. Tilsett 3 μL av anti-GFP polyklonalt antistoff (eller 0,5 μg hvis du bruker et uprøvd antistoff). Inkuber rørene på en mutterblander ved 4 °C i 2 timer.
   MERK: Noen CUT&RUN-protokoller rapporterer økt avkastning ved å legge til et sekundært antistoff før pAG-MNase tillegg¹⁴; Imidlertid ble det ikke observert noen signifikant forbedring ved hjelp av dette ekstra trinnet, og dermed er det ikke inkludert i denne protokollen.
3. Sentrifuger rørene kort ved 100 × g ved romtemperatur i 5 s, plasser rørene på et magnetisk stativ, og når slammet er klart, fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Mens rørene som inneholder perlene fortsatt er på magnetstativet, tilsett 200 μL iskald cellepermeabiliseringsbuffer direkte på perlene. Fjern og kast supernatanten med en pipette. Gjenta for totalt to vasker med den iskalde cellepermeabiliseringsbufferen.
4. Tilsett 50 μL iskald cellepermeabiliseringsbuffer til hvert rør og bland forsiktig ved pipettering.
   MERK: Perler er ofte aggregert på dette punktet, men kan lett spres ved å blande forsiktig ved hjelp av en 200 μL pipette.

8. Binding av pAG-MNase til antistoff

1. Tilsett 2,5 μL pAG-Mnase (20x lager) i hver prøve og bland forsiktig ved pipettering. Plasser prøvene (litt forhøyet i ~45° vinkel) på en mutter ved 4 °C. Slå på mutteren og inkuber prøvene i 1 time.
2. Sentrifuger kort striperørene ved 100 × g ved romtemperatur i 5 s, plasser rørene på et magnetisk stativ, og når slammet er klart, fjern og kast supernatanten ved hjelp av en pipette.
   MERK: Dette trinnet er kritisk. Overfør antistoff som gjenstår i hetten eller sidene av rørene etter dette trinnet, vil øke mengden bakgrunnssignal betydelig.
3. Mens rørene som inneholder perlene fortsatt er på magnetstativet, tilsett 200 μL iskald cellepermeabiliseringsbuffer, la slurryet fjerne og fjerne og kaste supernatanten ved hjelp av en pipette. Gjenta dette trinnet for totalt to vasker med cellepermeabiliseringsbufferen.
4. Tilsett 100 μL av den iskalde cellepermeabiliseringsbufferen i prøvene og rør forsiktig opp og ned 5 ganger.

9. Målrettet kromatin fordøyelse og frigjøring

1. Inkuber rørene som inneholder prøven(e) i et vått isbad i 5 min. Tilsett 3 μL 100 mM CaCl₂ i hver prøve ved hjelp av en flerkanals pipette. Rør forsiktig opp og ned 5 ganger, returner straks rørene til det våte isbadet, og inkuber i 30 minutter.
2. Tilsett 66 μL stoppbuffer i hver prøve og forsiktig virvel som skal blandes. Inkuber prøver i 10 min ved 37 °C i et tørt bad.
   MERK: Det anbefales å tilsette 1,5 pg heterolog E. coli spike-in DNA per prøve i stoppbufferen. Tillegget av 1,5 pg E. coli spike-in DNA resulterer i 1,000-10,000 kartlagt spike-in leser for 1-10 millioner kartlagt eksperimentelle leser¹⁴. Spike-in DNA brukes til å kalibrere sekvenseringsdybden og er spesielt viktig for å sammenligne prøver i en serie. Tillegg av spike-in E. coli anbefales på det sterkeste, men ikke viktig. Det kommersielle CUT&RUN-settet inkluderer E. coli spike-in DNA, men det kan også kjøpes separat.
3. Plasser rørene på magnetstativet og overfør 160 μL av supernatanten til et 1,5 ml mikrofugerør. Overfør 80 μL av prøven til et nytt 2 ml mikrofugerør og oppbevar ved -20 °C i tilfelle det er behov for en reserveprøve. Fortsett til trinn 10 med 80 μL-prøven.

10. Opprydding av innsamlede DNA-prøver

MERK: Inkuber DNA-renseperler ved romtemperatur i 30 minutter før bruk. Prechill 100% isopropanol på is. Ved blanding av prøvene, pipette opp og ned 10 ganger.

1. Vortex DNA Rensende perler for å homogenisere perle suspensjon. Tilsett 50 μL (~0,6x prøvevolum) av de resuspenderte perlene i hver prøve. Pipetteblanding og inkuber prøvene på en mutter i 5 min ved romtemperatur.
   MERK: Forholdet mellom DNA-renseperler og prøve brukt er kritisk. Ved å bruke 0,6x volum DNA-renselsesperleløsning i forhold til prøven, kan de magnetiske perlene binde seg til store DNA-fragmenter frigjort fra skadede kjerner. CUT&RUN-berikede DNA-fragmenter er mye mindre enn disse store DNA-fragmentene og beholdes dermed i supernatanten på dette trinnet.
2. Plasser rørene på et magnetisk stativ og overfør 130 μL av supernatanten som inneholder DNA til en 0,2 ml 8-rørs stripe. Tilsett ytterligere 30 μL DNA-renseperler i prøven(e) (det totale volumet er 160 μL).
3. Tilsett 170 μL (~ 1x prøvevolum) av iskald 100% isopropanol, bland godt ved å pipettere opp og ned 10 ganger, og inkubere på is i 10 minutter.
   MERK: Det er kritisk at 100% iskald isopropanol brukes til dette trinnet for DNA-rensende perler for effektivt å fange CUT&RUN-berikede små fragmenter.
4. Plasser rørene på magnetstativet, og når slammet er ryddet, fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
5. Mens rørene er på magnetstativet, tilsett 200 μL nytilberedt, romtemperatur 80% etanol til rørene og inkuber ved romtemperatur i 30 s. Fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette. Gjenta dette trinnet for totalt to vasker med 80% etanol.
6. Spinn raskt rørene på 100 × g, plasser rørene tilbake på magnetstativet, og fjern eventuelt gjenværende etanol ved hjelp av en pipette etter at slammet er ryddet. Lufttørk perlene i 5 minutter mens rørene forblir på magnetstativet med lokket åpent.
   MERK: Ikke overskrid 5 min tørketid, da dette kan redusere det endelige DNA-utbyttet betydelig.
7. Fjern rørene fra magnetstativet og eluter DNA-et fra perlene ved å tilsette 17 μL 0,1x Tris-EDTA (TE) ved pH 8. Bland godt og inkuber rørene i 5 min ved romtemperatur.
8. Plasser rørene på magnetstativet til slammet blir klart. Når slammet er fjernet, må du forsiktig overføre 15 μL av supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
9. Mål konsentrasjonen av det innsamlede DNA-et ved hjelp av et fluorometer etter produsentens protokoll.
   MERK: Vanligvis er konsentrasjonen av det innsamlede DNA ~1 ng/μL. Noen ganger er konsentrasjonen av det innsamlede DNA for lav til å kvantifisere ved hjelp av et fluorometer. Dette er ikke en indikator på et mislykket eksperiment. Fortsett med bibliotekforberedelsene uavhengig av konsentrasjonen av det innsamlede DNA-et.
10. Fortsett til trinn 11 eller oppbevar prøvene ved -20 °C til de er klare.

