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Bioengineering

Fabbricazione di microgel di chitosano-genipina a grandezza controllata e priva di emulsioni per applicazioni di ingegneria tissutale

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo non basato sull'emulsione per la fabbricazione di microgel di chitosano-genipina. La dimensione di questi microgel può essere controllata con precisione e possono mostrare gonfiore dipendente dal pH, degradarsi in vivo ed essere caricati con molecole terapeutiche che rilasciano nel tempo in modo sostenuto, rendendoli altamente rilevanti per le applicazioni di ingegneria tissutale.

Abstract

I microgel di chitosano sono di notevole interesse nell'ingegneria tissutale grazie alla loro vasta gamma di applicazioni, al basso costo e all'immunogenicità. Tuttavia, i microgel di chitosano sono comunemente fabbricati utilizzando metodi di emulsione che richiedono risciacqui con solvente organico, che sono tossici e dannosi per l'ambiente. Il presente protocollo presenta un metodo rapido, non citotossico e non basato su emulsioni per la fabbricazione di microgel di chitosano-genipina senza la necessità di risciacqui con solvente organico. I microgel qui descritti possono essere fabbricati con un controllo preciso delle dimensioni. Mostrano un rilascio prolungato di biomolecole, rendendole altamente rilevanti per l'ingegneria tissutale, i biomateriali e la medicina rigenerativa. Il chitosano è reticolato con genipina per formare una rete di idrogel, quindi passato attraverso un filtro a siringa per produrre i microgel. I microgel possono essere filtrati per creare una gamma di dimensioni e mostrano gonfiore dipendente dal pH e si degradano nel tempo enzimaticamente. Questi microgel sono stati impiegati in un modello di lesione della piastra di crescita del ratto e hanno dimostrato di promuovere una maggiore riparazione del tessuto cartilagineo e di mostrare una completa degradazione a 28 giorni in vivo. Grazie al loro basso costo, all'elevata praticità e alla facilità di fabbricazione con materiali citocompatibili, questi microgel di chitosano presentano una tecnologia entusiasmante e unica nell'ingegneria tissutale.

Introduction

La piastra di crescita, nota anche come physis, è la struttura cartilaginea situata alla fine delle ossa lunghe che media la crescita nei bambini. Se la piastra di crescita si ferisce, può formarsi un tessuto di riparazione noto come "barra ossea", che interrompe la crescita normale e può causare difetti di crescita o deformità angolari. I dati epidemiologici hanno dimostrato che il 15%-30% di tutte le lesioni scheletriche infantili sono correlate alla piastra di crescita. La formazione di barre ossee si verifica fino al 30% di queste lesioni, rendendo le lesioni della piastra di crescita e il loro trattamento associato un problema di manifestazione clinica significativo 1,2,3,4. Quando si verifica la formazione di barre ossee, la via di trattamento più comune prevede la resezione della barra ossea e l'inserimento di un materiale interposizionale, come il silicio o il tessuto adiposo5. Tuttavia, i pazienti sottoposti a chirurgia di resezione della barra ossea spesso hanno una prognosi sfavorevole per il pieno recupero, in quanto attualmente non esiste un trattamento in grado di riparare completamente una piastra di crescita ferita 6,7,8. Alla luce di queste carenze, vi è un bisogno critico di strategie efficaci per il trattamento delle lesioni della piastra di crescita, sia nel prevenire la formazione di una barra ossea che nel rigenerare il tessuto cartilagineo fisico sano.

