Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة غير قائمة على المستحلب لتصنيع الهلام الدقيق الشيتوزان-جينيبين. يمكن التحكم بدقة في حجم هذه المواد الهلامية الدقيقة ، ويمكن أن تظهر تورما يعتمد على درجة الحموضة ، وتتحلل في الجسم الحي ، ويتم تحميلها بجزيئات علاجية تطلق بمرور الوقت بطريقة مستدامة ، مما يجعلها ذات صلة كبيرة بتطبيقات هندسة الأنسجة.
Abstract
تعتبر الهلاميات الدقيقة الشيتوزية ذات أهمية كبيرة في هندسة الأنسجة بسبب مجموعة واسعة من التطبيقات والتكلفة المنخفضة والمناعة. ومع ذلك ، عادة ما يتم تصنيع microgels الشيتوزان باستخدام طرق المستحلب التي تتطلب شطف المذيبات العضوية ، والتي تكون سامة وضارة بالبيئة. يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة وغير سامة للخلايا وغير قائمة على المستحلب لتصنيع المواد الهلامية الدقيقة من الشيتوزان - جينيبين دون الحاجة إلى شطف المذيبات العضوية. يمكن تصنيع المواد الهلامية الدقيقة الموصوفة هنا مع التحكم الدقيق في الحجم. إنها تظهر إطلاقا مستداما للجزيئات الحيوية ، مما يجعلها ذات صلة وثيقة بهندسة الأنسجة والمواد الحيوية والطب التجديدي. يتم ربط الشيتوزان مع genipin لتشكيل شبكة هيدروجيل ، ثم يتم تمريرها عبر مرشح حقنة لإنتاج microgels. يمكن ترشيح المواد الهلامية الدقيقة لإنشاء مجموعة من الأحجام ، وتظهر تورما يعتمد على درجة الحموضة وتتحلل بمرور الوقت إنزيميا. تم استخدام هذه الهلاميات الدقيقة في نموذج إصابة صفيحة نمو الفئران وثبت أنها تعزز زيادة إصلاح أنسجة الغضروف وتظهر تدهورا كاملا في 28 يوما في الجسم الحي. نظرا لتكلفتها المنخفضة وراحتها العالية وسهولة تصنيعها بمواد متوافقة مع الخلايا ، تقدم هذه الهلاميات الدقيقة الشيتوزان تقنية مثيرة وفريدة من نوعها في هندسة الأنسجة.
Introduction
صفيحة النمو ، والمعروفة أيضا باسم physis ، هي بنية الغضروف الموجودة في نهاية العظام الطويلة التي تتوسط النمو عند الأطفال. إذا أصيبت صفيحة النمو ، يمكن أن تتشكل أنسجة الإصلاح المعروفة باسم "الشريط العظمي" ، مما يقطع النمو الطبيعي ويمكن أن يسبب عيوب النمو أو التشوهات الزاوية. أظهرت البيانات الوبائية أن 15٪ -30٪ من جميع إصابات الهيكل العظمي في مرحلة الطفولة مرتبطة بصفيحة النمو. يحدث تكوين الشريط العظمي في ما يصل إلى 30٪ من هذه الإصابات ، مما يجعل إصابات صفيحة النمو والعلاج المرتبط بها مشكلة سريرية مهمة1،2،3،4. عندما يحدث تكوين الشريط العظمي ، فإن طريقة العلاج الأكثر شيوعا تتضمن استئصال الشريط العظمي وإدخال مادة متداخلة ، مثل السيليكون أو الأنسجة الدهنية5. ومع ذلك ، فإن المرضى الذين يخضعون لجراحة استئصال الشريط العظمي غالبا ما يكون لديهم تشخيص ضعيف للشفاء التام ، حيث لا يوجد حاليا علاج يمكنه إصلاح صفيحة النمو المصابة بشكل كامل 6,7,8. في ضوء أوجه القصور هذه ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات فعالة لعلاج إصابات صفيحة النمو ، سواء في منع تكوين شريط عظمي أو تجديد أنسجة غضروف physeal صحية.