11. Bibliotekforberedelse for sekvensering

MERK: Følgende trinn bruker et kommersielt tilgjengelig klargjøringssett for bibliotek. Når du utfører trinn ved hjelp av Ligation Master Mix, må du minimere berøringen av rørene og alltid holde dem på is.

1. Bruk 0,1x TE ved pH 8, få opp det totale volumet av CUT&RUN DNA til 50 μL. Lag en masterblanding på 3 μL end prep enzymblanding og 7 μL end prep reaksjonsbuffer per prøve. Tilsett 10 μL master mix til CUT&RUN DNA og bland grundig ved å pipettere opp og ned 5 ganger.
2. Utfør et raskt spinn på 100 × g for å samle all væske fra sidene av røret. Plasser rørene i en termosykler med det oppvarmede lokket satt til ≥75 °C og kjør sykkelforholdene i tabell 7.
   MERK: Avhengig av startinngangens DNA-konsentrasjoner samlet inn fra trinn 10, følger du den nødvendige adapterfortynning fra tabell 8.
3. Tilsett 2,5 μL adapter per prøve og bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger.
   MERK: Det er viktig at adapteren legges til prøven og blandes grundig før ligasjonsmasterblandingen tilsetts.
4. Lag en mesterblanding av 30 μL ligation master mix og 1 μL ligation enhancer. Tilsett 31 μL av hovedblandingen i prøven(e). Bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger.
5. Inkuber ved 20 °C i 15 minutter i en termosykler med det oppvarmede lokket av.
   MERK: Det er viktig at prøver oppbevarer seg på is og overføres til termosykleren først etter at termosykleren har nådd 20 °C.
6. Utfør et raskt spinn på 100 × g for å samle all væske fra sidene av røret, tilsett 3 μL Uracil Excision Enzyme, og inkuber rørene i termosykleren ved 37 °C i 15 minutter med det oppvarmede lokket satt til ≥47 °C.
   MERK: Dette er et trygt stoppested; oppbevar prøvene ved -20 °C eller fortsett direkte til trinn 11.7. Hvis du fortsetter direkte til trinn 11.7, inkuberER du DNA-renseperlene ved romtemperatur i 30 minutter før bruk.
7. Tilsett 154,4 μL (~1,6x prøvevolum) av DNA-renseperlene til Adapter Ligation-reaksjonen fra trinn 11.6. Pipetteblanding og inkuber prøvene i 5 min ved romtemperatur.
8. Plasser rørene på magnetstativet, og når slammet er fjernet, fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
9. Tilsett 200 μL nytilberedt, romtemperatur 80% etanol til rørene og inkuber ved romtemperatur i 30 s. Fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette og gjenta dette trinnet for totalt to vasker med 80% etanol.
10. Snurr rørene kort ved 100 × g. Plasser rørene tilbake på magnetstativet og fjern eventuell gjenværende etanol ved hjelp av en pipette. Lufttørk perlene i 5 minutter mens rørene forblir på magnetstativet med lokket åpent.
    MERK: Ikke overskrid 5 min tørketid, da dette kan redusere det endelige DNA-utbyttet betydelig.
11. Fjern rørene fra magnetstativet og unngå DNA fra perlene ved å legge til 17 μL 0,1x TE ved pH 8. Bland godt og inkuber i 5 min ved romtemperatur.
12. Plasser rørene på magnetstativet til slammet blir klart. Når slammet er fjernet, må du forsiktig overføre 15 μL av supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
13. Lag en masterblanding på 25 μL DNA Polymerase Master Mix og 5 μL Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) per prøve.
    MERK: Forbered en ekstra prøve av master mix for å ta høyde for pipetteringstap.
14. Tilsett 30 μL av hovedblandingen til 15 μL adapter-ligated DNA-prøve. Tilsett 5 μL omvendt unikt indeksert bibliotekforsterkning Primer (10 μM) i hver prøve for å bringe det endelige volumet til totalt 50 μL. Bland grundig ved å pipettere opp og ned 10 ganger. Utfør PCR-sykkelforholdene i tabell 9.
    MERK: Inkuber DNA-renseperlene ved romtemperatur i 30 minutter før bruk.
15. Virvel DNA-renselsesperlene for å gjenopplive. Tilsett 35 μL (~0,7x prøvevolum) av de resuspenderte perlene til PCR-forsterkede DNA-prøver. Bland og inkuber prøvene på en mutter i 5 minutter ved romtemperatur.
16. Plasser rørene på magnetstativet, og når slammet er klart, overfør supernatanten som inneholder DNA-et til et nytt 0,2 ml 8-brønns PCR-striperør.
17. Tilsett 119 μL (~1,4x prøvevolum) perler i prøven, og bland ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Inkuber prøvene på en mutter i 5 min ved romtemperatur.
18. Plasser rørene på magnetstativet, og når slammet er fjernet, fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
19. Tilsett 200 μL nytilberedt, romtemperatur 80% etanol til rørene og inkuber ved romtemperatur i 30 s. Fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette; gjenta trinnet for totalt to vasker med 80% etanol.
20. Snurr rørene kort ved 100 × g. Plasser rørene tilbake på magnetstativet og fjern eventuell gjenværende etanol ved hjelp av en pipette. Lufttørk perlene i 5 minutter mens rørene forblir på magnetstativet med lokket åpent.
    MERK: Ikke overskrid 5 min tørketid, da dette kan redusere det endelige DNA-utbyttet betydelig.
21. Fjern rørene fra magnetstativet og unngå DNA fra perlene ved å legge til 14 μL 0,1x TE ved pH 8. Bland godt og inkuber i 5 min ved romtemperatur.
22. Plasser rørene på magnetstativet til slammet blir klart. Når slammet er fjernet, må du forsiktig overføre 13 μL av supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