Le microparticelle di idrogel, o microgel, hanno recentemente guadagnato interesse come scaffold iniettabili in grado di fornire un rilascio prolungato di terapie9. Grazie alla loro elevata sintoniabilità e biocompatibilità, i microgel sono adatti anche per il fattore bioattivo o l'incapsulamento cellulare. I microgel possono essere realizzati con vari materiali, che vanno dai polimeri sintetici, come il polietilenglicole (PEG), ai polimeri naturali come l'alginato o il chitosano 10,11,12. Il chitosano ha dimostrato di avere diversi effetti benefici per l'ingegneria tissutale, come la sua capacità di destabilizzare la membrana esterna dei batteri gram-negativi, offrendo così un'attivitàantimicrobica intrinseca 1 3,14. Inoltre, il chitosano è conveniente, interattivo con le cellule e facilmente modificabile utilizzando la sua struttura contenente ammine. I microgel a base di chitosano promettono una strategia di biomateriali per la somministrazione di farmaci e la segnalazione di materiali che possono promuovere la rigenerazione dei tessuti prevenendo l'infezione batterica. Tuttavia, i microgel di chitosano sono spesso fabbricati con una vasta gamma di tecniche che richiedono attrezzature speciali, tecniche di emulsione o risciacqui con solventi citotossici. Ad esempio, alcuni studi hanno fabbricato microgel di chitosano con metodi basati su emulsioni, ma questi protocolli richiedono risciacqui con solvente e reticolanti citotossici, negando potenzialmente la loro traduzione in contesti clinici15,16. Altri studi hanno utilizzato approcci di microfluidica o elettrospray per fabbricare microgel di chitosano, che richiedono attrezzature speciali, preparazione e formazione17,18. I microgel di chitosano sono anche comunemente fatti con un processo dropwise di reticolante in soluzione di chitosano; tuttavia, questo metodo dipende fortemente dalla viscosità della soluzione, dalla concentrazione del polimero e dalla portata, rendendo difficile controllare le dimensioni e la dispersione dei microgel19,20. Al contrario, il metodo per la fabbricazione di microgel qui descritto non richiede attrezzature specialistiche o risciacqui con solvente, rendendo questi microgel praticabili per la fabbricazione in quasi tutti i laboratori o ambienti. Pertanto, questi microgel rappresentano biomateriali altamente rilevanti per un veicolo di somministrazione di farmaci rapido, economico e facile da produrre per molte applicazioni.

Modulando la composizione e le caratteristiche del materiale di un microgel, i ricercatori possono ottenere un controllo preciso sul microambiente cellulare, dirigendo così il comportamento cellulare in modo dipendente dal materiale. I microgel possono essere impiegati da soli o combinati con sistemi di biomateriali sfusi per impartire funzionalità specifiche, come il rilascio prolungato di fattori bioattivi o una precisa segnalazione speciale per cellule native o esogene. Biomateriali e microgel sono emersi come vie di trattamento interessanti per le lesioni delle placche di crescita. Uno sforzo significativo è stato dedicato allo sviluppo di biomateriali a base di alginato e chitosano per il trattamento delle lesioni delle placche di crescita 21,22,23,24,25. A causa della natura temporale dinamica dell'ossificazione della piastra di crescita e dell'allungamento osseo, il meccanismo di formazione della barra ossea non è completamente compreso. Pertanto, sono stati sviluppati diversi modelli animali per chiarire meglio i meccanismi di ossificazione endocondrale e formazione di barre ossee, come nei ratti, nei conigli e nelle pecore 26,27,28. Uno di questi modelli è un modello di lesione della piastra di crescita del ratto, che utilizza un difetto del foro di perforazione nella tibia del ratto per produrre una barra ossea in modo prevedibile e riproducibile e imita le lesioni umane in tutte e tre le zone della piastra di crescita29,30. Diverse strategie basate su biomateriali per il trattamento delle lesioni della piastra di crescita sono state testate utilizzando questo modello. Inoltre, sono stati sviluppati due diversi metodi per fabbricare microgel di chitosano, che possono essere utilizzati come un sistema di biomateriale iniettabile che rilascia terapie in modo sostenuto10,31. Questi microgel sono stati impiegati in un modello di lesione fisica del ratto e hanno mostrato una migliore rigenerazione della cartilagine31 quando si rilasciano SDF-1a e TGF-b3. Le tecniche fornite in questo protocollo descrivono i metodi sviluppati per fabbricare questi microgel di chitosano, che possono quindi essere impiegati in un'ampia varietà di applicazioni di ingegneria tissutale. Ad esempio, studi recenti hanno utilizzato microgel di chitosano termo- o magento-responsivi per applicazioni di somministrazione di farmaci oncologici controllati32,33.