اكتسبت الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل ، أو microgels ، اهتماما مؤخرا كسقالات قابلة للحقن يمكن أن توفر إطلاقا مستداما للعلاجات9. نظرا لقابليتها العالية للضبط والتوافق الحيوي ، فإن microgels مناسبة تماما للعامل النشط بيولوجيا أو تغليف الخلايا. يمكن تصنيع Microgels من مواد مختلفة ، تتراوح من البوليمرات الاصطناعية ، مثل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، إلى البوليمرات الطبيعية مثل الجينات أو الشيتوزان10،11،12. وقد ثبت أن الشيتوزان له العديد من الآثار المفيدة لهندسة الأنسجة، مثل قدرته على زعزعة استقرار الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام، وبالتالي تقديم نشاط مضاد للميكروبات متأصل1 3,14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الشيتوزان فعال من حيث التكلفة ، وتفاعلي مع الخلايا ، ويمكن تعديله بسهولة باستخدام هيكله المحتوي على الأمين. تعد المواد الهلامية الدقيقة القائمة على الشيتوزان باستراتيجية المواد الحيوية لتوصيل الأدوية وإشارات المواد التي يمكن أن تعزز تجديد الأنسجة مع منع العدوى البكتيرية. ومع ذلك ، غالبا ما يتم تصنيع الهلام الدقيق الشيتوزان بمجموعة واسعة من التقنيات التي تتطلب معدات خاصة أو تقنيات مستحلب أو شطف مذيبات سامة للخلايا. على سبيل المثال ، قامت بعض الدراسات بتصنيع الهلام الدقيق للشيتوسان بطرق قائمة على المستحلب ، لكن هذه البروتوكولات تتطلب شطف المذيبات والروابط المتقاطعة السامة للخلايا ، مما قد ينفي ترجمتها إلى الإعدادات السريرية15,16. وقد استخدمت دراسات أخرى الموائع الدقيقة أو أساليب الرش الكهربائي لتصنيع الهلام الدقيق الشيتوزان ، والتي تتطلب معدات خاصة ، وإعداد ، وتدريب17،18. عادة ما تصنع الهلاميات الدقيقة الشيتوزانية أيضا من خلال عملية قطرة من الوصلة المتقاطعة إلى محلول الشيتوزان. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطريقة بشكل كبير على لزوجة المحلول وتركيز البوليمر ومعدل التدفق ، مما يجعل من الصعب التحكم في حجم وتشتت المواد الهلامية الدقيقة19,20. وعلى العكس من ذلك، فإن طريقة تصنيع الميكروجيل الموصوفة هنا لا تتطلب أي معدات متخصصة أو شطف مذيبات، مما يجعل هذه الهلاميات الدقيقة قابلة للتصنيع في أي مختبر أو مكان تقريبا. لذلك ، تمثل هذه المواد الهلامية الدقيقة مواد حيوية ذات صلة عالية لوسيلة توصيل أدوية سريعة وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الإنتاج للعديد من التطبيقات.
