Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изготовление микрогелей хитозана-генипина с контролируемым размером и без эмульсий для тканевой инженерии

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Настоящий протокол описывает неэмульсионный способ изготовления микрогелей хитозана-генипина. Размер этих микрогелей можно точно контролировать, и они могут отображать pH-зависимый отек, разлагаться in vivo и загружаться терапевтическими молекулами, которые высвобождаются со временем устойчивым образом, что делает их очень актуальными для приложений тканевой инженерии.

Abstract

Микрогели хитозана представляют значительный интерес в тканевой инженерии из-за их широкого спектра применения, низкой стоимости и иммуногенности. Тем не менее, микрогели хитозана обычно изготавливаются с использованием методов эмульсии, которые требуют органических растворителей, которые токсичны и вредны для окружающей среды. В настоящем протоколе представлен быстрый, нецитотоксичный, неэмульсионный способ изготовления хитозан-генипиновых микрогелей без необходимости использования органических растворителей. Микрогели, описанные в настоящем описании, могут быть изготовлены с точным контролем размера. Они демонстрируют устойчивое высвобождение биомолекул, что делает их очень актуальными для тканевой инженерии, биоматериалов и регенеративной медицины. Хитозан сшивается с генипином с образованием гидрогелевой сети, а затем пропускается через шприцевой фильтр для получения микрогелей. Микрогели могут быть отфильтрованы для создания диапазона размеров, и они показывают pH-зависимый отек и ухудшаются с течением времени ферментативно. Эти микрогели были использованы в модели повреждения пластин роста крыс и, как было продемонстрировано, способствуют увеличению восстановления хрящевой ткани и показывают полную деградацию через 28 дней in vivo. Благодаря своей низкой стоимости, высокому удобству и простоте изготовления с цитосовместимыми материалами, эти микрогели хитозана представляют собой захватывающую и уникальную технологию в тканевой инженерии.

Introduction

Пластина роста, также известная как физис, представляет собой структуру хряща, расположенную на конце длинных костей, которая опосредует рост у детей. Если пластина роста повреждается, может образоваться восстанавливающая ткань, известная как «костный стержень», которая прерывает нормальный рост и может вызвать дефекты роста или угловые деформации. Эпидемиологические данные показали, что 15%-30% всех детских травм скелета связаны с пластиной роста. Образование костного стержня происходит в 30% этих травм, что делает травмы пластин роста и связанное с ними лечение значительным клиническим проявлением проблемы 1,2,3,4. Когда происходит образование костного стержня, наиболее распространенный способ лечения включает резекцию костного стержня и введение интерпозиционного материала, такого как кремний или жироваяткань 5. Тем не менее, пациенты, которые подвергаются резекции костной полосы, часто имеют плохой прогноз для полного выздоровления, так как в настоящее время нет лечения, которое может полностью восстановить поврежденную пластину роста 6,7,8. В свете этих недостатков существует острая необходимость в эффективных стратегиях лечения повреждений пластин роста, как в предотвращении образования костного стержня, так и в регенерации здоровой физарной хрящевой ткани.

Микрочастицы гидрогеля, или микрогели, недавно приобрели интерес в качестве инъекционных каркасов, которые могут обеспечить устойчивое высвобождение терапевтических средств9. Благодаря своей высокой настраиваемости и биосовместимости, микрогели также хорошо подходят для биоактивного фактора или инкапсуляции клеток. Микрогели могут быть изготовлены из различных материалов, начиная от синтетических полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), до природных полимеров, таких как альгинат или хитозан 10,11,12. Было показано, что хитозан оказывает несколько полезных эффектов на тканевую инженерию, таких как его способность дестабилизировать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, тем самым предлагая присущую антимикробную активность1 3,14. Кроме того, хитозан является экономически эффективным, интерактивным в клетках и легко модифицируется с использованием его аминосодержащей структуры. Микрогели на основе хитозана обещают стратегию биоматериала для доставки лекарств и передачи сигналов материала, которые могут способствовать регенерации тканей, предотвращая бактериальную инфекцию. Тем не менее, микрогели хитозана часто изготавливаются с помощью широкого спектра методов, которые требуют специального оборудования, методов эмульсии или цитотоксических растворителей. Например, в некоторых исследованиях были изготовлены микрогели хитозана методами на основе эмульсии, но эти протоколы требуют полосканий растворителями и цитотоксических сшивающих веществ, что потенциально сводит на нет их трансляцию в клинические условия15,16. В других исследованиях использовались микрофлюидикические или электрораспылительные подходы для изготовления микрогелей хитозана, которые требуют специального оборудования, подготовки и обучения17,18. Микрогели хитозана также обычно изготавливаются с по каплевидным процессом сшивания в раствор хитозана; однако этот способ сильно зависит от вязкости раствора, концентрации полимера и скорости потока, что затрудняет контроль размера и дисперсии микрогелей19,20. И наоборот, способ изготовления микрогелей, описанный в настоящем описании, не требует специального оборудования или растворителей, что делает эти микрогели жизнеспособными для изготовления практически в любой лаборатории или условиях. Таким образом, эти микрогели представляют собой очень важные биоматериалы для быстрого, экономически эффективного и простого в производстве средства доставки лекарств для многих применений.