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Protocol

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado di Denver. Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Maschi Sprague-Dawley di 6 settimane. Il modello di lesione della piastra di crescita del ratto è stato creato a seguito di un rapportoprecedentemente pubblicato 30.

1. Preparazione del polimero chitosano

  1. Ottenere chitosano purificato e liofilizzato a basso peso molecolare (LMW) da fonti disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali).
  2. Aggiungere 495 ml di acqua a doppia distillazione (ddH2O) e una barra di agitazione a un becher da 1 L. Aggiungere 5 g di chitosano (Passo 1.1.) e mescolare bene.
    NOTA: Il chitosano è solo scarsamente solubile in una soluzione acquosa a pH fisiologico, quindi il chitosano non si dissolverà facilmente in questa fase.
  3. Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale alla soluzione di chitosano sopra preparata.
  4. Mescolare coperto a 300 giri/min per 18 ore con il becher incastonato a bagnomaria a 50 °C.
  5. Utilizzando un pallone Büchner e un imbuto, filtrare la soluzione di chitosano attraverso dimensioni decrescenti di carta da filtro: 22 μm, 8 μm e 2,7 μm (vedere Tabella dei materiali).
  6. Aggiungere la soluzione filtrata di chitosano al tubo di dialisi della cellulosa (vedi Tabella dei materiali) e lasciare dializzare in ddH2O a temperatura ambiente per 4 giorni, cambiando il ddH2O ogni giorno.
    NOTA: Utilizzare acqua ultrapura ddH2O per l'ultima modifica.
  7. Trasferire la soluzione di chitosano dializzato in un becher e regolare il pH a 8,0 utilizzando 1 M NaOH.
  8. Aliquotare il chitosano in tubi per centrifughe e centrifugare a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  9. Decantare il surnatante in un flusso di rifiuti e risospesciare il chitosano in ddH2O, ripetendo 2x.
  10. Congelare e poi liofilizzare il pellet di chitosano.
    1. Ogni giorno, rimuovere il prodotto liofilizzato e registrare la massa.
      NOTA: Quando la massa del prodotto liofilizzato non cambia più, il prodotto viene completamente asciugato e può essere conservato a -20 °C fino al momento dell'uso.

