Summary
Detta protokoll beskriver en icke-emulsionsbaserad metod för tillverkning av kitosan-genipinmikrogeler. Storleken på dessa mikrogeler kan kontrolleras exakt, och de kan visa pH-beroende svullnad, brytas ned in vivo och laddas med terapeutiska molekyler som frigörs över tid på ett hållbart sätt, vilket gör dem mycket relevanta för vävnadstekniska applikationer.
Abstract
Chitosanmikrogeler är av stort intresse för vävnadsteknik på grund av deras breda användningsområde, låga kostnader och immunogenicitet. Chitosanmikrogeler tillverkas emellertid vanligtvis med hjälp av emulsionsmetoder som kräver sköljningar av organiska lösningsmedel, som är giftiga och skadliga för miljön. Detta protokoll presenterar en snabb, icke-cytotoxisk, icke-emulsionsbaserad metod för tillverkning av kitosan-genipinmikrogeler utan behov av sköljning av organiska lösningsmedel. Mikrogelerna som beskrivs häri kan tillverkas med exakt storlekskontroll. De uppvisar ihållande frisättning av biomolekyler, vilket gör dem mycket relevanta för vävnadsteknik, biomaterial och regenerativ medicin. Chitosan tvärbinds med genipin för att bilda ett hydrogelnätverk och passeras sedan genom ett sprutfilter för att producera mikrogelerna. Mikrogelerna kan filtreras för att skapa en rad olika storlekar, och de visar pH-beroende svullnad och bryts ned med tiden enzymatiskt. Dessa mikrogeler har använts i en råtttillväxtplatta skademodell och visade sig främja ökad broskvävnadsreparation och visa fullständig nedbrytning vid 28 dagar in vivo. På grund av deras låga kostnad, höga bekvämlighet och enkla tillverkning med cytokompatibla material presenterar dessa kitosanmikrogeler en spännande och unik teknik inom vävnadsteknik.
Introduction
Tillväxtplattan, även känd som fysen, är broskstrukturen som ligger i slutet av långa ben som förmedlar tillväxt hos barn. Om tillväxtplattan skadas kan reparationsvävnad som kallas en "benig bar" bildas, vilket avbryter normal tillväxt och kan orsaka tillväxtfel eller vinkeldeformiteter. Epidemiologiska data har visat att 15%-30% av alla skelettskador i barndomen är relaterade till tillväxtplattan. Benstångsbildning förekommer i upp till 30% av dessa skador, vilket gör tillväxtplattskador och deras tillhörande behandling till en signifikant klinisk manifestationsproblem 1,2,3,4. När benstångsbildning inträffar innebär den vanligaste behandlingsvägen resektion av benstången och införande av ett interpositionellt material, såsom kisel eller fettvävnad5. Patienter som genomgår benig barresektionskirurgi har dock ofta en dålig prognos för full återhämtning, eftersom det för närvarande inte finns någon behandling som helt kan reparera en skadad tillväxtplatta 6,7,8. Mot bakgrund av dessa brister finns det ett kritiskt behov av effektiva strategier för behandling av skador på tillväxtplattor, både för att förhindra bildandet av en benig bar och regenerera frisk kroppsbroskvävnad.