23. Forbered fersk 1x Tris-borate-EDTA (TBE) og sett inn ferdiglaget, kommersiell 10% akrylamid TBE gel i gelelektroforeseapparatet fylt med 1x TBE.
24. I den første brønnen legger du til 2 μL lavdistanse DNA-stige. Bland 3 μL 6x lastefargestoff med 13 μL av prøven som tidligere ble samlet inn fra trinn 11.22. Tilsett forsiktig 15 μL i hver brønn av gelen. Kjør gelen i 90 min ved 70 V.
    MERK: Det anbefales å la en brønn i gelen stå tom mellom hver prøve, da dette reduserer sannsynligheten for prøvekrysskontaminering. Erfarne brukere kan synes det er hensiktsmessig å bruke alle brønner samtidig som de forsiktig unngår krysskontaminering, spesielt ved behandling av et stort antall prøver.
25. Fjern gelstøpet fra gelboksen. Åpne gelstøpet i henhold til produsentens instruksjoner, fjern gelen forsiktig fra gelstøpet, og legg den inne i et gelholderbrett som inneholder 100 ml 1x TBE.
    MERK: Pass på at du forsiktig fjerner gelen fra gelstøpet for å unngå å rive gelen, da den er tynn og skjør. Det er viktig å forhåndsvekse hansker og gelen med 1x TBE når du håndterer gelen. Gelholderbrettet skal være litt større enn gelens størrelse (ca. 0,5" på hver side). Plastlokkene som er utstyrt med 96-brønns PCR-rør oppbevaringsbokser er praktiske oppbevaringsbrett for standard minigelstørrelser.
26. Tilsett 10 μL av nukleinsyregelflekken til brettet og virvle forsiktig. Dekk med folie for å beskytte mot lys og inkuber statisk ved romtemperatur i 10 min.
27. Skyll gelen to ganger med 100 ml deionisert vann fra springen. Se for deg gelen under blått lysbelysning ved hjelp av et gult filterdeksel (figur 2).
    MERK: Vellykkede biblioteker viser et smør mellom 100 og 500 bp. Det vil også være et fremtredende ~ 125 adapter dimer band. Tilstedeværelsen av adapterdempere er ikke en indikator på dårlig bibliotekkvalitet. Denne mengden adapterdempere er uunngåelig for CUT&RUN-eksperimenter utført på TFer med lav overflod og er en konsekvens av den lave mengden inndatamateriale som brukes til å klargjøre disse bibliotekene. Ikke bruk ultrafiolett lys, noe som kan skade DNA-et.
28. Som vist i figur 2, for hvert bibliotek, kutt gelen litt over ~125 bp fremtredende adapter dimer band (sørg for å unngå å berøre adapteren dimer band) og under 400 bp stigemerket.
    MERK: Det er viktig å unngå ~125 adapter dimer band. Selv små mengder adapter dimers vil redusere bibliotekkvaliteten betydelig.
29. Punkter bunnen av et 0,65 ml rør med en 22 G nål og plasser det punkterte røret inne i et sterilt 2 ml mikrofugerør. Overfør gelskiven til det punkterte røret inne i 2 ml mikrofugerøret.
30. Sentrifuger det 2 ml mikrofunksjonsrøret som inneholder det 0,65 ml punkterte røret og prøven ved 10 000 × g ved romtemperatur i 2 minutter for å samle gelslammet inne i det 2 ml mikrofunksjonsrøret.
    MERK: Det punkterte røret skal nå være tomt og kan kastes. Hvis det punkterte røret fortsatt har noen gel igjen inne, plasser det punkterte røret tilbake inne i 2 ml mikrofugerøret og sentrifugen igjen ved 10.000 × g ved romtemperatur i ytterligere 2 minutter.
31. Til gel slurry inne i 2 ml mikrofugerøret, tilsett 300 μL iskald gel elution Buffer og bland på en mutter ved romtemperatur i minst 3 timer eller over natten (12-16 timer).
32. Overfør all væske og gelslam til en filterkolonne på 0,22 μm. Sentrifuge ved 10.000 × g ved romtemperatur i 1 min; det innsamlede volumet skal være ~300 μL.
33. Tilsett 450 μL (~ 1,5x prøvevolum) av DNA-renseperler, inkuber ved romtemperatur i 5 minutter på en mutter, og plasser deretter prøven på magnetstativet til slammet er klart.
    MERK: Inkuber DNA-renseperlene ved romtemperatur i 30 minutter før bruk.
34. Fjern og kast 500 μL av supernatanten, sørg for ikke å forstyrre perlene.
35. Fjern prøven fra magnetstativet og bland perlene ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Overfør 200 μL av prøven til et nytt PCR-striperør.
36. Plasser striperøret på magnetstativet, og når slammet er ryddet, fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
37. Tilsett 200 μL nytilberedt, romtemperatur 80% etanol til rørene og inkuber ved romtemperatur i 30 s. Fjern og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette; gjenta dette trinnet for totalt to vasker med 80% etanol.
38. Snurr rørene kort ved 100 × g. Plasser rørene tilbake på magnetstativet og fjern eventuell gjenværende etanol ved hjelp av en pipette. Lufttørk perlene i opptil 5 minutter mens rørene forblir på magnetstativet med lokket åpent.
    MERK: Ikke overskrid 5 min tørketid, da dette kan redusere det endelige DNA-utbyttet betydelig.
39. Fjern rørene fra magnetstativet og unngå DNA fra perlene ved å legge til 17 μL 0,1x TE ved pH 8. Bland godt og inkuber rørene i 5 min ved romtemperatur.
40. Plasser rørene på magnetstativet til slammet blir klart. Når slammet er fjernet, må du forsiktig overføre 15 μL av supernatanten til et sterilt 0,2 ml PCR-rør.
41. Mål den endelige bibliotekmengden ved hjelp av fluorometeret; Bruk dette endelige biblioteket til sekvensering.
    MERK: Opptil 48 biblioteker kan samles og sekvenseres sammen i ett kjørefelt ved hjelp av en sekvenseringsplattform som gir minst 300 millioner 40 bp eller lengre sammenkoblede lesinger.