Модулируя состав микрогеля и характеристики материала, исследователи могут получить точный контроль над клеточной микросредой, тем самым направляя поведение клеток в зависимости от материала. Микрогели могут быть использованы сами по себе или в сочетании с объемными системами биоматериала для придания специфических функциональных возможностей, таких как расширенное высвобождение биологически активных факторов или точная специальная передача сигналов для нативных или экзогенных клеток. Биоматериалы и микрогели стали привлекательными способами лечения травм пластин роста. Значительные усилия были направлены на разработку биоматериалов на основе альгинатов и хитозана для лечения повреждений пластин роста 21,22,23,24,25. Из-за динамического временного характера окостенения пластин роста и удлинения кости механизм образования костного стержня до конца не изучен. Поэтому было разработано несколько моделей на животных, чтобы лучше прояснить механизмы эндохондрального окостенения и образования костного стержня, например, у крыс, кроликов и овец 26,27,28. Одной из таких моделей является модель повреждения пластины роста крыс, которая использует дефект отверстия в голени крысы для получения костного стержня предсказуемым и воспроизводимым образом и имитирует травмы человека во всех трех зонах пластины роста29,30. Несколько основанных на биоматериале стратегий лечения повреждений пластин роста были протестированы с использованием этой модели. Кроме того, были разработаны два различных метода изготовления микрогелей хитозана, которые могут быть использованы в качестве инъекционной системы биоматериала, которая высвобождает терапевтические средства устойчивым образом10,31. Эти микрогели были использованы в модели повреждения физей крыс, и они показали улучшенную регенерацию хряща31 при высвобождении SDF-1a и TGF-b3. Методы, представленные в этом протоколе, описывают методы, разработанные для изготовления этих микрогелей хитозана, которые затем могут быть использованы в широком спектре приложений тканевой инженерии. Например, в недавних исследованиях использовались термо- или пурпурно-чувствительные микрогели хитозана для контролируемых онкологических применений доставки лекарств32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо в Денвере. Для настоящего исследования использовались 6-недельные самцы крыс Sprague-Dawley. Модель повреждения пластины роста крыс была создана после ранее опубликованного отчета30.

1. Получение полимера хитозана

  1. Получают очищенный и лиофилизированный низкомолекулярный (НМВ) хитозан из коммерчески доступных источников (см. Таблицу материалов).
  2. Добавьте 495 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O) и перемешивание в стакан объемом 1 л. Добавить 5 г хитозана (шаг 1.1.) и хорошо перемешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хитозан только умеренно растворим в водном растворе при физиологическом рН, поэтому хитозан не будет легко растворяться на этом этапе.
  3. Добавьте 5 мл ледниковой уксусной кислоты в вышеприготовленный раствор хитозана.
  4. Перемешивайте при 300 оборотах в минуту в течение 18 ч, а стакан устанавливают на водяной бане при температуре 50 °C.
  5. Используя колбу и воронку Бюхнера, фильтруйте раствор хитозана через уменьшение размеров фильтровальной бумаги: 22 мкм, 8 мкм и 2,7 мкм (см. Таблицу материалов).
  6. Добавляют фильтрованный раствор хитозана в целлюлозные диализные трубки (см. Таблицу материалов) и дают диализировать в ddH2Oпри комнатной температуре в течение 4 дней, изменяя ddH2Oкаждый день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сверхчистую воду ddH2O для последнего изменения.
  7. Переложите диализированный раствор хитозана на стакан и отрегулируйте рН до 8,0 с помощью 1 М NaOH.
  8. Аликвотирование хитозана в центрифужные трубки и центрифугу при 4000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Декантируйте супернатант в поток отходов и повторно суспендируйте хитозан в ddH2O, повторяя 2x.
  10. Заморозьте, а затем лиофилизируйте гранулу хитозана.
    1. Каждый день удаляйте лиофилизированный продукт и записывайте массу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда масса лиофилизированного продукта больше не изменяется, продукт полностью высушивается и может храниться при -20 °C до готовности к использованию.

