Summary
Mevcut protokol, insan sperminde apoptozis, mitokondriyal membran potansiyeli ve DNA hasarının tek bir sitometre ile ölçülmesine olanak sağlayan pratik bir çözüm sunmaktadır.
Abstract
Konvansiyonel semen parametre analizi, erkek fertilitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, çalışmalar infertil hastaların ~%15'inin konvansiyonel semen parametrelerinde anormallik göstermediğini bulmuştur. İdiyopatik infertiliteyi açıklamak ve ince sperm kusurlarını tespit etmek için ek teknolojilere ihtiyaç vardır. Şu anda, sperm apoptozu, mitokondriyal membran potansiyeli (MMP) ve DNA hasarı dahil olmak üzere sperm fonksiyonunun biyobelirteçleri, sperm fizyolojisini moleküler düzeyde ortaya koymakta ve erkek doğurganlığını tahmin etme yeteneğine sahiptir.
Akış sitometrisi (FCM) teknikleriyle, bu belirteçlerin her biri insan semen örneklerinde hızlı, doğru ve hassas bir şekilde ölçülebilir, ancak zaman maliyetleri önemli ölçüde artar ve tüm biyobelirteçlerin tek bir sitometre ile test edilmesi gerekiyorsa sonuçlar engellenebilir. Bu protokolde, sıvılaştırma için 37 ° C'de toplama ve hemen inkübasyondan sonra, semen örnekleri Annexin V-floresein izotiyosiyanat (FITC) / propidyum iyodür (PI) boyaması kullanılarak sperm apoptozu için daha fazla analiz edildi. MMP, 5,5′,6,6′-tetrakloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilkarbosiyanin iyodür (JC-1) probu ile etiketlendi ve DNA hasarı, akridin turuncu (AO) boyama ile sperm kromatin yapı testi (SCSA) kullanılarak değerlendirildi. Bu nedenle, sperm fonksiyon belirteçlerinin akım sitometrik analizi, infertilite tanısı ve hem tezgahta hem de yatakta sperm fonksiyonunun değerlendirilmesi için pratik ve güvenilir bir araç seti olabilir.
Introduction
Kısırlık bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir ve erkek kısırlığı tüm vakaların %40-50'sine katkıda bulunmaktadır 1,2. Konvansiyonel semen kalitesi analizi erkek fertilite potansiyelinin belirlenmesinde önemli bir rol oynamasına rağmen, infertilitesi olan hastaların yaklaşık %15'inde sperm sayısı, motilite ve morfoloji gibi normal sperm parametreleri bulunmaktadır3. Ayrıca, rutin sperm muayenelerinin tekrarlanabilirliği zayıftır, sperm fonksiyonu hakkında sınırlı bilgi sağlar ve erkek doğurganlığının doğru bir değerlendirmesini yapamaz veya spermin ince kusurlarını yansıtamaz. Sperm fonksiyonunu test etmek için hemizona testi (HZA), sperm penetrasyon testi, hipo-ozmotik şişme testi, antisperm antikor testi gibi birçok teknik geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler zaman alıcıdır ve operatörlerin öznel etkilerine karşı savunmasızdır. Bu nedenle sperm fonksiyon analizi için hızlı ve doğru yöntemler geliştirmek gerekir.
FCM, 1970'lerde geliştirilen, hücre biyolojisi ve tıbbın çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılan hızlı, tek hücreli bir analiz teknolojisidir. FCM, spesifik bir floresan probu4 ile etiketlenmiş spermatozoayı analiz eden sperm fonksiyonunun değerlendirilmesi için sağlam bir araçtır. Spermatozoa, tek veya çok kanallı lazerlerden geçer ve bir lazer ışını tarafından saçılan ışık ve yayılan floresan üretilir. Saçılan ışık, test edilen hücrenin boyutunu ve hücre tanecikliğini veya iç yapısını yansıtan öne doğru saçılan ışığı (FSC) ve yandan saçılan ışığı (SSC) içerir. Bu sinyaller bilgisayar sistemi tarafından toplanır, görüntülenir ve analiz edilir ve sonuç olarak spermatozoadan bir dizi özellik hızlı ve doğru bir şekilde ölçülür. Bu nedenle FCM, sperm analizi alanında giderek artan bir ilgi gören hızlı, objektif, çok boyutlu ve yüksek verimli bir tekniktir. FCM uygulaması, geleneksel yöntemlerdeki eksiklikleri giderebilir ve sperm iç yapısının ve fonksiyonunun tespiti için yeni bir yaklaşım sağlar.