12. ANALYSE AV CUT&RUN-sekvens

MERK: Denne delen presenterer beregningsprotokollen som brukes til å analysere CUT&RUN-sekvensdataene. Protokollen begynner med å sette opp det beregningsmessige virtuelle miljøet og veileder brukerne gjennom å utføre kommandoene på den lokale maskinen. Denne protokollen fungerer på alle databehandlingsressurser, for eksempel lokale maskiner, virtuelle skyservere og dataklynger med høy ytelse. Alle CUT&RUN-data som presenteres i dette dokumentet, er tilgjengelig på NCBI GEO under tiltredelsesnummer GSE193803.

1. Last ned kildekoden for CUT&RUN-analysen fra https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
   MERK: Arbeidsflyten fungerer best på et MacOS- eller Linux OS-system. Windows-brukere kan kjøre arbeidsflyten ved hjelp av GitBash (se Materialfortegnelser).
   1. Last ned koden direkte fra GitHub-siden ved å klikke på den grønne Kode-knappen | Last ned ZIP-alternativet . Pakk ut mappen til en relevant plassering på den lokale maskinen.
2. Installer Conda-miljøet (se materiallisten) og kjør bare én gang.
   MERK: Denne arbeidsflyten bruker Conda kommandolinjeverktøymiljø til å installere all nødvendig programvare og alle nødvendige verktøy.
3. Når Conda er installert (kjør bare én gang), oppretter du et virtuelt miljø ved hjelp av tilleggsfilen 2 som følger med følgende kommando:
   conda create --navn --fil Supplementary_File_2.txt
4. Aktiver det virtuelle miljøet hver gang denne arbeidsflyten skal utføres ved hjelp av:
   conda aktivere
5. Organiser input raw FASTQ-filene i en enkelt mappe, ideelt sett en mappe per CUT&RUN-eksperiment.

13. Generering av genomfilen for justering

1. Generer genomfilen for justering (kjør bare én gang for hver genomfil). Opprett en mappe for å lagre alle C. albicans-genomfiler , for eksempel:
   mkdir ca_genome_files

14. Nedlasting av C. albicans genom samling 21

1. Last ned C. albicans genomsamling 21 fra Candida Genome Database ved hjelp av enten wget- eller krøllverktøy (se materialtabellen)¹⁸.
   MERK: C. albicans montering 21 ble brukt her for å sammenligne CUT&RUN resultater med tidligere publiserte ChIP-chip resultater, som ble justert til Assembly 21. Brukere kan laste ned andre samlingsversjoner og kjøre lignende kommandoer for å generere relevante genomfiler for deres justeringsbehov.

15. Generer en Bowtie 2 indeksdatabase (databasenavn: ca21)

1. Bruk følgende:
   bowtie2-bygget C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   bowtie2-inspisere -s ca21

16. Kjør cut&run analyserørledning

1. Les hjelpedelen for å bli kjent med parametrene til datasamlebåndet.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Utfør den cut_n_run_pipeline.sh filen med relevante parametere

1. Utfør skriptet:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 å å y å y > /path/to/output.log 2>&1
   MERK: De relevante parametrene med detaljerte beskrivelser på linje 19-36 i koden er beskrevet på GitHub-siden https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organiser utdatafiler

1. Slå sammen betydelige topper fra alle replikeringer kalt av MACS2 som ligger i /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 ved hjelp av BedTools-sammenslåingsfunksjonen¹⁹.
   katt / bane / til / inngang / mappe / peakcalling / macs2 / all_replicate_files sortere -k1,1 -k2,2n | fusjonert -c 4,5,6,7,8,9 -o siste,gjennomsnitt,første,gjennomsnitt,gjennomsnitt,gjennomsnitt > /path/to/merged_output.bed
   MERK: Hvis du vil ha mer informasjon og anbefalte fremgangsmåter for å vurdere overlappende topper i replikeringsprøver, kan du se Landt et ^al.20 og Boyd et ^al.21.

19. Fjern treff til blokkerte genomiske regioner ved hjelp av BedTools-trekkfunksjonen

1. Bruk følgende: subtrahert -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   MERK: De blokklistede regionene i C. albicans-genomet leveres som en .bed-fil i Supplementary File 3. Listen består hovedsakelig av svært repeterende sekvenselementer og regioner som telomeriske repetisjoner og sentromerer som vanligvis gir falske positive resultater i C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq og ChIP-chip datasett. Derfor anbefales det å fjerne de blokklistede regionene. For visse proteinmål kan det imidlertid være upassende eller uønsket å utelukke disse lociene. Brukere kan hoppe over dette trinnet for å beholde signaler i disse blokklistede områdene eller opprette sine egne blokklistede regioner.