2. Fabbricazione di idrogel di chitosano

  1. Aggiungere 2 mL di acido acetico al 6% e 120 mg di chitosano purificato (Fase 1) a una siringa Luer-lock da 10 mL per formare una soluzione di chitosano al 6% p/v.
  2. Collegare la siringa Luer-lock a un'altra siringa identica utilizzando un connettore Luer-lock femmina-femmina e mescolare la soluzione avanti e indietro per 30 s, o fino a quando il chitosano non si è completamente disciolto nell'acido acetico.
  3. Prima di reticolare, aggiungere qualsiasi agente terapeutico o bioattivo alla soluzione di chitosano (se necessario). Per il presente studio, 200 ng di SDF-1a e TGF-b3 (vedi Tabella dei materiali) sono stati aggiunti ai microgel.
    NOTA: SDF-1a e TGF-b3 sono agenti bioattivi rilevanti per la rigenerazione del tessuto della piastra di crescita. SDF-1a promuove la migrazione delle cellule staminali mesenchimali verso il sito del difetto e TGF-b3 funge da fattore condrogenico per indurre la differenziazione di queste cellule staminali lungo il lignaggio condrogenico31.
    NOTA: Mescolare nuovamente il chitosano tra le siringhe per incorporare completamente la terapia.
  4. Preparare 100 mM di soluzione reticolante di genipina (vedere Tabella dei materiali) in etanolo al 100%.
  5. Aggiungere 100 μL della soluzione di genipina preparata (fase 2.4.) alla siringa contenente chitosano e mescolare nuovamente avanti e indietro tra le siringhe per 30 s.
  6. Estrudere la miscela dalla siringa su una capsula di Petri da 35 mm, coprirla con pellicola di paraffina e incubarla a 37 °C durante la notte in atmosfera umidificata.
    NOTA: La soluzione diventerà blu scuro, indicando che si è verificata la reazione di reticolazione tra chitosano e genipina, portando alla formazione di microgel di chitosano.
  7. Filtrare il microgel di chitosano preparato seguendo i passaggi seguenti.
    1. Rompere delicatamente l'idrogel in pezzi più piccoli usando una spatola.
      NOTA: i pezzi devono essere abbastanza piccoli da essere trasferiti sul retro di una siringa da 10 ml, ~ 1-2 cm di diametro.
    2. Posizionare un filtro della dimensione di maglia desiderata nella parte posteriore di una siringa pulita da 10 ml.
      NOTA: l'intervallo di dimensioni tipico per i microgel è compreso tra 50-200 μm.
    3. Trasferire i pezzi di gel rotti nella siringa montata con il filtro e aggiungere 6 mL di ddH2O.
      NOTA: Il gel di chitosano si gonfierà in modo significativo nel mezzo acquoso, quindi è previsto un grande cambiamento nel volume del gel.
    4. Collegare la siringa tramite un connettore Luer-lock a un'altra siringa pulita da 10 ml.
    5. Forzare la miscela gel + acqua attraverso la siringa con il filtro per creare microgel con un diametro massimo specificato.
      1. Dopo la prima filtrazione, aprire il retro della siringa contenente il filtro ed estrudere nuovamente la miscela in questa siringa.
      2. Sostituire il retro della siringa e forzare nuovamente la miscela attraverso il filtro.
      3. Ripetere la filtrazione 5-6x o fino a quando non c'è poca resistenza attraverso il filtro.
  8. Risciacquare e purificare i microgel filtrati.
    1. Trasferire la miscela di gel filtrato in un tubo conico da 50 ml, portare il volume totale fino a 20 ml con ddH2O, quindi ruotare la miscela per garantire una dispersione omogenea.
    2. Centrifugare i microgel a 100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e decantare la fase acquosa superiore.
    3. Sospendere i microgel in 10 ml di etanolo al 70%, vortice e metterli sotto luce UV per 1 ora per sterilizzare.
    4. Centrifugare i microgel a 1.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare l'etanolo e risciacquare 3 volte con ddH2O.

3. Preparazione di microgel per applicazioni in vitro o in vivo

NOTA: Per il presente studio, la rigenerazione della cartilagine nelle lesioni della piastra di crescita è stata studiata in un modello di ratto. Per informazioni dettagliate, vedere il riferimento31.

  1. Sospendere i pellet di microgel 1:1 in ddH2O. I microgel possono essere conservati per un massimo di 1 mese sospesi in ddH2O a 4 °C. Se viene utilizzato un agente bioattivo, i microgel devono essere utilizzati immediatamente.
  2. Creare il sito della lesione nell'animale seguendo un rapporto precedentemente pubblicato30.
  3. Lavare il sito della lesione con soluzione salina e mantenere l'animale non trattato (per lo studio di controllo) o iniettare solo i microgel di chitosano o i microgel caricati con gli agenti bioattivi (Fase 3.2.).
  4. Chiudere la ferita nell'animale e somministrare analgesici post-chirurgici30.
  5. Nei giorni 7 o 28 post-operatorio, eutanasizzare il ratto con sovradosaggio di CO2 , asportare gli arti ed eseguire l'istologia per valutare la riparazione dei tessuti nel sito della lesione31.