Sperm apoptozu erkek doğurganlığı ile yakından ilişkilidir5. Sperm apoptozunun saptanması, sperm fonksiyonunu moleküler düzeyde değerlendirmek için önemli bir indekstir. FCM, Annexin V-FITC/PI boyaması kullanarak sperm apoptozunu tespit etmek için güvenilir ve hassas bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Temel prensip, fosfatidilserin (PS) apoptozun erken evresinde hücre zarının iç tabakasından dış tabakasına aktarılmasıdır. Annexin V, PS için yüksek bir afiniteye sahip olan birCa2+ bağımlı fosfolipid proteinidir (genellikle FITC tarafından etiketlenir), bu nedenle hücre zarının6 dış yüzeyine maruz kalan PS'yi tespit eder. Nekroz ve apoptoz, Pl boyama ile kombinasyon halinde ayırt edilebilir. Bu nedenle, Annexin V-FITC/PI çift boyama yöntemi, hızlı, basit ve farklı apoptotik sperm hücrelerini tespit etmesi kolay olduğu için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Olgun bir memeli spermi yaklaşık 72-80 mitokondri7 içerir, bu da sperm mitokondrisinintutulmasının biyolojik bir nedenini düşündürür 8. Sperm mitokondrilerinin sperm hareketliliğini ve doğurganlığını sürdürmede önemli roller oynadığı bulunmuştur9. Çeşitli hücre tiplerinde MMP'nin bir göstergesi olarak kullanılabilen JC-1 boyası, sperm mitokondriyal aktivite değerlendirmesi için en popüler florokromlardan biridir10. JC-1, mitokondride potansiyele bağlı olarak biriken katyonik bir boyadır. JC-1, 525 nm'de (yeşil) maksimum floresan emisyonuna sahiptir ve yüksek potansiyele (ΔΨm, 80-100 mV) sahip membranlara bağlandığında J-agregatları11 oluşturur, bu da floresan emisyonunda ~590 nm'ye (turuncu-kırmızı) bir kaymaya neden olur. Sonuç olarak, sperm mitokondriyal depolarizasyonu, kırmızı / yeşil floresan yoğunluk oranındaki bir azalma ile gösterilir ve FCM, insan semen örneklerinde MMP seviyelerini tespit etmek için kullanılabilir.
SCSA metodolojisi Evenson ve ark.12 tarafından icat edilmiştir ve 1.024 × 1.024 kanal ölçeğindebenzersiz çift parametreli verilerle (kırmızı ve yeşil floresan) kesin ve tekrarlanabilir bir test olarak kabul edilir 13. Hasarlı spermde, sperm çekirdeğindeki DNA ve değiştirilmiş proteinler AO ile etiketlenir ve DNA zincirinin kırılmaları kırmızı floresan ile ölçülürken, sağlam çift iplikçikler FCM14'te yeşil floresan yayar. Günümüzde sperm DNA bütünlüğünü tahmin etmek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, SCSA'dan farklı olarak, bu tahliller genellikle emek yoğundur ve erkek kısırlığı tanısı koyma yeteneğinden yoksundur. SCSA test sonuçları, insan DNA'sı hamileliği ve düşüklüğü ile önemli ölçüde ilişkilidir, SCSA'nın insan semen analizinde yararlı olabileceğine dair ikna edici kanıtlar sağlar ve kısırlık klinisyenleri için değerli bir araç olarak hizmet edebilir15.
Kromatin bütünlüğü, MMP ve apoptoz, sperm fonksiyonunun farklı yönlerini yansıtır ve bu nedenle, bu biyobelirteçlerin kombinasyonu, sperm durumu hakkında daha kapsamlı bir fikir verebilir. FCM, insan semen örneklerinde kromatin bütünlüğü, MMP veya apoptozun ayrı ölçümleri için kullanılabilir. FCM'nin maliyeti ve boyaların maliyeti, bu tekniklerin üreme sağlığı için klinik laboratuvarlarda geniş çapta uygulanmasını sınırlamış olsa da, doğurganlık tahmini için değerleri kabul edilmektedir.