20. Slå sammen BigWig-filer fra repliker ved hjelp av UCSC bigWigMerge-funksjonen²²

1. Bruk følgende: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. Konverter BedGraph-utgangen fra bigWigMerge til BigWig ved hjelp av UCSC bedGraphToBigWig-funksjonen.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Representative Results

Denne robuste CUT&RUN-protokollen ble tilpasset og optimalisert for å undersøke den genomomfattende lokaliseringen av spesifikke TFer i C. albicans biofilmer og planktonkulturer (se figur 2 for en oversikt over eksperimentell tilnærming). En grundig dataanalysepipeline er også inkludert for å lette analysen av de resulterende CUT&RUN-sekvenseringsdataene og krever at brukerne har minimal kompetanse innen koding eller bioinformatikk (se figur 3 for en oversikt over analyserørledningen). I motsetning til ChIP-chip- og ChIP-seq-metodene utføres CUT&RUN ved hjelp av intakte, permeabiliserte kjerner fremstilt fra et betydelig redusert antall inngangsceller, uten formaldehyd krysskobling. Å isolere intakte kjerner fra C. albicans spheroplasts er et kritisk skritt i protokollen. Effektiv spheroplasting via fordøyelsen av C. albicans cellevegg ved hjelp av lyticase kan være utfordrende, da de enzymatiske fordøyelsesreaksjonsforholdene må optimaliseres for hver celletype. For å sikre et vellykket CUT&RUN-eksperiment med sekvenseringsresultater av høy kvalitet, er det derfor inkludert et trinn for tidlig kvalitetskontroll, og tilstedeværelsen av intakte kjerner verifiseres ved hjelp av et standard fluorescensmikroskop.

Cellevegg fordøyelse og kjernefysisk integritet vurderes regelmessig ved å visualisere både kontroll intakte celler og isolerte kjerner farget med fluorescerende cellevegg og nukleinsyre flekker. I motsetning til de isolerte intakte kjernene, der celleveggfarging ikke observeres, er både kjerner og cellevegger fluorescerende merket i de intakte kontrollcellene (figur 4A). Til slutt, før sekvensering, evalueres fragmentstørrelsesfordeling av CUT&RUN-biblioteker ved hjelp av et kapillær elektroforeseinstrument. Dette kvalitetskontrolltrinnet er et pålitelig tiltak for å vurdere kvaliteten på CUT&RUN-biblioteker. Som sett i elektroforesesporet på topppanelet i figur 4B, viser vellykkede biblioteker generert for eksperimenter som undersøker TFer høy berikelse for fragmenter mindre enn 280 bp. Elektroforesesporet i bunnpanelet i figur 4B representerer resultater fra et mislykket CUT&RUN-eksperiment.

Her oppsto toppen på ~ 2000 bp hovedsakelig fra ufordøyd DNA frigjort fra kjerner som ble omfattende skadet eller ødelagt under CUT&RUN-eksperimentet. Det anbefales også å vurdere fragmentstørrelsesfordelingen for de endelige samlede bibliotekene for å bekrefte fullstendig fjerning av forurensende adapterdempere (figur 4C). Vanligvis gir 5-10 millioner parkoblede leseoperasjoner (~ 40 basisleselengde) per bibliotek tilstrekkelig sekvenseringsdybde for de fleste TF CUT&RUN-eksperimenter i C. albicans. Alternative leselengder for sekvensering, enten sammenkoblet eller ensidig, kan brukes til å sekvensere CUT&RUN-biblioteker. Leselengder på parvis ende mellom 25 og 150 bp bør for eksempel ikke påvirke kvaliteten på resultatene. Enkeltlesninger som er større enn eller lik 150 bp, bør også fungere for TF CUT&RUN-eksperimenter. Den medfølgende dataanalysepipeline må imidlertid endres for å imøtekomme enkeltstående lesinger.

Denne CUT&RUN-protokollen og tilhørende dataanalysepipeline ble validert ved å undersøke to TFer, Ndt80 og Efg1, som kontrollerer C. albicans biofilmformasjon. Som vist i figur 4D, er Ndt80 bundet i intergene regioner (fremhevet av de svarte stolpene som indikerer betydelig beriket Ndt80 ChIP-chip loci) oppstrøms EFG1 ORF. Denne intergene regionen oppstrøms EFG1 ble tidligere vist å være svært beriket for Ndt80 binding under biofilmdannelse av ChIP-chip⁴. CUT&RUN-eksperimenter identifiserte imidlertid betydelig flere topper i denne regionen enn ChIP-chip-eksperimenter (10 topper mot 4 topper). Ndt80 DNA-bindende motiver er beriket over alle Ndt80-bundet loci identifisert av CUT&RUN (Supplementary Figure 1), noe som indikerer at de ekstra toppene identifisert av denne metoden sannsynligvis er bona fide Ndt80-bundet nettsteder. En systematisk komparativ analyse indikerte at denne presenterte CUT&RUN-protokollen identifiserte de fleste tidligere kjente bindingshendelser for Ndt80 og Efg1 under^{biofilmformasjonen 4} (figur 5).

Videre ble mange nye TF-bindende hendelser som ikke ble fanget opp i de tidligere publiserte ChIP-chip-eksperimentene identifisert ved hjelp av CUT&RUN (figur 5). Totalt sett er både Ndt80 og Efg1 bundet til loci overlapping med tidligere publiserte ChIP-chip-data og til loci identifisert bare ved hjelp av CUT&RUN-metoden (overlappinger mellom disse CUT&RUN-dataene og tidligere publiserte ChIP-chip-data for Ndt80 og Efg1 er oppsummert i Venn-diagrammene i figur 5). Videre var brøkdelen av lesinger innenfor betydelig kalte topper (FRiP-score) konsekvent høyere i GFP-merkede prøver enn i deres kontroll IgG-prøver (se Supplerende figur 2). Oppsummert viser disse resultatene at CUT&RUN-protokollen som er beskrevet her, er en robust metode som er optimalisert for å undersøke C. albicans TF-DNA-bindende interaksjoner fra lav-overflodsprøver.