Hydrogelmikropartiklar, eller mikrogeler, har nyligen fått intresse som injicerbara byggnadsställningar som kan ge långvarig frisättning avterapier 9. På grund av sin höga tunbarhet och biokompatibilitet är mikrogeler också väl lämpade för bioaktiv faktor eller cellinkapsling. Mikrogeler kan tillverkas av olika material, allt från syntetiska polymerer, såsom polyetylenglykol (PEG), till naturliga polymerer som alginat eller kitosan 10,11,12. Chitosan har visat sig ha flera fördelaktiga effekter för vävnadsteknik, såsom dess förmåga att destabilisera det yttre membranet hos gramnegativa bakterier och därigenom erbjuda inneboende antimikrobiell aktivitet1 3,14. Dessutom är kitosan kostnadseffektivt, cellinteraktivt och enkelt modifierat med hjälp av sin amininnehållande struktur. Chitosanbaserade mikrogeler lovar en biomaterialstrategi för läkemedelsleverans och materialsignalering som kan främja vävnadsregenerering samtidigt som bakterieinfektion förhindras. Chitosanmikrogeler tillverkas emellertid ofta med ett brett spektrum av tekniker som kräver specialutrustning, emulsionstekniker eller cytotoxiska lösningsmedelsköljningar. Till exempel har vissa studier tillverkat kitosanmikrogeler med emulsionsbaserade metoder, men dessa protokoll kräver lösningsmedelssköljningar och cytotoxiska tvärbindare, vilket potentiellt förnekar deras översättning till kliniska inställningar15,16. Andra studier har använt mikrofluidik eller elektrospraymetoder för att tillverka kitosanmikrogeler, som kräver specialutrustning, förberedelse och träning17,18. Chitosanmikrogeler tillverkas också vanligtvis med en droppvis process av tvärbindare till kitosanlösning; denna metod är emellertid starkt beroende av lösningens viskositet, polymerkoncentration och flödeshastighet, vilket gör det svårt att kontrollera storleken och dispersiteten hos mikrogelerna19,20. Omvänt kräver metoden för mikrogeltillverkning som beskrivs häri ingen specialutrustning eller lösningsmedelssköljningar, vilket gör dessa mikrogeler livskraftiga för tillverkning i nästan alla laboratorier eller miljöer. Därför representerar dessa mikrogeler mycket relevanta biomaterial för ett snabbt, kostnadseffektivt och lättproducerat läkemedelsleveransfordon för många applikationer.
Genom att modulera en mikrogels sammansättning och materialegenskaper kan forskare få exakt kontroll över den cellulära mikromiljön och därmed styra cellbeteendet på ett materialberoende sätt. Mikrogeler kan användas på egen hand eller kombineras med bulkbiomaterialsystem för att ge specifika funktioner, såsom utökad frisättning av bioaktiva faktorer eller exakt specialsignalering för infödda eller exogena celler. Biomaterial och mikrogeler har seglat upp som attraktiva behandlingsvägar för skador på tillväxtplattor. Betydande ansträngningar har gjorts för att utveckla alginat- och kitosanbaserade biomaterial för att behandla skador på tillväxtplattor 21,22,23,24,25. På grund av den dynamiska temporala naturen hos tillväxtplattans benförbening och benförlängning är mekanismen för benstångsbildning inte helt förstådd. Därför har flera djurmodeller utvecklats för att bättre belysa mekanismerna för endokondral benbildning och benig barbildning, såsom hos råttor, kaniner och får 26,27,28. En sådan modell är en råtttillväxtplatta skademodell, som använder en borrhålsdefekt i råttbenet för att producera en benig stång på ett förutsägbart och reproducerbart sätt och efterliknar mänskliga skador över alla tre zonerna på tillväxtplattan29,30. Flera biomaterialbaserade strategier för behandling av skador på tillväxtplattor har testats med hjälp av denna modell. Dessutom har två olika metoder för tillverkning av kitosanmikrogeler utvecklats, som kan användas som ett injicerbart biomaterialsystem som frigör terapier på ett hållbart sätt10,31. Dessa mikrogeler har använts i en råtta fyseal skademodell, och de visade förbättrad broskregenerering31 vid frisättning av SDF-1a och TGF-b3. Teknikerna i detta protokoll beskriver metoder som utvecklats för att tillverka dessa kitosanmikrogeler, som sedan kan användas i en mängd olika vävnadstekniska applikationer. Till exempel har nyligen genomförda studier använt termo- eller magento-responsiva kitosanmikrogeler för kontrollerade onkologiska läkemedelsleveransapplikationer32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer godkändes av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee. 6 veckor gamla manliga Sprague-Dawley råttor användes för den aktuella studien. Råtttillväxtplattans skademodell skapades efter en tidigare publicerad rapport30.
1. Framställning av kitosanpolymeren
- Få renad och frystorkad chitosan med låg molekylvikt (LMW) från kommersiellt tillgängliga källor (se materialtabell).
- Tillsätt 495 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2 O)och en omrörning till en 1 L bägare. Tillsätt 5 g kitosan (steg 1.1.) och blanda väl.
OBS: Chitosan är endast sparsamt lösligt i en vattenlösning vid fysiologiskt pH, så chitosanen kommer inte att lösas lätt vid detta steg. - Tillsätt 5 ml isättika till den ovan beredda kitosanlösningen.
- Rör om vid 300 rpm i 18 timmar med bägaren i ett vattenbad som hålls vid 50 °C.
- Använd en Büchnerkolv och tratt och filtrera chitosanlösningen genom minskande storlekar på filterpapper: 22 μm, 8 μm och 2,7 μm (se materialtabell).