Bununla birlikte, deneylerin her biri sperm örneklerinin ön işlemden geçirilmesini gerektirdiğinden ve ön işleme tabi tutulmuş tüm örneklerin mümkün olan en kısa sürede test edilmesi gerektiğinden, tek bir FCM ile bir örnek için üç biyobelirteçin tümünün aynı anda ölçülmesi, bazı deneyler için uzun bir bekleme süresine yol açabilir ve sonuçların güvenilirliğini engelleyebilir. Bunun nedeni, protokolün her üç deneyi de tamamen dikkate alarak uygun şekilde düzenlenmemesi durumunda, bekleme sürecinde spermlerin ek hasar almasıdır. Bu makale, uzun bekleme sürelerinin neden olduğu deney kalitesinden önemli ölçüde ödün vermeden tek bir sitometride üç biyobelirtecin tümünün akıcı ölçümünü gerçekleştiren bir protokol sunmaktadır.
Protocol
NOT: Akış sitometrisi ile sperm fonksiyon hasarı için biyobelirteçlerin saptanması için iş akışı, (1) hücre hazırlığı, (2) floresan reaktiflerle boyama ve (3) akış sitometrik analizi ve veri yorumlamasını içerir (Şekil 1). Protokol, Ordu Tıp Üniversitesi Etik Kurullarının yönergelerini takip eder (1.0/2013.4-12).
1. Hücre hazırlığı
- İnsan spermi örneklerini plastik klinik numune kavanozlarında mastürbasyon yoluyla, tercihen 3-5 günlük yoksunluktan sonra alın.
- Semen örneklerini hemen 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin ve örnekleri tamamen sıvılaştırın (1 saate kadar).
2. Bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) kullanılarak sayılan sperm hücreleri
- Sıvılaştırılmış meni örneklerini iyice karıştırın.
- Bir sperm sayma odasına 10 μL meni ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Sperm Sınıfı Analizöründeki slaytları tarayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve sperm konsantrasyonunun tahmini için en az altı alan ve 400 spermatozoa sayın.
NOT: Sperm apoptozu ve MMP analizi için semen örnekleri taze olmalı, dondurulmamalıdır.
3. Sperm hücrelerinin boyanması
- Annexin V-FITC/PI boyama kullanılarak sperm apoptozunun saptanması
- 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1 ×10 6 sperm hücresi ekleyin.
- Hücreleri 500 μL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Sperm hücresi süspansiyonunu 7 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Sperm hücrelerini 200 μL 1x Bağlayıcı Tampon içinde yeniden süspanse edin.
- 2 μL FITC Annexin V ve 2 μL PI ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Hücreleri nazikçe girdap haline getirin, karanlıkta oda sıcaklığında (25 °C) 15 dakika inkübe edin ve analiz için hemen akış sitometresine yerleştirin.
- JC-1 probu kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin analizi
- 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2 × 10,6 sperm hücresi ekleyin ve 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Sperm hücresi süspansiyonunu 1 mL JC-1 çalışma solüsyonunda yeniden süspanse edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Hücreleri nazikçe vorteksleyin ve karanlıkta 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Süspansiyonu 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Pelet, her biri 5 dakika boyunca 600 × g hızında 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Boyalı sperm hücrelerini akış sitometresi tüplerinde 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve tüpleri analiz için hemen akış sitometresine yerleştirin.
- Pozitif kontrol olarak karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) kullanın. Sperm hücrelerini (daha önce adım 3.2.1'de açıklandığı gibi) 1 mL CCCP çalışma solüsyonunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin ve hücreleri hafifçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Süspansiyonu 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. 3.2.2-3.2.6 adımlarını tekrarlayın.
- Sperm kromatin yapısı testi
- Bir kriyotüpe sıvılaştırılmış ham spermin (0.25 mL) bir alikotunu yerleştirin ve semen örneklerini SCSA'ya hazır olana kadar hemen sıvı nitrojen (-196 °C) içinde dondurun.
- Semen örneklerini 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün ve TNE tamponu ile seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın) 1-2 × 106 hücre/mL konsantrasyona kadar.
- Seyreltilmiş numunenin 200 μL'sini bir akış sitometresi test tüpüne ekleyin ve 30 saniye boyunca 400 μL asit çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile karıştırın.