Figur 1: Epitop-merking av C. albicans-TFer . (A) Identifisere et TF-gen av interesse (NDT80 i dette tilfellet) og velg en gRNA for å målrette kuttingen av Cas9 (representert av den oransje formen) på 3' enden av ORF. (B) Candida clade-optimalisert eGFP med >50 bp homologi oppstrøms og nedstrøms fra kuttet nettstedet vil gi dDNA å reparere DSB. (C) Bruk koloni-PCR til å screene individuelle kolonier for å bekrefte den tiltenkte integrasjonen. Primere er indikert med røde piler, og amfikaner er betegnet med stiplede bokser. Denne figuren ble opprettet ved hjelp av BioRender.com. Forkortelser: TF = transkripsjonsfaktor; gRNA = guide RNA; ORF = åpen leseramme; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; DSB = dobbeltstrenget pause; US = oppstrøms; DS = nedstrøms. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjematisk oversikt over cut&run eksperimentell protokoll. C. albicans celler samlet fra biofilm eller planktoniske kulturforhold er gjennomsyret for å isolere intakte kjerner. ConA perler er aktivert, og de intakte kjernene er deretter bundet til de aktiverte ConA perler. Antistoffet av interesse legges til perlebundne kjerner og inkuberes ved 4 °C. Deretter tilsettes pAG-MNase og får lov til å binde seg til målantistoffet. Etter tilsetning av CaCl₂ aktiveres pAG-MNase, og målrettet kromatin fordøyelse fortsetter til tillegg av chelaterende reagens for å inaktivere pAG-MNase. Det pAG-MNase-bundne antistoffkomplekset får lov til å spre seg ut av de permeabiliserte kjernene, og det resulterende DNA-et ekstraheres og rengjøres. Sekvenseringsbiblioteker fremstilles fra CUT&RUN-berikede DNA-fragmenter, og de resulterende bibliotekene kjøres deretter på en 10% PAGE gel for å skille og fjerne forurensende adapter dimers før sekvensering. Denne figuren ble opprettet ved hjelp av BioRender.com. Forkortelser: CUT&RUN = spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease; ConA = concanavalin A; PAGE = polyakrylamid gel elektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Skjematisk oversikt over dataanalysesamlebåndet CUT&RUN. Arbeidsflyten starter med å utføre kvalitetskontroller på rå FASTQ-filer ved hjelp av FastQC, etterfulgt av trimming for å fjerne sekvenseringsadaptere. De trimmede avlesningene justeres deretter etter referansegenomet, og de justerte avlesningene filtreres basert på størrelsen for å berike TF-størrelse bindingssignaler (20 bp ≤ justert lese ≤ 120 bp). Størrelsesvalgte lesinger kalibreres deretter mot spike-in Escherichia coli-lesinger , og kalibrerte lesinger brukes til å kalle topper ved hjelp av MACS2. Det <> symbolet er en visuell representasjon som angir at C. albicans leseantall ble kalibrert ved hjelp av E. coli-lesetall for hvert utvalg. Forkortelser: CUT&RUN = spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease; TF = transkripsjonsfaktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Kvalitetskontrolltrinn som er kritiske for vellykkede CUT&RUN-eksperimenter. (A) Celler er farget med fluorescerende cellevegg (blå) og nukleinsyre (grønn) flekker før og etter kjerneisolasjon og visualiseres ved hjelp av et fluorescensmikroskop. (B) CUT&RUN TF-biblioteker analyseres ved hjelp av et kapillært elektroforeseinstrument. Vellykkede CUT&RUN TF-biblioteker (angitt med det grønne merket) er beriket for korte fragmenter som er mindre enn 200 bp. Suboptimale CUT&RUN TF-biblioteker (indikert av den røde "X") viser berikelse for store DNA-fragmenter. (C) 48 CUT&RUN biblioteker samles sammen og analyseres ved hjelp av et kapillært elektroforeseinstrument. Biblioteker av høy kvalitet (angitt med det grønne merket) er fri for adapterdempere (bane 1), mens biblioteker av lav kvalitet (angitt med den røde "X") beholder små mengder adapterdempere (bane 2). (D) Representative IGV-spor fra CUT&RUN-datasett (inkludert Ndt80 IgG-kontrollen, bunnsporet) som viser betydelig berikelse for Ndt80-binding (toppspor) i den intergene regionen oppstrøms EFG1 ORF (Orf19.610). De svarte stolpene representerer betydelig berikede Ndt80 bindingstopper identifisert av tidligere publiserte ChIP-chip-eksperimenter⁴. De blå stolpene representerer betydelig berikede Ndt80 bindingstopper identifisert i CUT&RUN-eksperimentene som presenteres her. Skalastenger = 50 μm (A). Forkortelser: CUT&RUN = spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease; TF = transkripsjonsfaktor; GFP = grønt fluorescerende protein; ORF = åpen leseramme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Evaluering av Ndt80 og Efg1 beriket topper identifisert ved hjelp av den presenterte CUT&RUN-protokollen og dataanalyserørledningen på Candida albicans biofilmer. Venn-diagrammene i den øverste raden illustrerer overlappingsgraden mellom Ndt80- og Efg1-bindingsnettsteder identifisert via CUT&RUN med tidligere publiserte ChIP-chipdata⁴. CUT&RUN-signalene for alle bindingshendelser for Ndt80 og Efg1 vises i den nederste raden som fargede varmekart (rød = høy toppsignal; blå = lavt/ingen toppsignal; farget stolpe indikerer IgG-signal trukket fra GFP-signal); 1000 bp-regioner oppstrøms (-1,0 kb) og nedstrøms (+1,0 kb) vises i varmekartene. Signalintensiteten (dvs. berikelse) som profilplott vises over varmekartene. Tre biologiske replikeringer for Ndt80 og Efg1 ble evaluert for visualisering av CUT&RUN-berikelsen. Forkortelser: ChIP = kromatin immunoprecipitation; CUT&RUN = spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: PCR-reaksjonsmiks og PCR-sykkelforhold for å forsterke universelle A- og unike B-fragmenter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: PCR-reaksjonsblanding og PCR-sykkelforhold for å sy sammen A- og B-fragmenter for å lage C-fragmentet i full lengde. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: PCR-sykkelforhold for å PCR forsterke C-fragmentet i full lengde. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: PCR-reaksjonsmiks og PCR-sykkelforhold for å forsterke donor-DNA GFP-taggen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Plasmid fordøyelsesreaksjonsblanding og reaksjonsbetingelser for plasmid fordøyelsesreaksjoner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: PCR-reaksjonsblanding og PCR-sykkelforhold for koloni-PCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: PCR-sykkelforhold for sluttreparasjonstrinnet i biblioteket som forberedelse til sekvensering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 8: Anbefalinger om adapterfortynning for inngangs-DNA-et for å klargjøre sekvenseringsbiblioteker. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 9: PCR-sykkelforhold for å PCR forsterke det adapter-ligaterte DNA-et. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende figur 1: Ndt80 DNA-bindende sekvensmotivberikelse. Kumulative Ndt80 motivberikelse score for Ndt80-bundet loci identifisert i biofilm ChIP-chip data (mørk blå prikket linje) eller CUT&RUN data (lyseblå prikket linje) sammenlignet med tilfeldig intergenic loci (rød prikket linje). Y-aksen på venstre hånd angir prosentandelen av total loci for hvert datasett som inneholder en tilsvarende kumulativ motivpoengsum på X-aksen. Stiplede linjer angir betydningen av motivpoengberikelsen (-log10 P-verdi, høyrehånds Y-akse) ved hvert punkt på X-aksen, i forhold til den tilfeldige intergene kontrolllocien. Akkumulerte motivpoeng og P-verdier ble bestemt ved hjelp av MochiView²³ (se Materialfortegnelser). Alle Ndt80-bundet loci ble samplet som 500 bp vinduer sentrert under hver topp av Ndt80 binding innenfor ChIP-chip og CUT&RUN datasett og sammenlignet med tilfeldig valgt 500 bp intergenic loci å kontrollere for forskjeller i lengde. Forkortelser: ChIP = kromatin immunoprecipitation; ChIP-chip = kromatin immunoprecipitation etterfulgt av mikroarray; CUT&RUN = spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Brøkdel av lesinger innenfor en toppscore per prøve. Stolpetegning som viser FRiP-poengsummen for hver replikering. FRiP-poengsummer beregnes som antall tilordnede lesninger innenfor en topp delt på totalt antall tilordnede lesinger i et CUT&RUN-utvalg. De forskjellige stolpefargene representerer individuelle biologiske replikeringsprøver, som angitt langs X-aksen. Som forventet er FRiP-skårene for positive GFP-prøver konsekvent høyere enn for negative IgG-prøver. Alle prøver viser akseptable FRiP-terskler (>1%), i henhold til anbefalingene fastsatt av Landt et ^al.20. Forkortelser: FRiP = brøkdel av leseoperasjoner innenfor en topp; CUT&RUN = spalting under mål og frigjøring ved hjelp av kjernease. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Oppskrifter for alle buffere og løsninger som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Bioinformatiske verktøy som kreves for dataanalysepipeline. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Anbefalte blokklistede regioner i C. albicans-genomet . Denne listen over blokklistede loci inneholder hovedsakelig svært repeterende sekvenselementer og regioner som telomeriske repetisjoner og sentromerer som historisk har gitt falske positive resultater i tidligere genom-brede bindende eksperimenter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne protokollen presenterer en omfattende eksperimentell og beregningsrørledning for genom-bred lokalisering av regulatoriske TFer i C. albicans. Den er designet for å være svært tilgjengelig for alle med standard mikrobiologi og molekylærbiologiopplæring. Ved å utnytte de høye dynamiske og lave kravene til prøveinngang i CUT&RUN-analysen og inkludert optimaliseringer for lokalisering av TF-DNA-bindingsinteraksjoner i C. albicans biofilm og planktoniske kulturer, presenterer denne protokollen et kraftig og rimelig alternativ til tradisjonelle ChIP-seq-tilnærminger. Sammenlignet med ChIP-seq, gir CUT&RUN betydelig høyere følsomhet, med en høyere andel sekvenseringsavlesninger kartlagt til bundne topper, er mer egnet til høy gjennomstrømning, krever betydelig lavere inngangscelletall, krever ikke bruk av giftige krysskoblingsmidler, og krever ti ganger færre sekvenseringsavlesninger per prøve for å produsere resultater av høy kvalitet 13,14,17^{, 23,24}. For ytterligere å redusere kostnadene per prøve for denne protokollen, er buffer- og medieoppskrifter inkludert sammen med en detaljert reagensliste for å lette den interne utarbeidelsen av alle nødvendige buffere og medier, samt bulk sourcing av essensielle reagenser. Ettersom C. albicans biofilmdannelse, fenotypisk veksling og commensalisme alle er regulert av komplekse sammenvevde transkripsjonsnettverk²⁶, gir denne robuste, facile og kostnadseffektive CUT&RUN-protokollen et kraftig nytt verktøy for å forstå disse og mange andre cellulære prosesser i dette viktige menneskelige sopppatogenet.