2. Изготовление гидрогеля хитозана

  1. Добавьте 2 мл 6% уксусной кислоты и 120 мг очищенного хитозана (этап 1) к шприцу Luer-lock объемом 10 мл с образованием 6% мас./в раствора хитозана.
  2. Подключите шприц Luer-lock к другому идентичному шприцу с помощью разъема Luer-lock женского пола и смешивайте раствор вперед и назад в течение 30 с или до тех пор, пока хитозан полностью не растворится в уксусной кислоте.
  3. Перед сшиванием добавьте любое терапевтическое или биологически активное средство в раствор хитозана (при необходимости). Для настоящего исследования в микрогели было добавлено 200 нг SDF-1a и TGF-b3 (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: SDF-1a и TGF-b3 являются биологически активными агентами, имеющими отношение к регенерации тканей пластинки роста. SDF-1a способствует миграции мезенхимальных стволовых клеток к месту дефекта, а TGF-b3 служит хондрогенным фактором, индуцирующим дифференцировку этих стволовых клеток по хондрогенной линии31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снова смешайте хитозан между шприцами, чтобы полностью включить терапевтическое средство.
  4. Готовят 100 мМ запасного сшивающего раствора генипина (см. Таблицу материалов) в 100% этаноле.
  5. Добавьте 100 мкл приготовленного раствора генипина (этап 2.4.) к шприцу, содержащему хитозан, и снова перемешайте между шприцами в течение 30 с.
  6. Выдавить смесь из шприца на чашку Петри 35 мм, накрыть парафиновой пленкой и инкубировать при 37 °C в течение ночи во увлажненной атмосфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор станет темно-синим, что указывает на то, что произошла реакция сшивания между хитозаном и генипином, что привело к образованию микрогеля хитозана.
  7. Процедите приготовленный микрогель хитозана, выполнив следующие действия.
    1. Аккуратно разбейте гидрогель на более мелкие кусочки с помощью шпателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки должны быть достаточно маленькими, чтобы их можно было перенести на заднюю часть шприца объемом 10 мл, ~1-2 см в диаметре.
    2. Поместите фильтр нужного размера сетки в заднюю часть чистого шприца объемом 10 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный диапазон размеров микрогелей составляет от 50 до 200 мкм.
    3. Переложите сломанные кусочки геля в шприц, оснащенный фильтром, и добавьте 6 мл ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хитозановый гель будет значительно набухать в водной среде, поэтому ожидается большое изменение объема геля.
    4. Подключите шприц через разъем Luer-lock к другому чистому шприцу объемом 10 мл.
    5. Направьте смесь гель + вода через шприц с фильтром для создания микрогелей с заданным максимальным диаметром.
      1. После первой фильтрации откройте заднюю часть шприца, содержащего фильтр, и выдавите смесь обратно в этот шприц.
      2. Замените заднюю часть шприца и снова протолкните смесь через фильтр.
      3. Повторите фильтрацию 5-6 раз или до тех пор, пока через фильтр не появится небольшое сопротивление.
  8. Промыть и очистить фильтрованные микрогели.
    1. Переложите отфильтрованную гелевую смесь в коническую трубку объемом 50 мл, доведите общий объем до 20 мл с ddH2O, а затем вихрь смеси для обеспечения однородной дисперсии.
    2. Центрифугируют микрогели при 100 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и декантируют верхнюю водную фазу.
    3. Повторно суспендируют микрогели в 10 мл 70% этанола, вихря и помещают под ультрафиолетовый свет на 1 ч для стерилизации.
    4. Центрифугировать микрогели при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, выбросить этанол и промыть 3 раза с ddH2O.