- Numuneleri 1.2 mL AO boyama solüsyonu ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve analiz için hemen akış sitometresine yerleştirin.
- Akış sitometresi kurulumu ve kalibrasyonları için dahili standart olarak bir referans numune kullanın. Referans numuneyi 4 °C TNE tamponu ile 1-2 × 106 hücre/mL konsantrasyona seyreltin. 3.3.1-3.3.4 adımlarını tekrarlayın.
NOTLAR: Tüm çözeltiler ve tamponlar 4 °C'de saklanır. (1) Ani dondurmadan önce meni seyreltilmemelidir. Ham semen örnekleri çözülür ve akım sitometrisi ölçümleri sırasında TNE tamponu ile seyreltilmelidir. (2) Kısırlık klinikleri için, ~ 0.25 mL çiğ meni, ultra soğuk bir dondurucuda veya bir LN2 tankında hızlı dondurulmalıdır. Bu donmuş alikotlar daha sonra kuru buz üzerinde veya bir LN2 kuru göndericide bir SCSA teşhis laboratuvarına gönderilebilir. (3) DNA bütünlüğünün heterojenliğini gösteren bir insan ejakülat örneği (örneğin, %15 DNA parçalanma indeksi [DFI]) dahili bir standart referans olarak kullanılmıştır.
4. Akış sitometresi kurulumu
NOT: Akış sitometresini başlatmadan önce, analitik performansı doğrulamak için cihazın sistem kontrolü yapılmalıdır. Tüm denetimler tamamlandıktan ve geçtikten sonra örnekleri çalıştırın.
- Akış sitometresi yazılımını açın ve sitometreyi başlatın.
- Örnek verileri toplayın.
- İlk olarak, akış sitometresine bir kontrol örneği yükleyin ve veri toplamayı başlatmak için ÇALIŞTIR'a tıklayın (gerekirse ayarları yapın). Cihazın numuneyi aspire etmeye başlamasını bekleyin ve algılanan olayların gerçek zamanlı bir önizlemesini sağlayın.
NOT: Kontrol örneği: sperm apoptozu için negatif bir kontrol (boyanmamış sperm hücreleri); MMP için pozitif bir kontrol (CCCP ile tedavi edilmiş hücreler); SCSA için bir referans örneği. - Verileri görüntülemek için nokta grafikleri oluşturun ve x/y ekseni parametrelerini (FSC, SSC gibi) seçin ve verilerin görüntülendiğini belirtmek için doğrusal. Analiz için sperm popülasyonunu tanımlamak için çokgen bir kapı seçin ve uygulayın, böylece cihaz tespit edilen olayları gerçek zamanlı olarak çizer.
- Bölgedeki sperm olaylarını analiz edin.
- Sperm apoptozu için FL1'i x ekseni ve FL2'yi x ekseni olarak ayarlayın. Canlı, apoptotik veya nekrotik hücreleri izole etmek için, sperm popülasyonlarını dört spesifik popülasyona indirgemek için kadran kapısına dokunun ve sürükleyin.
- MMP için, FL1'i x ekseni ve FL2'yi y ekseni olarak ayarlayın. Sperm popülasyonlarını iki spesifik popülasyona indirgemek için çokgen bir kapı oluşturun.
- SCSA için, FL4'ü x ekseni (kırmızı floresan, 125/1,024 akış sitometri kanalları) ve FL1'i y ekseni (yeşil floresan, 475/1,024 akış sitometri kanalları) olarak ayarlayın. Hücresel kalıntı sinyallerini dışlamak için kapıları 45°'lik bir açıyla çizin.
- Veri toplamanın ne zaman durdurulacağını belirtmek için bir çalışma sınırı ayarlayın. Sperm apoptozu, MMP ve SCSA analizleri için her numune için toplam 10.000 sperm hücresi hesaplayın.
- Hücre numaralarına bağlı olarak akışkan hızını (yavaş, orta ve hızlı veya özel bir akışkan hızı) ayarlayın.