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Representative Results

Il successo della fabbricazione di microgel di chitosano si basa sulla reazione di reticolazione tra genipina e chitosano, in particolare coinvolgendo le ammine sulle catene polimeriche di chitosano. A differenza di altre tecniche di fabbricazione di microgel, questo metodo non richiede emulsioni o risciacqui con solvente e può essere condotto rapidamente e facilmente con attrezzature economiche. Un indicatore distintivo per la fabbricazione di microgel di successo è il distinto cambiamento di colore dal bianco sporco al blu scuro dopo che il chitosano e la genipina sono stati mescolati. La reazione reticolante tra genipina e composti contenenti ammine, come il chitosano o altre proteine, è stata ben caratterizzata nella letteratura34. In breve, il meccanismo di reticolazione è considerato un attacco nucleofilo da parte dei gruppi amminici del chitosano, in cui la genipina agisce come una dialdeide con prodotti di condensazione stabili35. Le catene corte di genipina stabile e condensata fungono da ponti reticolanti tra i polimeri di chitosano. La reazione di reticolazione fa sì che la soluzione diventi blu scuro, probabilmente a causa della polimerizzazione indotta dai radicali dell'ossigeno e della deidrogenazione dei composti intermedi, che segue la reazione di apertura dell'anello dall'attacco nucleofilo36.

Una volta che i microgel sono stati filtrati e risospesi in una diluizione d'acqua 1:1, possono essere facilmente utilizzati in varie applicazioni di biomateriali. Recentemente è stato pubblicato un lavoro che utilizza questi microgel di chitosano privi di emulsione per promuovere la rigenerazione della cartilagine nelle lesioni delle placche di crescita. I microgel sono stati fabbricati come descritto nel presente documento e mantenuti vuoti o caricati con SDF-1a e TGF-b3, che sono agenti bioattivi che sono rilevanti nella rigenerazione del tessuto della piastra di crescita, con SDF-1a che promuove la migrazione delle cellule staminali mesenchimali nel sito del difetto e TGF-b3 che funge da fattore condrogenico per indurre la differenziazione di queste cellule staminali lungo il lignaggio condrogenico37, 38. Il tasso di rilascio delle proteine è stato quantificato in vitro tramite ELISA e il rilascio di queste molecole è stato sostenuto nel tempo31. Quindi, i microgel sono stati iniettati in una lesione della piastra di crescita in un modello di ratto in vivo e i microgel iniettati hanno impedito la formazione precoce di barre ossee in vivo31. Questi microgel di chitosano iniettabili, economici e semplici da produrre potrebbero essere facilmente impiegati in molte applicazioni di biomateriali.

Sebbene questo processo per la fabbricazione di microgel sia stato ottimizzato per una semplice configurazione e applicazioni, potrebbero ancora sorgere diversi problemi di cui i ricercatori dovrebbero essere consapevoli. L'insufficiente miscelazione del polimero e dei componenti reticolanti è la causa più probabile di risultati diversi durante la fabbricazione. Il chitosano solido deve essere miscelato vigorosamente tra le siringhe e la soluzione di chitosano risultante deve essere completamente omogenea prima che venga aggiunto il reticolante genipinico. Se la soluzione non è omogenea, i pezzi solidi di chitosano rimasti nella soluzione formeranno grumi e si verificherà una reticolazione irregolare, impedendo un filtraggio efficace e causando microgel polidispersi con diametri significativamente variabili. Un altro fattore importante da considerare durante la fabbricazione è evitare l'evaporazione durante il periodo di reticolazione, che deve essere prevenuta con film di paraffina o altre tecniche di intrappolamento per evaporazione. Se l'idrogel di chitosano si asciuga, non si gonfierà durante i risciacqui dell'acqua e non filtrerà attraverso la siringa. Infine, i microgel devono essere sospesi in acqua in eccesso durante il processo di filtrazione e conservati in acqua a 4 °C quando non in uso. I microgel non sono estrusi o iniettabili se non sospesi in almeno una diluizione 1:1 di acqua.

