Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Kenta Yamauchi; Shinichiro Okamoto; Megumu Takahashi; Masato Koike; Takahiro Furuta; Hiroyuki Hioki

doi:10.3791/63941

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Methodenartikel

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

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DOI:

10.3791/63941

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10. Mai 2022

Kenta Yamauchi¹^,² , Shinichiro Okamoto¹^,²^,³ , Megumu Takahashi¹^,²^,⁴^,⁵ , Masato Koike²^,³ , Takahiro Furuta⁶ , Hiroyuki Hioki¹^,²^,⁷

¹Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, ²Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, ³Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, ⁴Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, ⁵Japan Society for the Promotion of Science, ⁶Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, ⁷Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Zusammenfassung

Hier wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um neuronale Strukturen von mesoskopischen bis hin zu mikroskopischen Ebenen im Hirngewebe sichtbar zu machen. Neuronale Strukturen, die von neuronalen Schaltkreisen bis hin zu subzellulären neuronalen Strukturen reichen, werden in Maus-Gehirnschnitten visualisiert, die mit ScaleSF optisch gelöscht wurden. Diese Clearing-Methode ist eine modifizierte Version von ScaleS und ist eine hydrophile Gewebereinigungsmethode für Gewebeschnitte, die eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Erhaltung von Fluoreszenzsignalen und struktureller Integrität erreicht. Eine anpassbare dreidimensionale (3D)-gedruckte Bildgebungskammer wurde für die zuverlässige Montage von gereinigtem Hirngewebe entwickelt. Mäusegehirne, denen ein Adeno-assoziierter Virusvektor injiziert wurde, der ein verbessertes grün fluoreszierendes Proteingen trägt, wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit einem vibrierenden Gewebeschneider in Scheiben von 1 mm Dicke geschnitten. Die Gehirnschnitte wurden unter Befolgung des Clearing-Protokolls gereinigt, das sequentielle Inkubationen in drei Lösungen, nämlich Sca l eS0-Lösung, Phosphatpufferkochsalzlösung (–) und ScaleS4-Lösung, für insgesamt 10,5-14,5 h umfasst. Die gereinigten Hirnschnitte wurden auf die Bildgebungskammer montiert und in 1,5%iges Agarosegel eingebettet, gelöst in ScaleS4D25(0)-Lösung. Die 3D-Bildaufnahme der Scheiben erfolgte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand ausgestattet war. Beginnend mit der mesoskopischen neuronalen Bildgebung ist es uns gelungen, feine subzelluläre neuronale Strukturen, wie dendritische Stacheln und axonale Boutons, in den optisch gereinigten Hirnschnitten sichtbar zu machen. Dieses Protokoll würde das Verständnis neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen erleichtern.

Einleitung

Gewebereinigungsmethoden haben die tiefenunabhängige Bildgebung biologischer und klinischer Proben mit Lichtmikroskopie verbessert, so dass strukturelle Informationen über intaktes Gewebe extrahiert werden^können ^1,2. Optische Clearing-Techniken könnten möglicherweise auch die Kosten für die histologische Analyse beschleunigen und senken. Derzeit stehen drei Hauptclearing-Ansätze zur Verfügung: hydrophile, hydrophobe und hydrogelbasierte Methoden ^1,2. Hydrophile Ansätze übertreffen die Fluoreszenzsignale und die Gewebeintegrität und sind im Vergleich zu....