NOTLAR: SCSA analizi için, sperm konsantrasyonlarını belirlemek için donmuş ham numuneyi çözün ve FCM'de çalıştırın. Akış hızı >250/s ise, numuneyi doğru akış hızına seyreltin. Tüm numuneleri bağımsız olarak iki kez ölçün ve ortalama değerleri hesaplayın. Cihazın günlük standardizasyonunu ve stabilitesini sağlamak için her 10-15 numune ölçüldüğünde bir referans numune test edildi. - Hücre örneklerinden birikinti ve gürültüyü ortadan kaldırmak için eşiği ayarlayın. Denemedeki tüm örnekler için bu ayarları uygulayın.
- Gerekirse, floresan yayılmasını düzeltmek için renk telafisini ayarlayın.
- Numuneleri akış sitometresine yüklemeden önce nazikçe geri pipetleyin, numuneyi adlandırın ve numuneleri çalıştırın.
- Tüm örnekler çalıştırıldıktan sonra, daha fazla yazılım analizi için örnek verileri bir dosya adı vererek FCS dosyaları olarak kaydedin. Geçerli denemenin iş şablonunu gelecekteki çalıştırmalarda almak üzere kaydedin (isteğe bağlı).
- İlk olarak, akış sitometresine bir kontrol örneği yükleyin ve veri toplamayı başlatmak için ÇALIŞTIR'a tıklayın (gerekirse ayarları yapın). Cihazın numuneyi aspire etmeye başlamasını bekleyin ve algılanan olayların gerçek zamanlı bir önizlemesini sağlayın.
5. Veri analizi
- Verileri akış sitometresi için veri analiz yazılımına aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Çalışma alanındaki ilk örneğe çift tıklayın. FSC ve SSC parametreleri boyunca olayların bir grafiğini gösteren bir Grafik penceresi açılana kadar bekleyin. Kapının içinde yer alan sperm popülasyonunu izole eden ve ana olay kümesinden bir 'çocuk' popülasyon üreten bir kapı oluşturun.
- Kapılı alana çift tıklayın ve yalnızca sperm olaylarını içeren yeni bir Grafik penceresi açın. Floresan kanalını seçmek için x ve y ekseni parametrelerini ayarlayın.
- Geçit aracını seçin. Kapıların görünmesini sağlamak için grafiğin içine tıklayın, böylece oluşturulan kapılar farklı hücre popülasyonlarını izole eder.
- Vurgulanan satırlardan herhangi birine sağ tıklayın (veya control tuşuna basıp tıklayın) ve Analizi gruba kopyala'yı seçin. Geçit ağacını grup içindeki tüm örneklere uygulayın.
- Veri tablosunu kaydedin ve dışa aktarın.
Representative Results
Şekil 2, Annexin V-FITC/PI boyaması kullanılarak sperm apoptozunun ölçümünü göstermektedir. FL1 kanalında FITC sinyali (yeşil floresan) ölçüldü ve FL2 kanalında PI sinyali (kırmızı floresan) ölçüldü. Annexin V / PI iki değişkenli analizinde, kadran yapıcılar dört farklı sperm popülasyonu tanımladı. Sonuçlar, Annexin V-/PI− sperm (canlı veya canlı hücreler), Annexin V+/PI− sperm (erken apoptotik hücreler veya apoptotik hücreler), Annexin V+/PI+ sperm (geç apoptotik hücreler) ve Annexin V−/PI+ sperm (nekrotik hücreler)16,17 yüzdeleri olarak ifade edildi (Şekil 2B). Kompanzasyon ve kadranları ayarlamak için negatif bir kontrol (boyanmamış sperm hücreleri) de kullanıldı (Şekil 2A).
Şekil 3 , insan sperminde JC-1 probu kullanılarak MMP ölçümünü göstermektedir. MMP %, sitogram analiz edilerek turuncu-kırmızı/(yeşil + turuncu-kırmızı) floresan oranı olarak sunulur. Kaliteli bir semen örneği genellikle yüksek turuncu-kırmızı floresan ve düşük yeşil floresan (aktif mitokondri, sol üst kadran) gösterir (Şekil 3A). Tersine, düşük kaliteli bir semen örneği, muhtemelen mitokondriyal bozulmaya bağlı olarak genellikle düşük turuncu-kırmızı floresan ve yüksek yeşil floresan (aktif olmayan mitokondri, sağ alt kadran) gösterir (Şekil 3B).