- Tillsätt den filtrerade kitosanlösningen i cellulosadialysslangen (se materialtabell) och låt dialysera i ddH2Ovid rumstemperatur i 4 dagar och byt ddH2O varje dag.
OBS: Använd ultrarent ddH2O vatten för den sista förändringen. - Överför den dialyserade kitosanlösningen till en bägare och justera pH till 8,0 med 1 M NaOH.
- Alikvotera kitosanen i centrifugrör och centrifugera vid 4000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten till en avfallsström och återsuspendera chitosanen i ddH2O, upprepa 2x.
- Frys och frys sedan chitosanpelleten.
- Ta bort den frystorkade produkten varje dag och registrera massan.
OBS: När massan av den frystorkade produkten inte längre förändras torkas produkten helt och kan förvaras vid -20 °C tills den är klar att användas.
- Ta bort den frystorkade produkten varje dag och registrera massan.
2. Tillverkning av kitosanhydrogel
- Tillsätt 2 ml 6% ättiksyra och 120 mg renad kitosan (steg 1) till en 10 ml Luer-lock-spruta för att bilda en 6% w / v chitosanlösning.
- Anslut Luer-lock-sprutan till en annan identisk spruta med en luerlåskontakt av hona och blanda lösningen fram och tillbaka i 30 s, eller tills kitosanen har lösts upp helt i ättiksyran.
- Innan tvärbindning, tillsätt något terapeutiskt eller bioaktivt medel till kitosanlösningen (om det behövs). För den aktuella studien tillsattes 200 ng SDF-1a och TGF-b3 (se materialtabell) till mikrogelerna.
OBS: SDF-1a och TGF-b3 är bioaktiva medel som är relevanta för regenerering av tillväxtplattvävnad. SDF-1a främjar migration av mesenkymala stamceller till defektplatsen, och TGF-b3 fungerar som en kondrogen faktor för att inducera differentiering av dessa stamceller längs den kondrogena härstamningen31.
OBS: Blanda chitosan igen mellan sprutorna för att helt införliva det terapeutiska. - Förbered 100 mM stamkorsbindningslösning av genipin (se materialtabell) i 100% etanol.
- Tillsätt 100 μL av den beredda genipinlösningen (steg 2.4) till den kitosanhaltiga sprutan och blanda igen fram och tillbaka mellan sprutorna i 30 s.
- Extrudera blandningen från sprutan på en 35 mm petriskål, täck den med paraffinfilm och inkubera den vid 37 °C över natten i en fuktad atmosfär.
OBS: Lösningen blir mörkblå, vilket indikerar att tvärbindningsreaktionen mellan chitosan och genipin har inträffat, vilket leder till bildandet av kitosanmikrogel. - Filtrera den beredda kitosanmikrogelen enligt stegen nedan.
- Bryt försiktigt hydrogelen i mindre bitar med en spatel.
OBS: Bitarna ska vara tillräckligt små för att överföras till baksidan av en 10 ml spruta, ~ 1-2 cm i diameter. - Placera ett filter med önskad maskstorlek på baksidan av en ren 10 ml spruta.
OBS: Det typiska storleksintervallet för mikrogeler är mellan 50-200 μm. - Överför de trasiga gelbitarna till sprutan som är försedd med filtret och tillsätt 6 ml ddH2O.
OBS: Kitosangelen sväller avsevärt i det vattenhaltiga mediet, så en stor förändring i gelvolymen förväntas. - Anslut sprutan via en Luer-lock-kontakt till en annan ren 10 ml spruta.
- Tvinga gel + vattenblandningen genom sprutan med filtret för att skapa mikrogeler med en angiven maximal diameter.
- Efter den första filtreringen öppnar du baksidan av sprutan som innehåller filtret och extruderar blandningen tillbaka till denna spruta.
- Sätt tillbaka sprutans baksida och tvinga blandningen genom filtret igen.
- Upprepa filtreringen 5-6x eller tills det finns lite motstånd genom filtret.
- Bryt försiktigt hydrogelen i mindre bitar med en spatel.
- Skölj och rena de filtrerade mikrogelerna.
- Överför den filtrerade gelblandningen till ett 50 ml koniskt rör, bringa den totala volymen upp till 20 ml medddH2Ooch virvla sedan blandningen för att säkerställa homogen dispersion.
- Centrifugera mikrogelerna vid 100 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och dekantera den övre vattenfasen.
- Resuspend mikrogelerna i 10 ml 70% etanol, virvel och placera under UV-ljus i 1 h för att sterilisera.
- Centrifugera mikrogelerna vid 1 000 x g i 5 min vid rumstemperatur, kassera etanolen och skölj 3x med ddH2O.
3. Beredning av mikrogeler för in vitro- eller in vivo-tillämpningar
OBS: För den aktuella studien studerades broskregenerering vid skador på tillväxtplattor i en råttmodell. Mer information finns i referens31.
- Resuspend mikrogelpellets 1:1 i ddH2O. Mikrogeler kan förvaras i upp till 1 månad suspenderade i ddH2Ovid 4 °C. Om ett bioaktivt medel används måste mikrogelerna användas omedelbart.
- Skapa skadestället i djuret efter en tidigare publicerad rapport30.
- Spola skadestället med saltlösning och håll antingen djuret obehandlat (för kontrollstudie) eller injicera endast chitosanmikrogelerna eller mikrogelerna laddade med de bioaktiva medlen (steg 3.2).
- Stäng såret i djuret och administrera postkirurgiska analgetika30.
- Vid dag 7 eller 28 efter operationen, avliva råttan genom CO2-överdosering , skär ut lemmarna och utför histologi för att bedöma vävnadsreparationen på skadestället31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik tillverkning av kitosanmikrogeler är beroende av tvärbindningsreaktionen mellan genipin och chitosan, speciellt involverande aminer på kitosanpolymerkedjorna. Till skillnad från andra mikrogeltillverkningstekniker kräver denna metod inte emulsioner eller lösningsmedelssköljningar och kan snabbt och enkelt utföras med billig utrustning. En kännetecknande indikator för framgångsrik mikrogeltillverkning är den distinkta färgförändringen från benvit till mörkblå efter att kitosan och genipin har blandats. Den tvärbindande reaktionen mellan genipin och amininnehållande föreningar, såsom kitosan eller andra proteiner, har karakteriserats väl i litteraturen34. Kort sagt anses tvärbindningsmekanismen vara en nukleofil attack av aminogrupperna av chitosan, i vilken genipin fungerar som en dialdehyd med stabila kondensationsprodukter35. De korta kedjorna av stabil, kondenserad genipin fungerar som tvärbindande broar mellan kitosanpolymererna. Tvärbindningsreaktionen får lösningen att bli mörkblå, troligen på grund av syreradikalinducerad polymerisation och dehydrogenering av mellanliggande föreningar, som följer ringöppningsreaktionen från nukleofil attack36.
När mikrogelerna har filtrerats och återsuspenderats i en 1: 1-vattenutspädning kan de enkelt användas i olika biomaterialapplikationer. Arbete har nyligen publicerats med hjälp av dessa emulsionsfria kitosanmikrogeler för att främja broskregenerering vid skador på tillväxtplattor. Mikrogelerna tillverkades enligt beskrivningen häri och hölls antingen tomma eller laddade med SDF-1a och TGF-b3, som är bioaktiva medel som är relevanta vid regenerering av tillväxtplattvävnad, med SDF-1a som främjar migration av mesenkymala stamceller till defektstället och TGF-b3 fungerar som en kondrogen faktor för att inducera differentiering av dessa stamceller längs den kondrogena härstamningen37, 38. Frisättningshastigheten för proteinerna kvantifierades in vitro via ELISA, och frisättningen av dessa molekyler upprätthölls över tiden31. Därefter injicerades mikrogelerna i en tillväxtplattaskada i en in vivo-råttmodell , och de injicerade mikrogelerna förhindrade tidig benstångsbildning in vivo31. Dessa injicerbara, kostnadseffektiva och lättproducerade kitosanmikrogeler kan lätt användas i många biomaterialapplikationer.
Även om denna process för mikrogeltillverkning har optimerats för enkel installation och applikationer, kan det fortfarande uppstå flera problem som forskare bör vara uppmärksamma på. Otillräcklig blandning av polymer- och tvärbindningskomponenterna är den mest troliga orsaken till olika resultat under tillverkningen. Den fasta kitosanen måste blandas kraftigt mellan sprutorna och den resulterande kitosanlösningen måste vara helt homogen innan genipin-tvärbindaren tillsätts. Om lösningen inte är homogen kommer de fasta kitosanbitarna som finns kvar i lösningen att bilda klumpar, och ojämn tvärbindning kommer att inträffa, vilket förhindrar effektiv filtrering och resulterar i polydispergerade mikrogeler med signifikant varierande diametrar. En annan viktig faktor att tänka på under tillverkningen är att undvika avdunstning under tvärbindningsperioden, vilket måste förhindras med paraffinfilm eller andra förångningstekniker. Om chitosanhydrogelen torkar ut sväller den inte under vattensköljningarna och den filtreras inte genom sprutan. Slutligen måste mikrogelerna suspenderas i överskottsvatten under filtreringsprocessen och förvaras i vatten vid 4 °C när de inte används. Mikrogelerna är inte extruderbara eller injicerbara om de inte är suspenderade i minst en 1:1-utspädning av vatten.
Figur 1 visar en bred översikt över tillverkningsprocessen för mikrogeler. Samma process visas igen i figur 2, som visar fotografier av processen och betonar protokollstegen som är svåra att förstå från text ensam. Figur 2D visar till exempel hur ett trådnätfilter sätts in i sprutan på 10 ml. När det väl sitter helt mot toppen av sprutan möjliggör detta trådnätfilter snabb och bekväm filtrering av kitosanmikrogelerna utan specialutrustning eller lösningsmedel. På samma sätt visar figur 2E flödet av hydratiserad kitosangel genom nätfiltret, vilket är grunden för mikrogeltillverkning. Figur 3 anpassades från vår tidigare publikation om dessa mikrogeler och visar deras pH-beroende svullnadsbeteende och skillnaderna i mikrogelernas storlek beroende på nätfiltrets porstorlek. Olika maskstorlekar kan beställas från tillverkaren, vilket möjliggör bekväm kontroll över mikrogelernas storlek. Denna exakta kontroll över mikrogelstorlek är mycket viktig vid utformning av läkemedelsleveranssystem med väldefinierade terapeutiska belastningsfrisättningshastigheter. Tidigare arbete med mikrogeler visade också att de bryts ned signifikant i närvaro av lysozym vid 2-4 veckor31. Slutligen visar figur 4 histologibilder31 i en råtttillväxtplatta skademodell behandlad med chitosanmikrogelerna laddade med SDF-1a och TGF-b3.
Figur 1: Schematisk översikt över tillverkning av kitosanmikrogeler. Figuren skapades med hjälp av biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fotografier av mikrogeltillverkningsprocessen. (B) Extrudering av kitosangel i en 35 mm petriskål. (C) Hämtning av kitosangel efter tvärbindande färgförändring från benvit till mörkblå. D) Uppifrån och ned-vy inuti sprutan som visar trådnätssikten som är monterad mot sprutans munstycke. (E) Chitosangel pressades genom ett nätfilter för att producera mikrogeler. (F) Mikrogeler lagrades i en 1:1-utspädning av ddH2O i ett koniskt rör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: pH-beroende svullnadsbeteende hos mikrogelerna. (B) Fluorescerande bilder av mikrogeler tillverkade med nät nr 200 (övre bild: < mikrogeler med storleken 75 μm) och nr 100 nät (nedre bilden: mikrogeler med storleken 75-150 μm). Figuren trycks om med tillstånd från referens31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Histologibilder i en råtttillväxtplatta skademodell behandlad med chitosanmikrogelerna laddade med SDF-1a och TGF-b3. 10x histologiska bilder som visar tillväxtplattans reparationsvävnad av intakt (A) och (E), obehandlad (B) och (F), mikrogelbehandlad (C) och (G), mikrogel + SDF-1a behandlad (D) och (H) och mikrogel + TGF-b3 behandlad (I ) lemmar. Inga dag 7 djur behandlades med microgel + TGFb3. Alcian blå hematoxylin (ABH) fläckar benet orange till rött, den fibrösa vävnaden rosa och brosket blått. Mikrogelen framträder som en mörkröd fibrösliknande vävnad. Skalstänger = 500 μm. Figuren trycks om med tillstånd från referens31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrogeler har undersökts i stor utsträckning de senaste åren på grund av deras höga tillämpbarhet för olika ändamål, såsom läkemedelsleverans eller cellinkapsling9. Den enkla tillverkningen av biomaterialkonstruktioner i mikroskala är av betydande relevans inom vävnadsteknik, eftersom det gör det möjligt för forskare att utveckla hydrogelbaserade strategier i en viss storlek och tidsskala. De flesta metoder för tillverkning av kitosanmikrogeler kräver emellertid dyr utrustning och reagenser, emulsioner eller cytotoxiska lösningsmedelssköljningar, vilket förhindrar deras översättning till klinisk användning 15,16,17,18,19,20. Dessa mikrogeler utmärker sig när det gäller deras betydande bekvämlighet med tillverkning, vilket inte kräver några emulsionstekniker eller lösningsmedelssköljningar. Dessutom behåller dessa mikrogeler de ideala egenskaperna för en vävnadskonstruerad konstruktion, såsom pH-beroende svullnad och läkemedelsbelastning, inställt nedbrytningsbeteende och ihållande frisättning av terapier.
Det mest kritiska steget i tillverkningen av dessa kitosanmikrogeler är filtreringen mellan sprutor. Dessa mikrogeler börjar som bulkhydrogel och filtreras till ett specifikt storleksintervall med hjälp av trådnätfilter. Utan filtrering skulle mikrogelernas tillämplighet, mekaniska egenskaper och läkemedelsfrisättningsegenskaper vara väsentligt annorlunda. Filtreringssteget möjliggör exakt kontroll över hydrogelernas storlek, och det möjliggör också tillverkning av mikrogeler med hög genomströmning som uppvisar pH-beroende svullnad och ihållande frisättning av terapier.
En begränsning av denna process är att filtreringssteget inte ledde till hydrogeler med en perfekt sfärisk form, vilket kan vara en viktig faktor att tänka på för vissa applikationer. Av denna anledning beskrevs mikrogelernas karakteristiska storlek med användning av Feret-diameter (Figur 3), vilket är användbart för kvantifiering av oregelbundet formade partiklar39. Även om mikrogelernas geometri inte var en perfekt sfär, var partiklarnas genomsnittliga storlek lätt att kontrollera baserat på sprutfiltrets maskstorlek, och för många applikationer är det inte nödvändigt att ha perfekt sfäriska partiklar. Mikrogelernas polydispersitetsindex (PDI) kvantifierades med användning av kvadratförhållandet mellan standardavvikelsen för Feret-diametern och den genomsnittliga Feret-diametern erhållen från en stor population av partiklar (n = 74). PDI beräknades som 0,076 med hjälp av ekvationen
PDI = (s/D)2
där s är standardavvikelsen för den genomsnittliga Feretdiametern och D är den genomsnittliga Feretdiametern40. På grund av filtreringen som gjordes under denna process och användningen av Feret-diametern för oregelbundet formade partiklar var polydispersitetsindexet för dessa partiklar ganska lågt, i den utsträckning de kunde betraktas som monodispers.
För framtida forskning kan flera modifieringar av detta protokoll göras för att bättre passa det givna forskningsbehovet. Till exempel har endast två proteiner, SDF1-a och TGF-b3, studerats för deras kontrollerade frisättning med dessa mikrogeler. Tidigare arbete har visat ihållande frisättning av dessa bioaktiva faktorer upp till ~ 30 dagar in vitro. Andra relevanta terapier, såsom nanopartiklar, RNA-störande (RNAi) molekyler, andra biologiska läkemedel eller småmolekylära läkemedel kan emellertid också undersökas för att kvantifiera deras frisättningshastighet och effekt när de appliceras med denna kitosanmikrogelteknik. En annan variabel som skulle kunna undersökas i framtiden är att ändra storleksintervallet på mikrogelerna, vilket görs helt enkelt genom att ändra sprutfiltrets maskstorlek. Detta kan också ha en betydande inverkan på frisättningshastigheten för terapier från mikrogelerna, vilket möjliggör bekväm kontroll över frisättningskinetik utan att ändra tvärbindningens kemi. Dessutom kan detta protokoll enkelt skalas upp med större sprutor och filter eller vakuumfiltreringstekniker för att producera stora mängder kitosanmikrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases vid National Institute of Health under tilldelningsnummer R03AR068087 och R21AR071585 och av Boettcher Foundation (#11219) till MDK. CBE stöddes av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
| Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
| Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
| Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
| Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
| Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |
References
- Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
- Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
- Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
- Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
- Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
- Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
- Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
- Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
- Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
- Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
- Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
- Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
- Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
- Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
- Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
- Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
- Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
- Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
- Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
- Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
- Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
- Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
- Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
- Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
- Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
- Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
- Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
- Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
- Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
- Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
- Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
- Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
- Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).
