Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Resumen

Se describe un ensayo cualitativo para la adhesión de la levadura y la invasión de agar como una medida de la diferenciación y la invasión pseudohyphal. Este ensayo simple se puede utilizar para evaluar el fenotipo invasivo de distintos mutantes, así como las señales de los efectos ambientales y las vías de señalización en la diferenciación de la levadura.

Resumen

Las levaduras se encuentran en las biopelículas naturales, donde muchos microorganismos colonizan las superficies. En ambientes artificiales, como las superficies de los objetos artificiales, los biofilms pueden reducir la productividad industrial, destruir las estructuras, y poner en peligro la vida humana. 1.3 Por otra parte, aprovechando el poder de biofilms pueden ayudar a limpiar el medio ambiente y la generación de energía sostenible. 8.4 La capacidad de S. cerevisiae para colonizar las superficies y participar en las biopelículas complejo fue ignorada hasta que el redescubrimiento de los programas de diferenciación provocada por diferentes vías de señalización y las señales ambientales en este organismo. 9, 10 El continuo interés en el uso de S. cerevisiae como organismo modelo para comprender la interacción y convergencia de las vías de señalización, como el Ras-PKA, MAPK Kss1 y Hog1 vías osmolaridad, pone rápidamente de S. cerevisiae en el cruce de la biopelícula la biología y la investigación de la transducción de señales. 20.11 En este sentido, la diferenciación de células de levadura en un largo, filamentos de adhesivo, se convirtió en pseudohyphal una lectura conveniente para la activación de vías de transducción de señales a los diversos cambios ambientales. Sin embargo, filamentación es un conjunto complejo de fenotipos, lo que hace analizando para ello, como si se tratara de un fenotipo engañoso simple. En la última década, varios ensayos se adoptaron con éxito de los estudios de biofilm de bacterias a la investigación de levadura, tales como los ensayos de la formación de MAT para medir la expansión de colonias en agar blando y cristal violeta para medir cuantitativamente la adherencia de la superficie celular. 12, 21 Sin embargo, ha habido cierta confusión en los ensayos desarrollados para evaluar cualitativamente los fenotipos adhesivo e invasiva de la levadura en agar. A continuación, presentamos un método sencillo y fiable para evaluar la calidad del adhesivo e invasiva de las cepas de levadura con fácil de entender, las medidas necesarias para aislar la evaluación de la adherencia de la evaluación de la invasión. Nuestro método, adoptado a partir de estudios anteriores, 10, 16 y afecta las células que crecen en medios líquidos y placas en las condiciones diferenciales de nutrientes para el crecimiento de grandes manchas, que luego lave con agua para evaluar la adhesión y frote las células completamente fuera de la superficie del agar para evaluar la invasión en el agar. Se elimina la necesidad de rayar las células en agar, que afecta a la invasión de las células en el agar. En general, hemos observado que las cepas haploides que invaden agar siempre adhesiva, sin embargo, no todas las cepas adhesivo puede invadir un medio de agar. Nuestro enfoque se puede utilizar en combinación con otros ensayos para analizar cuidadosamente los pasos y los requisitos de diferenciación de la transducción de señal de la levadura, la diferenciación, la detección de quórum, y la formación de biofilm.

Protocolo

1. Ponga 200ul de las culturas de creciente interés en las placas de los medios de comunicación sintética con las condiciones requeridas hambre (SC con glucosa al 2% frente al SC con 0,2% de glucosa, por ejemplo) Si la densidad de las culturas son muy diferentes el uno del otro, ajustar el recuento de células por cultivo 200ul por lo que cada gota tiene aproximadamente la misma cantidad de células.
2. Asegúrese de mantener registros de las que caen en las placas es que la cultura.
3. Mantenga la tapa entreabierta placa y dejar bien a temperatura ambiente oa 30 ° C hasta que las gotas se seca.
4. Placas de sellado con parafilm y envoltorio plástico (opcional) y deja....

Discusión

Las células de levadura mostrar los diversos modos de diferenciación de acuerdo a la disponibilidad de nutrientes y las condiciones ambientales, incluyendo la formación de esporas bajo condiciones de hambre y el estrés, filamentación en diversas tensiones de nutrientes, y la floculación. Levaduras diferentes, incluyendo S. cerevisiae y C. albicans, también se puede encontrar en los biofilms formados por un conjunto diverso de microorganismos. Aunque hay una cierta correlación con filamentación y comportamiento invasivo, no está claro exacta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Moticam 350	Cámara	Motic	descatalogado (nuevo modelo: Moticam 352)	Una cámara relativamente económica que se conecta a los oculares de microscopios y captura imágenes digitales para PC o Mac.