Şekil 4, SCSA13,14 verilerini göstermektedir. Bu tipik SCSA sitogramları iki ayrı örnekten elde edildi. Numune A doğurgan bir erkekten, örnek B ise kısır bir erkekten geldi. Akış sitometrik verilerinin analizi FlowJo yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sitogramlar, SCSA verilerinin her bir bileşeninin kaynağını gösterir. X ekseni (1.024 dereceli kırmızı floresan ile kırmızı floresan) parçalanmış DNA'yı gösterir; y ekseni (1.024 dereceli yeşil floresan) doğal DNA boyanabilirliğini gösterir. y = 750'deki noktalı çizgi normal spermin sınırını temsil eder. Bu y = 750 çizgisinin üzerinde, olgunlaşmamış sperm olarak belirlenen, kısmen yoğunlaştırılmamış kromatinli spermler bulunur.
Şekil 1: Akış sitometrisi ile sperm fonksiyon hasarı için biyobelirteçlerin tespiti için iş akışı. Semen örnekleri alındı ve protokol adımı 1'de tarif edildiği gibi ön işleme tabi tutuldu. (1) Hücre hazırlama, (2) floresan reaktiflerle boyama ve (3) akış sitometrik analizi ve veri yorumlama. Kısaltmalar: MMP = mitokondriyal membran potansiyeli; SCSA = sperm kromatin yapısı tayini; PBS = fosfat tamponlu salin; AO = akridin portakalı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Annexin V-FITC/PI boyaması kullanılarak sperm apoptozunun temsili sonuçları. Sol alt kadranda Annexin V-/PI− spermi (canlı veya canlı hücreler), sağ alt kadranda Annexin V+/PI− spermi (erken apoptotik hücreler veya apoptotik hücreler), sağ üst kadranda Annexin V+/PI+ spermi (geç apoptotik hücreler) ve sol üst kadranda Annexin V−/PI+ spermi (nekrotik hücreler) bulunur. (A) Negatif kontrol (boyanmamış sperm hücreleri); (B) sperm apoptozlu bir örnek. Kısaltmalar: FITC = floresein izotiyosiyanat; PI = propidyum iyodür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: JC-1 probu kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü . (A) Yüksek MMP'ye sahip sperm alt popülasyonu. (B) Düşük MMP'li sperm alt popülasyonu. FL1-A ve FL2-A'yı sırasıyla x ekseni (yeşil floresan) ve y ekseni (turuncu-kırmızı floresan) olarak ayarlayın. Kısaltmalar: MMP = mitokondriyal membran potansiyeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sperm kromatin yapısı testi kullanılarak insan sperminde DNA hasarının tespit edilmesi. (A) Normal kromatin yapısına sahip bir semen örneği. (B) Anormal kromatin yapısına sahip yüksek oranda spermatozoa içeren bir semen örneği. FlowJo yazılımı, 1) normal sperm, 2) HDS sperm, 3) DFI spermi ve 4) hücre kalıntısı olarak tanımlanan hücre popülasyonlarının etrafında bilgisayar kapıları yapmak için kullanıldı ve HDS ve DFI sperm yüzdeleri hesaplandı. Kısaltma: SCSA = sperm kromatin yapısı testi; HDS = yüksek DNA boyanabilirliği; DFI = DNA parçalanma indeksi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Kromatin bütünlüğü, MMP ve insan spermatozoasının apoptozu, üreme sonuçlarının değerli belirleyicileri olarak bulunmuştur. İnsan sperminin incelenmesi ve işlenmesi için en son yayınlanan DSÖ laboratuvar kılavuzu (altıncı baskı), bu göstergelerin bazılarını (kromatin bütünlüğü ve apoptoz) sperm sayısı18 gibi rutin parametrelerin temel incelemesinin ötesinde genişletilmiş incelemeler olarak vurguladı. Son yayınlar ayrıca, bu göstergelerin harici tehlikeli maruziyetlere verilen yanıtın daha hassas belirteçleri olabileceğini ve üreme hasarının daha erken bir aşamada tanımlanması için potansiyellerini gösterdiğini göstermektedir19,20. Bu göstergelerin rutin muayenelerle birleştirilmesi, sperm disfonksiyonunun profili ve popülasyondaki erkek üreme hasarının karmaşıklığı hakkında daha kapsamlı bir anlayış sağlayabilir.