من خلال تعديل تكوين الميكروجيل وخصائصه المادية ، يمكن للباحثين الحصول على تحكم دقيق في البيئة الدقيقة الخلوية ، وبالتالي توجيه سلوك الخلية بطريقة تعتمد على المواد. يمكن استخدام Microgels بمفردها أو دمجها مع أنظمة المواد الحيوية السائبة لنقل وظائف محددة ، مثل الإطلاق المطول للعوامل النشطة بيولوجيا أو الإشارات الخاصة الدقيقة للخلايا الأصلية أو الخارجية. ظهرت المواد الحيوية والمواد الهلامية الدقيقة كطرق علاج جذابة لإصابات صفائح النمو. تم تكريس جهد كبير لتطوير الجينات والمواد الحيوية القائمة على الشيتوزان لعلاج إصابات صفائح النمو21،22،23،24،25. نظرا للطبيعة الزمنية الديناميكية لتعظم صفيحة النمو واستطالة العظام ، فإن آلية تكوين الشريط العظمي ليست مفهومة تماما. لذلك ، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لتوضيح آليات التعظم الغضروفي الداخلي وتكوين الشريط العظمي بشكل أفضل ، كما هو الحال في الفئران والأرانب والأغنام26،27،28. أحد هذه النماذج هو نموذج إصابة صفيحة نمو الفئران ، والذي يستخدم عيب ثقب الحفر في ساق الفئران لإنتاج شريط عظمي بطريقة يمكن التنبؤ بها وقابلة للتكرار ويحاكي الإصابات البشرية عبر جميع المناطق الثلاث من صفيحة النمو29,30. تم اختبار العديد من الاستراتيجيات القائمة على المواد الحيوية لعلاج إصابات صفائح النمو باستخدام هذا النموذج. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير طريقتين مختلفتين لتصنيع الهلام الدقيق الشيتوزان ، والذي يمكن استخدامه كنظام للمواد الحيوية القابلة للحقن التي تطلق العلاجات بطريقة مستدامة10,31. تم استخدام هذه الهلاميات الدقيقة في نموذج إصابة الفئران الفيزيائية ، وأظهرت تجديدا محكما للغضروف31 عند إطلاق SDF-1a و TGF-b3. تصف التقنيات المقدمة في هذا البروتوكول الطرق التي تم تطويرها لتصنيع هذه الهلاميات الدقيقة الشيتوزان ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في مجموعة واسعة من تطبيقات هندسة الأنسجة. على سبيل المثال ، استخدمت الدراسات الحديثة الهلاميات الدقيقة الشيتوزان المستجيبة للحرارة أو الماجنتو لتطبيقات توصيل أدوية الأورام الخاضعة للرقابة32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة جامعة كولورادو دنفر المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام ذكور الفئران Sprague-Dawley البالغة من العمر 6 أسابيع لهذه الدراسة. تم إنشاء نموذج إصابة صفيحة نمو الفئران بعد تقرير نشر سابقا30.
1. إعداد بوليمر الشيتوزان
- الحصول على الشيتوزان منخفض الوزن الجزيئي (LMW) المنقى والمجمد من المصادر المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
- أضف 495 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) وقضيب تحريك إلى كوب سعة 1 لتر. أضف 5 غرام من الشيتوزان (الخطوة 1.1) واخلطها جيدا.
ملاحظة: الشيتوزان قابل للذوبان بشكل ضئيل فقط في محلول مائي عند درجة الحموضة الفسيولوجية ، لذلك لن يذوب الشيتوزان بسهولة في هذه الخطوة. - أضف 5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى محلول الشيتوزان المحضر أعلاه.
- يحرك المزيج المغطى عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة مع وضع الكأس في حمام مائي عند 50 درجة مئوية.
- باستخدام قارورة وقمع Büchner ، قم بتصفية محلول الشيتوزان من خلال تقليل أحجام ورق الترشيح: 22 ميكرومتر و 8 ميكرومتر و 2.7 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- أضف محلول الشيتوزان المصفى إلى أنابيب غسيل الكلى السليلوز (انظر جدول المواد) واتركه في ddH 2 O في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أيام ، معتغيير ddH2O كل يوم.
ملاحظة: استخدم ماء DDH2O فائق النقاء للتغيير الأخير. - انقل محلول الشيتوزان المشوه إلى كوب واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 باستخدام 1 M NaOH.
- Aliquot الشيتوزان في أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 4000 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بصب السوبرناتانت على تيار النفايات وأعد تعليق الشيتوزان في ddH2O ، مكررا 2x.
- تجميد ومن ثم تجميد بيليه الشيتوزان.
- كل يوم ، قم بإزالة المنتج المجفف بالتجميد وتسجيل الكتلة.
ملاحظة: عندما لا تتغير كتلة المنتج المجفف بالتجميد ، يتم تجفيف المنتج بالكامل ويمكن تخزينه عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
- كل يوم ، قم بإزالة المنتج المجفف بالتجميد وتسجيل الكتلة.
2. تصنيع هيدروجيل الشيتوزان
- أضف 2 مل من حمض الخليك بنسبة 6٪ و 120 ملغ من الشيتوزان النقي (الخطوة 1) إلى حقنة Luer-lock سعة 10 مل لتشكيل محلول شيتوسان 6٪.