3. Приготовление микрогелей для применения in vitro или in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования регенерация хряща при повреждениях пластин роста была изучена на модели крысы. Более подробную информацию см. в ссылке31.

  1. Повторно суспендировать микрогелевые гранулы 1:1 в ddH2O. Микрогели могут храниться до 1 месяца суспендированными в ddH2Oпри 4 °C. Если используется биологически активный агент, микрогели должны быть использованы немедленно.
  2. Создайте место травмы у животного в соответствии с ранее опубликованным отчетом30.
  3. Промыть место повреждения физиологическим раствором и либо оставить животное без лечения (для контрольного исследования), либо ввести только микрогели хитозана или микрогели, загруженные биологически активными агентами (шаг 3.2.).
  4. Закройте рану у животного и введите послеоперационные анальгетики30.
  5. На 7 или 28 день после операции усыпляют крысу при передозировке CO2 , иссекают конечности и выполняют гистологию для оценки восстановления тканей в месте повреждения31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешное изготовление микрогелей хитозана зависит от реакции сшивания между генипином и хитозаном, в частности с участием аминов в полимерных цепях хитозана. В отличие от других методов изготовления микрогелей, этот метод не требует эмульсий или растворителей и может быть быстро и легко проведен с помощью недорогого оборудования. Отличительным показателем успешного изготовления микрогелей является отчетливое изменение цвета от белого до темно-синего после смешивания хитозана и генипина. Реакция сшивания между генипином и аминосодержащими соединениями, такими как хитозан или другие белки, была хорошо охарактеризована в литературе34. Короче говоря, механизм сшивания рассматривается как нуклеофильная атака аминогрупп хитозана, в которой генипин действует как диальдегид со стабильными продуктами конденсации35. Короткие цепи стабильного, конденсированного генипина действуют как сшивающие мосты между полимерами хитозана. Реакция сшивания заставляет раствор становиться темно-синим, вероятно, из-за полимеризации и дегидрирования промежуточных соединений, вызванной кислородными радикалами, что следует за реакцией открытия кольца от нуклеофильной атаки36.

После того, как микрогели были отфильтрованы и повторно суспендированы в разбавлении воды 1: 1, они могут быть легко использованы в различных применениях биоматериала. Недавно была опубликована работа с использованием этих микрогелей хитозана без эмульсии для содействия регенерации хряща при травмах пластин роста. Микрогели были изготовлены, как описано в настоящем описании, и либо содержались пустыми, либо нагруженными SDF-1a и TGF-b3, которые являются биологически активными агентами, имеющими отношение к регенерации ткани пластины роста, причем SDF-1a способствует миграции мезенхимальных стволовых клеток к месту дефекта, а TGF-b3 служит хондрогенным фактором, индуцирующим дифференцировку этих стволовых клеток вниз по хондрогенной линии37, 38. Скорость высвобождения белков была количественно определена in vitro с помощью ИФА, и высвобождение этих молекул поддерживалось в течениевремени 31. Затем микрогели вводили в повреждение пластины роста в модели крысы in vivo, и введенные микрогели предотвращали раннее образование костного стержня in vivo31. Эти инъекционные, экономически эффективные и простые в производстве микрогели хитозана могут быть легко использованы во многих приложениях биоматериалов.

Хотя этот процесс изготовления микрогелей был оптимизирован для простой настройки и применения, все еще может возникнуть несколько проблем, о которых исследователи должны помнить. Недостаточное смешивание полимерных и сшивающих компонентов является наиболее вероятной причиной различных результатов во время изготовления. Твердый хитозан должен быть энергично перемешан между шприцами, и полученный раствор хитозана должен быть полностью однородным до добавления генипинового сшивателя. Если раствор не является однородным, твердые куски хитозана, оставшиеся в растворе, будут образовывать комочки, и произойдет неравномерное сшивание, препятствующее эффективной фильтрации и приводящее к полидисперсным микрогелям со значительно изменяющимися диаметрами. Другим важным фактором, который следует учитывать во время изготовления, является предотвращение испарения в течение периода сшивания, которое должно быть предотвращено с помощью парафиновой пленки или других методов улавливания испарения. Если гидрогель хитозана высохнет, он не будет набухать во время промывания воды, и он не будет фильтроваться через шприц. Наконец, микрогели должны быть суспендированы в избыточной воде во время процесса фильтрации и храниться в воде при 4 °C, когда они не используются. Микрогели не являются экструдируемыми или инъекционными, если они не суспендированы по крайней мере в разведении воды 1:1.