FCM ile sperm analizinin başarısını önemli ölçüde belirleyen birkaç önemli konu vardır. İlk olarak, sperm MMP ve apoptoz ölçümü, meni sıvılaştırıldıktan sonra hemen muayene gerektirir. Zaman maliyetini en aza indirmek için, iki teknisyen MMP'nin ön işleminden ve bir numunenin apoptoz analizinden ayrı ayrı sorumlu olabilir. Apoptozun ön tedavisi daha basit olduğundan, MMP analizinden daha hızlı bir şekilde akış sitometrik basamağına geçecektir. SCSA analizi için, taze semen örnekleri, sıvılaştırmadan sonra mevcut olduğunda hemen dondurularak saklanmalıdır. Sperm örnekleri daha sonra nispeten uzun bir süre sıvı nitrojen içinde saklanabilir ve acil incelemeye ihtiyaç duymaz.
Buna göre, deneyin saha içi zaman maliyeti, MMP analizinin süresi artı sperm analizinin akış-sitometrik adımı olan 40 dakikaya sıkıştırılabilir. İkinci olarak, akış sitometrik platformundaki geçitin kurulumuna her numune grubu için ayrı ayrı karar verilmelidir. Dağılım grafiğinde berrak hücre alt gruplarına sahip sperm örnekleri, geçit alanını çizmek için referans olarak seçilebilir. Üçüncüsü, bu deneyin göstergeleri için yaygın olarak kabul edilen klinik referans değerleri olmadığından, geçmiş sonuçlar kalite kontrol için önemli bir araç olarak kullanılabilir. Her ölçüm grubunda, özellikle SCSA ve MMP için pozitif ve negatif kontrollerin ayarlanması da teşvik edilir.
Burada verilen sperm analizinin temsili sonuçları bir Accuri C6 kullanılarak elde edilir. Bununla birlikte, teknik küçük değişikliklerle diğer ticari platformlara uygulanabilir. Genellikle, tüm göstergelerin ölçüm gereksinimini karşılamak için toplam 5 × 106 sperm hücresine ihtiyaç duyulur. Bir numunenin sperm konsantrasyonu ortalama seviyeden çok daha düşükse, meni hacmine olan ihtiyaç artacaktır.
Rutin sperm parametrelerine benzer şekilde, insan spermatozoasının kromatin bütünlüğünde, MMP'sinde ve apoptozunda da gözle görülür birey içi varyasyon vardır21. Buna göre, farklı zamanlarda toplanan örneklerin çoklu testleri, sperm fonksiyon hasar seviyesinin daha doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlayabilir. Flow sitometrik analiz için sperm örneklemesinden önce önerilen bir yoksunluk süresi olmamasına rağmen, DSÖ tarafından rutin sperm analizi için önerilen 2-7 günlük boşalma perhizi benimsenebilir. Sonuçların laboratuvarlar arasında ve aynı kişilerden toplanan farklı numuneler arasında karşılaştırılabilirliğini artırmaya yardımcı olabilir.
Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, test edilen üç biyobelirteçten ikisinin - apoptoz ve mitokondriyal membran potansiyeli - taze semen örnekleri gerektirmesidir. Bu, uygulamalarını laboratuvara semen örnekleri sağlayabilecek erkeklerle sınırlayabilir. DNA hasarı testi (SCSA) için, akış sitometresini kalibre etmek için deneyden önce referans numuneler hazırlanmalıdır. Mevcut protokolün uygulanması, laboratuvarda bir FCM cihazı gerektirmektedir ve bu, birçok klinik laboratuvar için hala önemli bir zorluktur, ancak bazı bölgelerde üçüncü taraf bir hizmetle işbirliği alternatif bir seçim olabilir.
Ek olarak, boyaların ve diğer reaktiflerin masrafı da muayeneye ihtiyaç duyabilecek erkekler için finansal bir faktördür. Son olarak, biyobelirteçleri incelemek için FCM'nin farklı markaları veya versiyonları kullanılıyorsa, protokolün değiştirilmesi gerekebilir. Özetle, bu makale, tek bir akış sitometri makinesi ile insan spermatozoa hasarının üç biyobelirtecini tahmin etmek için pratik bir yaklaşım sunmaktadır. Bu, erkek üreme sağlığı hakkında değerli bilgiler sağlayabilir ve rutin sperm muayenesini tamamlayabilir.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Tüm saha çalışanlarına yardımları için ve görüşmecilere işbirlikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P.
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022).
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