- قم بتوصيل حقنة Luer-lock بحقنة أخرى مماثلة باستخدام موصل Luer-lock أنثى وخلط المحلول ذهابا وإيابا لمدة 30 ثانية ، أو حتى يذوب الشيتوزان بالكامل في حمض الخليك.
- قبل الربط المتبادل ، أضف أي عامل علاجي أو نشط بيولوجيا إلى محلول الشيتوزان (إذا لزم الأمر). بالنسبة لهذه الدراسة ، تمت إضافة 200 نانوغرام من SDF-1a و TGF-b3 (انظر جدول المواد) إلى المواد الهلامية الدقيقة.
ملاحظة: SDF-1a و TGF-b3 هي عوامل نشطة بيولوجيا ذات صلة بتجديد أنسجة صفيحة النمو. يعزز SDF-1a هجرة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى موقع العيب ، ويعمل TGF-b3 كعامل غضروفي للحث على تمايز هذه الخلايا الجذعية أسفل السلالة الغضروفية31.
ملاحظة: امزج الشيتوزان مرة أخرى بين المحاقن لدمج العلاج بالكامل. - قم بإعداد 100 مللي متر من محلول الربط المتقاطع للمخزون من genipin (انظر جدول المواد) في الإيثانول بنسبة 100٪.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الجينيبين المحضر (الخطوة 2.4) إلى المحقنة المحتوية على الشيتوزان ، واخلطها مرة أخرى ذهابا وإيابا بين المحاقن لمدة 30 ثانية.
- ابثق الخليط من المحقنة على طبق بتري 35 مم ، وقم بتغطيته بفيلم البارافين ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في جو رطب.
ملاحظة: سيتحول المحلول إلى اللون الأزرق الداكن ، مما يشير إلى حدوث تفاعل الترابط بين الشيتوزان والجينيبين ، مما يؤدي إلى تكوين ميكروجيل الشيتوزان. - قم بتصفية ميكروجيل الشيتوزان المحضر باتباع الخطوات أدناه.
- كسر الهيدروجيل بلطف إلى قطع أصغر باستخدام ملعقة.
ملاحظة: يجب أن تكون القطع صغيرة بما يكفي لنقلها إلى الجزء الخلفي من حقنة 10 مل ، قطرها ~ 1-2 سم. - ضع مرشحا بحجم الشبكة المطلوب في الجزء الخلفي من حقنة نظيفة سعة 10 مل.
ملاحظة: يتراوح نطاق الحجم النموذجي للميكروجيل بين 50-200 ميكرومتر. - انقل قطع الجل المكسورة إلى المحقنة المزودة بالفلتر وأضف 6 مل من ddH2O.
ملاحظة: سوف ينتفخ جل الشيتوزان بشكل كبير في الوسط المائي ، لذلك من المتوقع حدوث تغيير كبير في حجم الجل. - قم بتوصيل المحقنة عبر موصل Luer-lock بحقنة نظيفة أخرى سعة 10 مل.
- أجبر خليط الجل + الماء من خلال المحقنة باستخدام المرشح لإنشاء microgels بقطر أقصى محدد.
- بعد الترشيح الأول ، افتح الجزء الخلفي من المحقنة التي تحتوي على المرشح وقم ببثق الخليط مرة أخرى في هذه المحقنة.
- استبدل الجزء الخلفي من المحقنة وأجبر الخليط على المرور عبر الفلتر مرة أخرى.
- كرر الترشيح 5-6x أو حتى يكون هناك القليل من المقاومة من خلال الفلتر.
- كسر الهيدروجيل بلطف إلى قطع أصغر باستخدام ملعقة.
- شطف وتنقية microgels المصفاة.
- انقل خليط الجل المصفى إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، واجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 20 مل مع ddH2O ، ثم دوامة الخليط لضمان التشتت المتجانس.
- الطرد المركزي للميكروجيل عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وصب المرحلة المائية العليا.
- أعد تعليق المواد الهلامية الدقيقة في 10 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ ، الدوامة ، وضعها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة للتعقيم.