TF-er er ikke så rikelig som histoner eller andre kromatinrelaterte proteiner, noe som skaper en unik utfordring for å undersøke TF-DNA-bindende interaksjoner via CUT&RUN. For å løse denne utfordringen ble det gjort kritiske justeringer og optimaliseringer i standard CUT&RUN eksperimentell protokoll¹³. Ettersom de mest vellykkede CUT&RUN-eksperimentene rettet mot TFer gir en liten mengde DNA som er for fortynnet til å kvantifisere og ofte berikes for fragmenter mindre enn 150 bp ^13,23, ble bibliotekets forberedelsesreaksjonsforhold også optimalisert for å favorisere disse mindre fragmentene²⁷. Selv med dette optimaliseringstrinnet inneholder de resulterende PCR-forsterkede bibliotekene en betydelig andel adapterdempere, som ikke fjernes helt ved hjelp av magnetiske perlebaserte DNA-størrelsesvalgsmetoder. For å løse dette problemet ble et trinn for valg av sidegelstørrelse inkludert for å generere endelige sekvenseringsklare biblioteker som i stor grad er blottet for kortdempere. Dette er et kritisk trinn i protokollen, ettersom fjerning av kortdempere samtidig som du beholder de mindre TF-avledede CUT&RUN-fragmentene, er avgjørende for å oppnå resultater av høy kvalitet.