La Figura 1 mostra un'ampia panoramica del processo di fabbricazione del microgel. Lo stesso processo è raffigurato di nuovo nella Figura 2, che mostra le fotografie del processo, sottolineando le fasi del protocollo che sono difficili da capire dal solo testo. Ad esempio, la Figura 2D mostra come un filtro a rete metallica viene inserito nella siringa da 10 ml. Una volta completamente posizionato contro la parte superiore della siringa, questo filtro a rete metallica consente una filtrazione rapida e conveniente dei microgel di chitosano senza attrezzature o solventi specializzati. Allo stesso modo, la Figura 2E mostra il flusso di gel di chitosano idratato attraverso il filtro a rete, che è la base per la fabbricazione di microgel. La Figura 3 è stata adattata dalla nostra precedente pubblicazione su questi microgel e mostra il loro comportamento di gonfiore dipendente dal pH e le differenze nella dimensione dei microgel a seconda della dimensione dei pori del filtro a rete. Diverse dimensioni di maglia possono essere ordinate dal produttore, il che consente un comodo controllo sulle dimensioni dei microgel. Questo controllo preciso sulle dimensioni del microgel è molto importante quando si progettano sistemi di somministrazione di farmaci con tassi di rilascio del carico terapeutico ben definiti. Precedenti lavori sui microgel hanno anche dimostrato che si degradano significativamente in presenza di lisozima a 2-4 settimane31. Infine, la Figura 4 mostra le immaginiistologiche 31 in un modello di lesione della piastra di crescita del ratto trattato con i microgel di chitosano caricati con SDF-1a e TGF-b3.

Figure 1
Figura 1: Panoramica schematica della fabbricazione di microgel di chitosano. La figura è stata creata utilizzando biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fotografie del processo di fabbricazione del microgel. (A) Soluzione di chitosano in siringhe collegate tramite Luer lock. (B) Estrusione di gel di chitosano in una capsula di Petri da 35 mm. (C) Recupero del gel di chitosano dopo il cambiamento di colore reticolante da bianco sporco a blu scuro. D) Vista dall'alto verso il basso all'interno della siringa che mostra il setaccio a rete metallica montato contro l'ugello della siringa. (E) Il gel di chitosano è stato pressato attraverso un filtro a rete per produrre microgel. (F) I microgel sono stati conservati in una diluizione 1:1 di ddH2O in un tubo conico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: comportamento di gonfiore pH-dipendente dei microgel. (A) Grafico di distribuzione normale del diametro di Feret che mostra il comportamento di gonfiore dei microgel in risposta alle variazioni di pH. (B) Immagini fluorescenti di microgel fabbricati utilizzando la maglia n. 200 (immagine superiore: microgel di dimensioni <75 μm) e la rete n. 100 (immagine inferiore: microgel di dimensioni 75-150 μm). La figura viene ristampata con il permesso del riferimento31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini istologiche in un modello di lesione della piastra di crescita del ratto trattato con i microgel di chitosano caricati con SDF-1a e TGF-b3. 10x immagini istologiche che mostrano tessuto di riparazione della piastra di crescita intatto (A) ed (E), non trattato (B) e (F), microgel trattato (C) e (G), microgel + SDF-1a trattato (D) e (H) e microgel + TGF-b3 trattato (I ) arti. Nessun animale del giorno 7 è stato trattato con microgel + TGFb3. L'ematossilina blu di Alcian (ABH) colora l'osso da arancione a rosso, il tessuto fibroso rosa e la cartilagine blu. Il microgel appare come un tessuto fibroso rosso scuro. Barre di scala = 500 μm. La figura viene ristampata con il permesso del riferimento31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I microgel sono stati ampiamente studiati negli ultimi anni a causa del loro alto livello di applicabilità per vari scopi, come la somministrazione di farmaci o l'incapsulamento cellulare9. La facilità di produzione di costrutti di biomateriali su microscala è di notevole rilevanza nell'ingegneria tissutale, in quanto consente ai ricercatori di sviluppare strategie basate sull'idrogel a una dimensione e una scala temporale specifiche. Tuttavia, la maggior parte dei metodi per fabbricare microgel di chitosano richiedono costose attrezzature e reagenti, emulsioni o risciacqui con solventi citotossici, che impediscono la loro traduzione all'uso clinico 15,16,17,18,19,20. Questi microgel eccellono in termini di notevole praticità di fabbricazione, non richiedendo tecniche di emulsione o risciacqui con solvente. Inoltre, questi microgel mantengono le proprietà ideali per un costrutto ingegnerizzato tissutale, come il gonfiore e il carico di farmaci dipendenti dal pH, il comportamento di degradazione sintonizzato e il rilascio prolungato di terapie.