- قم بالطرد المركزي للهلام الدقيق عند 1000 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من الإيثانول ، واشطف 3x باستخدام ddH2O.
3. إعداد microgels للتطبيقات في المختبر أو في الجسم الحي
ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تمت دراسة تجديد الغضروف في إصابات صفيحة النمو في نموذج الفئران. للحصول على التفاصيل، انظر المرجع31.
- أعد تعليق كريات microgel 1: 1 في ddH 2 O.يمكن تخزين Microgels لمدة تصل إلى شهر واحد معلقة في ddH2O عند 4 درجات مئوية. إذا تم استخدام عامل نشط بيولوجيا ، فيجب استخدام microgels على الفور.
- قم بإنشاء موقع الإصابة في الحيوان بعد تقرير منشور مسبقا30.
- اغسل موقع الإصابة بمحلول ملحي واحتفظ بالحيوان دون علاج (لدراسة التحكم) أو حقن الهلام الدقيق الشيتوزان فقط أو الهلام الدقيق المحمل بالعوامل النشطة بيولوجيا (الخطوة 3.2).
- أغلق الجرح في الحيوان وقم بإدارة المسكنات بعد الجراحة30.
- في الأيام 7 أو 28 بعد الجراحة ، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق جرعة زائدة من CO2 ، واستقصاء الأطراف وإجراء علم الأنسجة لتقييم إصلاح الأنسجة في موقع الإصابة31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعتمد التصنيع الناجح للهلام الدقيق للشيتوسان على تفاعل الترابط بين الجينيبين والشيتوزان ، والذي يتضمن على وجه التحديد الأمينات الموجودة على سلاسل بوليمر الشيتوزان. على النقيض من تقنيات تصنيع microgel الأخرى ، لا تتطلب هذه الطريقة مستحلبات أو شطف مذيبات ويمكن إجراؤها بسرعة وسهولة باستخدام معدات غير مكلفة. المؤشر المميز لتصنيع الميكروجيل الناجح هو تغير اللون المميز من الأبيض إلى الأزرق الداكن بعد خلط الشيتوزان والجينيبين. تفاعل الربط بين الجينيبين والمركبات المحتوية على الأمين ، مثل الشيتوزان أو البروتينات الأخرى ، تم تمييزه بشكل جيد في الأدبيات34. باختصار ، تعتبر آلية الربط المتبادل هجوما نوويا من قبل المجموعات الأمينية من الشيتوزان ، حيث يعمل الجينيبين كديالدهيد مع منتجات تكثيف مستقرة35. تعمل السلاسل القصيرة من الجينيبين المستقر والمكثف كجسور متقاطعة بين بوليمرات الشيتوزان. يتسبب تفاعل الربط المتقاطع في تحول المحلول إلى اللون الأزرق الداكن ، على الأرجح بسبب البلمرة التي يسببها الأكسجين الجذري وإزالة الهيدروجين من المركبات الوسيطة ، والتي تتبع تفاعل فتح الحلقة من الهجوم النووي36.
بمجرد تصفية المواد الهلامية الدقيقة وإعادة تعليقها في تخفيف الماء بنسبة 1: 1 ، يمكن استخدامها بسهولة في تطبيقات المواد الحيوية المختلفة. تم نشر العمل مؤخرا باستخدام هذه الهلاميات الدقيقة الخالية من المستحلب لتعزيز تجديد الغضروف في إصابات صفائح النمو. تم تصنيع المواد الهلامية الدقيقة كما هو موضح هنا وإما أن تبقى فارغة أو محملة ب SDF-1a و TGF-b3 ، وهي عوامل نشطة بيولوجيا ذات صلة بتجديد أنسجة صفيحة النمو ، مع SDF-1a التي تعزز هجرة الخلايا الجذعية الوسيطة إلى موقع العيب و TGF-b3 بمثابة عامل غضروفي للحث على تمايز هذه الخلايا الجذعية أسفل السلالة الغضروفية37 ، 38. تم تحديد معدل إطلاق البروتينات كميا في المختبر عبر ELISA ، واستمر إطلاق هذه الجزيئات بمرور الوقت31. بعد ذلك ، تم حقن microgels في إصابة صفيحة النمو في نموذج الفئران في الجسم الحي ، ومنعت microgels المحقونة تكوين شريط عظمي مبكر في الجسم الحي31. يمكن بسهولة استخدام هذه المواد الهلامية الدقيقة الشيتوزانية القابلة للحقن والفعالة من حيث التكلفة وسهلة الإنتاج في العديد من تطبيقات المواد الحيوية.