Videre filtrerer den detaljerte beregningspipeline sekvenseringsdataene for å fokusere på de mindre avlesningene som er avledet fra TF-DNA-bindende interaksjoner i CUT&RUN-analysen. På grunn av disse TF-spesifikke justeringene anbefales ikke denne protokollen for profilering av store kromatinrelaterte komplekser som nukleosomer. Selv om det er teoretisk mulig å tilpasse protokollen til dette formålet ved å følge standardprotokollen for bibliotekforberedelse som følger med det kommersielt tilgjengelige bibliotekforberedelsessettet, må brukeren justere valget av postsekvensstørrelse som er inkludert i beregningsrørledningen. Spesielt i størrelsesfiltreringsdelen i kodefilen cut_n_run_pipeline.sh, må brukerne erstatte den nåværende verdien av "14400" (120 bp * 120 bp) med kvadratet av ønsket fragmentlengde for å gjøre det mulig for analyserørledningen å analysere sekvenseringsresultatene generert for andre typer kromatin-DNA-bindingssamhandlinger.

Et annet viktig trinn i et vellykket CUT&RUN-eksperiment inkluderer å velge optimale dataanalyseparametere for sekvensering etter sekvensering. Mens det meste av beregningsrørledningen er utformet for å være standardisert og anvendelig for studiet av eventuelle regulatoriske TF av interesse i C. albicans, er det to viktige hensyn som brukeren bør vurdere mens han kjører rørledningen. Det første hensynet er om duplikatavlesninger skal inkluderes eller fjernes fra sekvenseringsdataene før identifisering av bundne målområder identifiseres. Siden TFer med lav overflod vanligvis vil gi sekvenseringsdata som inneholder en betydelig prosentandel av lesinger som er avledet fra PCR-duplisering under bibliotekforsterkingstrinnet, kan fjerning av PCR-duplikater ha en betydelig negativ innvirkning på resultatene. Men med svært rikelige TFer eller kromatinrelaterte proteiner representerer PCR-duplikater vanligvis en mindre del av det totale antallet lesninger og fjernes ofte for å undertrykke bakgrunnsstøy i dataene. Til syvende og sist er denne beslutningen om å beholde eller fjerne PCR-duplikater avhengig av TF av interesse og dybden på sekvenseringsdataene som er oppnådd. Dermed genererer rørledningen automatisk uavhengige utdatafiler for data avledet med eller uten PCR-dupliserte lesinger, slik at brukeren kan bestemme hvilke utdatafiler som gir de beste resultatene for hvert eksperiment.

Den andre vurderingen er om man skal identifisere og fjerne problematiske loci som gir betydelig, men likevel svært variabel, berikelse i både eksperimentelle (antistoff mot proteinet av interesse) og negative kontrollprøver (IgG). Peak-calling-algoritmen bruker MACS2 til å identifisere betydelig beriket loci i både eksperimentelle og kontrollprøver og utelukker de som vises i begge. Selv om denne tilnærmingen vanligvis eliminerer mest problematiske loci, fremstår noen ganger som betydelige topper i visse eksperimenter, selv om tidligere erfaring indikerer at de sannsynligvis ikke er sanne positive steder for TF-berikelse. Dermed er et valgfritt filtreringstrinn gitt for å fjerne disse problematiske loci, referert til som "blokklistet" loci. Listen over blokklistede loci inneholder hovedsakelig svært repeterende sekvenselementer og regioner som telomeriske repetisjoner og sentromerer som historisk har gitt falske positive resultater i tidligere genom-brede bindende analyser. Dette er en veldig konservativ liste over loci tildelt som problematisk med høy tillit. Hver bruker bør imidlertid vurdere om dette filteret passer for eksperimentene fra sak til sak. Et potensielt alternativ til IgG negativ kontroll ville være å utføre CUT&RUN mot et kjernefysisk lokalisert protein som ikke binder DNA. Denne tilnærmingen har vist seg å være en ideell kontroll for ChIP-eksperimenter²⁸, og en lignende tilnærming er verdt å vurdere for CUT&RUN.

CUT&RUN har blitt et populært valg for å undersøke protein-DNA interaksjoner i høyere eukaryoter og modellen gjær Saccharomyces cerevisiae. Her har det blitt vellykket tilpasset for å undersøke genomomfattende TF-DNA-bindende interaksjoner i det klinisk relevante sopppatogenet C. albicans. Denne protokollen gir detaljerte metoder for alle nødvendige eksperimentelle og beregningsprosedyrer, fra prosjektering av stammer som uttrykker epitopmerkede TFer, til beregningsanalysen av de resulterende CUT&RUN-sekvenseringsdataene. Samlet sett produserer denne protokollen og den medfølgende dataanalysepipeline robuste TF-DNA-bindingsprofiler, selv når du bruker komplekse multimorfiske populasjoner av celler isolert fra lav-overflod biofilmprøver og gir overlegen datakvalitet til en lavere totalkostnad enn ChIP-seq-metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194