На рисунке 1 показан широкий обзор процесса изготовления микрогелей. Тот же процесс снова изображен на рисунке 2, где показаны фотографии процесса, подчеркивающие этапы протокола, которые трудно понять только из текста. Например, на рисунке 2D показано, как фильтр проволочной сетки вставляется в шприц объемом 10 мл. После полной посадки на верхнюю часть шприца этот фильтр из проволочной сетки позволяет быстро и удобно фильтровать микрогели хитозана без специального оборудования или растворителей. Аналогичным образом, на фиг.2Е показан поток гидратированного хитозанового геля через сетчатый фильтр, который является основой для изготовления микрогелей. Рисунок 3 был адаптирован из нашей предыдущей публикации об этих микрогелях и показывает их pH-зависимое поведение при набухании и различия в размере микрогелей в зависимости от размера пор сетчатого фильтра. У производителя можно заказать различные размеры ячеек, что позволяет удобно контролировать размер микрогелей. Этот точный контроль размера микрогеля очень важен при разработке систем доставки лекарств с четко определенными скоростями высвобождения терапевтической нагрузки. Предыдущие работы на микрогелях также показали, что они значительно разлагаются в присутствии лизоцима на 2-4 неделе31. Наконец, на фиг.4 показаны гистологические изображения31 в модели повреждения пластины роста крыс, обработанной микрогелями хитозана, загруженными SDF-1a и TGF-b3.

Figure 1
Рисунок 1: Схематический обзор изготовления микрогелей хитозана. Рисунок был создан с использованием biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Фотографии процесса изготовления микрогеля. (А) Раствор хитозана в шприцах, соединенных с помощью замка Luer. (B) Экструзия хитозанового геля в чашку Петри толщиной 35 мм. (C) Извлечение хитозановой гели после сшивки изменения цвета с белого до темно-синего. D) Вид сверху вниз внутри шприца, показывающий сито из проволочной сетки, установленное на сопле шприца. (E) Хитозан гель прессовали через сетчатый фильтр для получения микрогелей. (F) Микрогели хранили в разведении 1:1 ddH2Oв конической пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: pH-зависимое набухание микрогелей. (A) График нормального распределения диаметра Ферета, показывающий набухание микрогелей в ответ на изменения рН. (B) Флуоресцентные изображения микрогелей, изготовленные с использованием сетки No 200 (верхнее изображение: микрогели размером <75 мкм) и сетки No 100 (нижнее изображение: микрогели размером 75-150 мкм). Рисунок перепечатывается с разрешения ссылки31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Гистологические изображения в модели повреждения пластины роста крысы, обработанной микрогелями хитозана, загруженными SDF-1a и TGF-b3. 10x гистологические изображения, показывающие восстановление ткани пластины роста неповрежденной (A) и (E), необработанной (B) и (F), микрогеля, обработанной (C) и (G), микрогеля + SDF-1a обработанной (D) и (H), и микрогеля + TGF-b3 обработанной (I) ) конечности. Ни разу 7 животных не обрабатывали микрогелем + TGFb3. Альциановый синий гематоксилин (ABH) окрашивает кость в оранжевый в красный, фиброзную ткань в розовый, а хрящево-синий. Микрогель проявляется в виде темно-красной фиброзоподобной ткани. Шкала стержней = 500 мкм. Рисунок перепечатывается с разрешения ссылки31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микрогели были широко исследованы в последние годы из-за их высокого уровня применимости для различных целей, таких как доставка лекарств или инкапсуляция клеток9. Простота изготовления микромасштабных конструкций биоматериала имеет большое значение в тканевой инженерии, поскольку она позволяет исследователям разрабатывать стратегии на основе гидрогеля в определенном размере и масштабе времени. Однако большинство способов изготовления микрогелей хитозана требуют дорогостоящего оборудования и реагентов, эмульсий или цитотоксических растворителей, что препятствует их переводу в клиническое применение 15,16,17,18,19,20. Эти микрогели отличаются значительным удобством изготовления, не требуя методов эмульсии или растворителей. Кроме того, эти микрогели сохраняют идеальные свойства для тканеинженерной конструкции, такие как pH-зависимый отек и нагрузка на лекарство, настроенное деградационное поведение и устойчивое высвобождение терапевтических средств.