على الرغم من أن هذه العملية لتصنيع microgel قد تم تحسينها للإعداد والتطبيقات البسيطة ، إلا أنه لا يزال من الممكن أن تنشأ العديد من المشكلات التي يجب على الباحثين وضعها في الاعتبار. الخلط غير الكافي للبوليمر والمكونات المتقاطعة هو السبب الأكثر احتمالا لنتائج مختلفة أثناء التصنيع. يجب خلط الشيتوزان الصلب بقوة بين المحاقن ، ويجب أن يكون محلول الشيتوزان الناتج متجانسا تماما قبل إضافة الوصلة المتقاطعة genipin. إذا لم يكن المحلول متجانسا ، فإن قطع الشيتوزان الصلبة المتبقية في المحلول ستشكل كتلا ، وسيحدث تشابك غير متساو ، مما يمنع الترشيح الفعال ويؤدي إلى هلام دقيق متعدد التشتت بأقطار متفاوتة بشكل كبير. عامل مهم آخر يجب مراعاته أثناء التصنيع هو تجنب التبخر خلال فترة الربط المتبادل ، والتي يجب منعها باستخدام فيلم البارافين أو تقنيات حبس التبخر الأخرى. إذا جف هيدروجيل الشيتوزان ، فلن ينتفخ أثناء شطف الماء ، ولن يرشح من خلال المحقنة. أخيرا ، يجب تعليق المواد الهلامية الدقيقة في الماء الزائد أثناء عملية الترشيح وتخزينها في الماء عند 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام. المواد الهلامية الدقيقة ليست قابلة للبثق أو الحقن ما لم يتم تعليقها في تخفيف الماء بنسبة 1: 1 على الأقل.
يوضح الشكل 1 نظرة عامة واسعة على عملية تصنيع microgel. يتم تصوير نفس العملية مرة أخرى في الشكل 2 ، الذي يعرض صورا للعملية ، مع التركيز على مراحل البروتوكول التي يصعب فهمها من النص وحده. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 2D كيفية إدخال مرشح شبكة سلكية في حقنة 10 مل. بمجرد الجلوس بالكامل على الجزء العلوي من المحقنة ، يسمح مرشح الشبكة السلكية هذا بالترشيح السريع والمريح للهلام الدقيق الشيتوزان دون معدات أو مذيبات متخصصة. وبالمثل ، يوضح الشكل 2E تدفق هلام الشيتوزان المائي من خلال مرشح الشبكة ، وهو أساس تصنيع microgel. تم اقتباس الشكل 3 من منشورنا السابق حول هذه الهلاميات الدقيقة ويوضح سلوك التورم المعتمد على الأس الهيدروجيني والاختلافات في حجم الهلاميات الدقيقة التي تعتمد على حجم مسام مرشح الشبكة. يمكن طلب أحجام شبكية مختلفة من الشركة المصنعة ، مما يسمح بالتحكم المريح في حجم المواد الهلامية الدقيقة. هذا التحكم الدقيق في حجم microgel مهم للغاية عند تصميم أنظمة توصيل الأدوية بمعدلات إطلاق حمل علاجي محددة جيدا. أظهرت الأبحاث السابقة على microgels أيضا أنها تتحلل بشكل كبير في وجود الليزوزيم في 2-4 أسابيع31. وأخيرا، يوضح الشكل 4 صور علم الأنسجة31 في نموذج إصابة صفيحة نمو الفئران المعالج بالهلاميات الدقيقة الشيتوزانية المحملة ب SDF-1a و TGF-b3.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على تصنيع الهلام الدقيق الشيتوزان. تم إنشاء الشكل باستخدام biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور فوتوغرافية لعملية تصنيع الهلام الدقيق . (أ) محلول الشيتوزان في المحاقن المتصلة باستخدام قفل لوير. (ب) قذف هلام الشيتوزان في طبق بتري 35 ملم. (ج) استرجاع هلام الشيتوزان بعد تغيير اللون المتقاطع من الأبيض إلى الأزرق الداكن. (د) منظر من أعلى إلى أسفل داخل المحقنة يظهر غربال الشبكة السلكية المثبت على فوهة المحقنة. (ه) تم ضغط هلام الشيتوزان من خلال مرشح شبكي لإنتاج المواد الهلامية الدقيقة. (F) تم تخزين المواد الهلامية الدقيقة في تخفيف 1: 1 من ddH2O في أنبوب مخروطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: سلوك التورم المعتمد على الأس الهيدروجيني للميكروجيلات . (أ) رسم بياني للتوزيع الطبيعي لقطر فيريت يوضح سلوك تورم الهلاميات الدقيقة استجابة لتغيرات الرقم الهيدروجيني. (ب) صور فلورسنت لجل دقيق تم تصنيعه باستخدام شبكة رقم 200 (الصورة العلوية: <75 ميكروجيل بحجم ميكرومتر) وشبكة رقم 100 (الصورة السفلية: هلاميات صغيرة بحجم 75-150 ميكرومتر). تمت إعادة طباعة الشكل بإذن من المرجع31. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور الأنسجة في نموذج إصابة صفيحة نمو الفئران المعالج بالهلام الدقيق الشيتوزان المحمل ب SDF-1a و TGF-b3. 10x صور نسيجية تظهر أنسجة إصلاح لوحة النمو سليمة (A) و (E) وغير المعالجة (B) و (F) و microgel المعالجة (C) و (G) و microgel + SDF-1a المعالجة (D) و (H) و microgel + TGF-b3 المعالجة (I ) الأطراف. لم يتم علاج أي يوم 7 باستخدام microgel + TGFb3. الهيماتوكسيلين الأزرق الألسيان (ABH) يلطخ العظام باللون البرتقالي إلى الأحمر ، والأنسجة الليفية الوردية ، والغضروف الأزرق. يظهر الميكروجيل كنسيج أحمر داكن يشبه الليف. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. تمت إعادة طباعة الشكل بإذن من المرجع31. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم بحث Microgels على نطاق واسع في السنوات الأخيرة بسبب مستوى عال من التطبيق لأغراض مختلفة ، مثل توصيل الدواء أو تغليف الخلايا9. إن سهولة تصنيع تركيبات المواد الحيوية الدقيقة ذات أهمية كبيرة في هندسة الأنسجة ، لأنها تسمح للباحثين بتطوير استراتيجيات قائمة على الهيدروجيل بحجم ونطاق زمني محددين. ومع ذلك ، فإن معظم طرق تصنيع الهلام الدقيق الشيتوزان تتطلب معدات وكواشف باهظة الثمن أو مستحلبات أو شطف مذيبات سامة للخلايا ، مما يمنع ترجمتها إلى الاستخدام السريري15،16،17،18،19،20. تتفوق هذه المواد الهلامية الدقيقة من حيث ملاءمتها الكبيرة للتصنيع ، ولا تتطلب تقنيات مستحلب أو شطف مذيبات. بالإضافة إلى ذلك ، تحتفظ هذه المواد الهلامية الدقيقة بالخصائص المثالية لبناء مهندس الأنسجة ، مثل التورم المعتمد على الأس الهيدروجيني وتحميل الأدوية ، وسلوك التحلل المضبوط ، والإطلاق المستدام للعلاجات.
الخطوة الأكثر أهمية في تصنيع هذه الهلاميات الدقيقة الشيتوزان هي الترشيح بين المحاقن. تبدأ هذه الهلاميات الدقيقة كهيدروجيل سائب ويتم ترشيحها إلى نطاق حجم معين باستخدام مرشحات شبكة سلكية. بدون التصفية ، فإن قابلية تطبيق microgels ، والخواص الميكانيكية ، وخصائص إطلاق الأدوية ستكون مختلفة بشكل كبير. تسمح خطوة الترشيح بالتحكم الدقيق في حجم المواد الهلامية المائية ، كما أنها تسمح بتصنيع المواد الهلامية الدقيقة عالية الإنتاجية التي تظهر تورما يعتمد على درجة الحموضة وإطلاق مستمر للعلاجات.
أحد القيود المفروضة على هذه العملية هو أن خطوة الترشيح لم تؤد إلى هيدروجيل ذو شكل كروي تماما ، والذي قد يكون عاملا مهما يجب مراعاته لبعض التطبيقات. لهذا السبب ، تم وصف الحجم المميز للهلام الدقيق باستخدام قطر Feret (الشكل 3) ، وهو مفيد لتحديد الجسيمات غير المنتظمة الشكل 39. على الرغم من أن هندسة المواد الهلامية الدقيقة لم تكن كرة مثالية ، إلا أنه كان من السهل التحكم في متوسط حجم الجسيمات بناء على الحجم الشبكي لمرشح المحقنة ، وبالنسبة للعديد من التطبيقات ، فإن وجود جزيئات كروية تماما ليس ضروريا. تم قياس مؤشر تعدد التشتت (PDI) للهلاميات الدقيقة باستخدام النسبة المربعة للانحراف المعياري لقطر فيريت إلى متوسط قطر فيريت الذي تم الحصول عليه من مجموعة كبيرة من الجسيمات (n = 74). تم حساب PDI على أنه 0.076 باستخدام المعادلة
PDI = (ق / د)2
حيث s هو الانحراف المعياري لمتوسط قطر Feret و D هو متوسط قطر Feret40. بسبب الترشيح الذي تم إجراؤه خلال هذه العملية واستخدام قطر Feret للجسيمات غير المنتظمة الشكل ، كان مؤشر تعدد التشتت لهذه الجسيمات منخفضا جدا ، لدرجة أنه يمكن اعتبارها أحادية التشتت.
بالنسبة للبحوث المستقبلية ، يمكن إجراء العديد من التعديلات على هذا البروتوكول لتناسب بشكل أفضل الحاجة البحثية المحددة. على سبيل المثال ، تمت دراسة بروتينين فقط ، SDF1-a و TGF-b3 ، لإطلاقه المتحكم فيه مع هذه المواد الهلامية الدقيقة. وقد أظهرت الأعمال السابقة الإفراج المستمر عن هذه العوامل النشطة بيولوجيا لمدة تصل إلى ~ 30 يوما في المختبر. ومع ذلك ، يمكن أيضا استكشاف العلاجات الأخرى ذات الصلة ، مثل الجسيمات النانوية ، أو جزيئات تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، أو الأدوية البيولوجية الأخرى ، أو الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة لتحديد معدل إطلاقها وفعاليتها عند تطبيقها مع تقنية الهلام الدقيق الشيتوزان هذه. متغير آخر يمكن التحقيق فيه في المستقبل هو تغيير نطاق حجم microgels ، والذي يتم ببساطة عن طريق تغيير حجم شبكة مرشح المحقنة. يمكن أن يكون لهذا أيضا تأثير كبير على معدل إطلاق العلاجات من الهلاميات الدقيقة ، مما يسمح بالتحكم المريح في حركية الإطلاق دون تغيير كيمياء الربط المتبادل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول بسهولة باستخدام المحاقن والمرشحات الأكبر أو تقنيات الترشيح الفراغي لإنتاج كميات كبيرة من الهلام الدقيق للشيتوزان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية التابعة للمعهد الوطني للصحة تحت أرقام الجوائز R03AR068087 و R21AR071585 ومؤسسة Boettcher (# 11219) إلى MDK. تم دعم البنك المركزي المصري من قبل NIH / NCATS كولورادو CTSA رقم المنحة TL1 TR001081.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
| Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
| Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
| Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
| Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
| Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |
References
- Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
- Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
- Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
- Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
- Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
- Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
- Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
- Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
- Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
- Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
- Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
- Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
- Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
- Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
- Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
- Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
- Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
- Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
- Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
- Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
- Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
- Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
- Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
- Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
- Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
- Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
- Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
- Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
- Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
- Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
- Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
- Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
- Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).