Il passo più critico nella fabbricazione di questi microgel di chitosano è la filtrazione tra le siringhe. Questi microgel iniziano come idrogel sfuso e vengono filtrati in un intervallo di dimensioni specifico utilizzando filtri a rete metallica. Senza filtraggio, l'applicabilità dei microgel, le proprietà meccaniche e le caratteristiche di rilascio del farmaco sarebbero significativamente diverse. La fase di filtraggio consente un controllo preciso sulle dimensioni degli idrogel e consente anche la fabbricazione ad alta produttività di microgel che presentano gonfiore dipendente dal pH e rilascio prolungato di terapie.

Una limitazione di questo processo è che la fase di filtraggio non ha portato a idrogel con una forma perfettamente sferica, che può essere un fattore importante da considerare per alcune applicazioni. Per questo motivo, la dimensione caratteristica dei microgel è stata descritta utilizzando il diametro di Feret (Figura 3), utile per quantificare le particelle di forma irregolare39. Sebbene la geometria dei microgel non fosse una sfera perfetta, la dimensione media delle particelle era facile da controllare in base alla dimensione delle maglie del filtro della siringa e, per molte applicazioni, non è necessario avere particelle perfettamente sferiche. L'indice di polidispersità (PDI) dei microgel è stato quantificato utilizzando il rapporto quadrato tra la deviazione standard del diametro di Feret e il diametro medio di Feret ottenuto da una grande popolazione di particelle (n = 74). La PDI è stata calcolata come 0,076 usando l'equazione

PDI = (s/D)2

dove s è la deviazione standard del diametro medio di Feret e D è il diametro medio di Feret40. A causa del filtraggio effettuato durante questo processo e dell'uso del diametro di Feret per particelle di forma irregolare, l'indice di polidispersità di queste particelle era piuttosto basso, al punto che potevano essere considerate monodisperse.

Per la ricerca futura, potrebbero essere apportate diverse modifiche a questo protocollo per adattarsi meglio alle esigenze di ricerca date. Ad esempio, solo due proteine, SDF1-a e TGF-b3, sono state studiate per il loro rilascio controllato con questi microgel. Lavori precedenti hanno mostrato un rilascio prolungato di questi fattori bioattivi fino a ~ 30 giorni in vitro. Tuttavia, altre terapie rilevanti, come nanoparticelle, molecole interferenti di RNA (RNAi), altri biologici o farmaci a piccole molecole potrebbero anche essere esplorate per quantificare il loro tasso di rilascio e la loro efficacia quando applicate con questa tecnologia di microgel di chitosano. Un'altra variabile che potrebbe essere studiata in futuro è la modifica della gamma di dimensioni dei microgel, che viene eseguita semplicemente modificando la dimensione delle maglie del filtro della siringa. Ciò potrebbe anche avere un impatto significativo sul tasso di rilascio delle terapie dai microgel, consentendo un comodo controllo sulla cinetica di rilascio senza alterare la chimica della reticolazione. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente scalato utilizzando siringhe e filtri più grandi o tecniche di filtrazione sotto vuoto per produrre grandi quantità di microgel di chitosano.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institute of Health con i numeri di premio R03AR068087 e R21AR071585 e dalla Boettcher Foundation (# 11219) a MDK. CBE è stato supportato da NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

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References

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Bioingegneria Numero 182
Fabbricazione di microgel di chitosano-genipina a grandezza controllata e priva di emulsioni per applicazioni di ingegneria tissutale
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