Наиболее важным этапом в изготовлении этих микрогелей хитозана является фильтрация между шприцами. Эти микрогели начинаются как объемный гидрогель и фильтруются до определенного диапазона размеров с использованием фильтров проволочной сетки. Без фильтрации применимость, механические свойства и характеристики высвобождения лекарственных средств микрогелей были бы значительно отличаться. Стадия фильтрации позволяет точно контролировать размер гидрогелей, а также позволяет производить микрогели с высокой пропускной способностью, которые демонстрируют pH-зависимый отек и устойчивое высвобождение терапевтических средств.

Ограничением этого процесса является то, что стадия фильтрации не привела к получению гидрогелей с идеально сферической формой, что может быть важным фактором для некоторых применений. По этой причине характерный размер микрогелей был описан с использованием диаметра Ферета (фиг.3), который полезен для количественной оценки частицнеправильной формы 39. Хотя геометрия микрогелей не была идеальной сферой, средний размер частиц было легко контролировать на основе размера сетки шприцевого фильтра, и для многих применений наличие идеально сферических частиц не требуется. Индекс полидисперсности микрогелей (PDI) количественно оценивали с использованием квадратного отношения стандартного отклонения диаметра Ферета к среднему диаметру Ферета, полученному из большой популяции частиц (n = 74). PDI был рассчитан как 0,076 с использованием уравнения

PDI = (s/D)2

где s — стандартное отклонение среднего диаметра Ферета, а D — средний диаметр Ферета40. Из-за фильтрации, выполненной во время этого процесса, и использования диаметра Ферета для частиц неправильной формы, индекс полидисперсности этих частиц был довольно низким, до такой степени, что их можно было считать монодисперсными.

Для будущих исследований можно было бы внести несколько изменений в этот протокол, чтобы лучше соответствовать данной потребности в исследованиях. Например, только два белка, SDF1-a и TGF-b3, были изучены на предмет их контролируемого высвобождения с этими микрогелями. Предыдущая работа показала устойчивое высвобождение этих биологически активных факторов до ~30 дней in vitro. Тем не менее, другие соответствующие терапевтические средства, такие как наночастицы, молекулы, интерферирующие РНК (RNAi), другие биологические препараты или низкомолекулярные препараты, также могут быть изучены для количественной оценки скорости их высвобождения и эффективности при применении с этой технологией микрогеля хитозана. Другой переменной, которая может быть исследована в будущем, является изменение диапазона размеров микрогелей, что делается просто путем изменения размера сетки шприцевого фильтра. Это также может оказать значительное влияние на скорость высвобождения терапевтических средств из микрогелей, что позволяет удобно контролировать кинетику высвобождения без изменения химии сшивки. Кроме того, этот протокол может быть легко расширен с использованием больших шприцев и фильтров или методов вакуумной фильтрации для получения большого количества микрогелей хитозана.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний Национального института здравоохранения под номерами R03AR068087 и R21AR071585 и Фондом Боттчера (#11219) MDK. CBE был поддержан NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
  2. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
  3. Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
  4. Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
  5. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
  6. Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
  7. Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
  8. Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
  9. Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
  10. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  11. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
  12. Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
  13. Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
  14. Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
  15. Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
  16. Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
  17. Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
  18. Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
  19. Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
  20. Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
  21. Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
  22. Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
  23. Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
  24. Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
  25. Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
  26. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
  27. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
  28. Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
  29. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
  30. Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
  31. Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
  32. Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
  33. Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
  34. Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
  35. Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
  36. Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
  37. Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
  38. Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
  39. Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
  40. Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).

Tags

Биоинженерия выпуск 182
Изготовление микрогелей хитозана-генипина с контролируемым размером и без эмульсий для тканевой инженерии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stager, M. A., Erickson, C. B.,… More

Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter