Summary
Här presenteras en kostnadseffektiv och transportabel metod/anläggning för att mäta den primära produktiviteten hos mikrobiella mattor under faktiska in situ miljötemperaturer och ljusförhållanden. Den experimentella installationen är baserad på allmänt tillgängliga material och kan användas under olika förhållanden samtidigt som den erbjuder fördelarna med laboratoriebaserade modeller.
Abstract
Mätning av perifytons primära produktivitet in situ under växtsäsongens gradient kan belysa den kvantitativa effekten av miljöfaktorer (främst fosforkoncentration och ljusintensitet) och artsammansättning på primärproduktiviteten. Primärproduktiviteten drivs huvudsakligen av ljusintensitet, temperatur, tillgång på näringsämnen och fördelning av karbonatsystemets jonarter i respektive djup i den eufotiska zonen. Det är ett komplext system som är mycket svårt att simulera i laboratoriet. Denna billiga, transportabla och lättbyggda flytande pråm gör det möjligt att mäta den primära produktiviteten exakt - direkt under de faktiska naturliga förhållandena. Metoden bygger på att mäta den primära produktiviteten i realtid med hjälp av icke-invasiva syresensorer integrerade i tätt förseglade glasburkar, vilket möjliggör övervakning av syreflöde online och ger nya insikter om metaboliska aktiviteter. Detaljerade säsongsbetonade in situ-mätningar av bruttoprimärproduktiviteten hos mikrobiella mattor (eller andra bentiska organismer) kan förbättra nuvarande kunskap om de processer som styr primärproduktivitetsdynamiken i lentiska vatten.
Introduction
Primärproduktivitet är den enda inträdet av autoktont kol i de vattenlevande system som bildar hela systemets näringsväv1. Därför är en korrekt uppskattning av primärproduktiviteten ett viktigt steg mot att förstå hur akvatiska ekosystem fungerar. Kustnära zoner är områden med hög primärproduktivitet och biologisk mångfald. Förutom växtplankton antas perifyton (nedan kallade mikrobiella mattor) och makroalger avsevärt bidra till primärproduktiviteten i kustzonerna2. På grund av deras sessila livsstil och betydande rumsliga heterogenitet är kvantifiering av primärproduktiviteten inte trivial.
Primärproduktiviteten drivs huvudsakligen av ljusintensitet, temperatur, tillgång på näringsämnen och fördelning av karbonatsystemets jonarter i respektive djup i eufotiska zoner 3,4. Djupet påverkar markant den rumsliga fördelningen av mikrobiella mattor. Mikrobiella samhällen måste hantera de negativa effekterna av hög bestrålning och uttalade säsongstemperaturvariationer i grunda djup och med lägre ljusintensitet på större djup. Förutom djupgradienten genererar dynamiska trofiska interaktioner flera och komplexa rumsliga mönster i olika skalor5. Detta komplexa system är komplicerat att simulera i laboratoriet. Det mest exakta sättet att dra slutsatser om den metaboliska aktiviteten hos enskilda primärproducenter från kustnära zoner är att inrätta in situ-experiment.
Metoden som introduceras i detta dokument är baserad på den traditionella kammarmetoden 2,6,7, tillsammans med en transportabel och lättbyggd billig flytande pråm. Detta möjliggör mätning av primärproduktivitet på olika djup under det naturliga ljusspektrumet, temperatur, och olika fördelning av karbonatsystemets joniska arter med djupet. Metoden bygger på principen om ljus kontra mörk flasksyre, som först användes för att mäta växtplanktonfotosyntes 6 och fortfarande är vanligt förekommande 6,7. Den jämför graden av förändring av syre i flaskor som hålls i ljuset (vilket inkluderar effekterna av primärproduktivitet och andning) med de som hålls i mörkret (endast andning)8. Metoden använder syreutveckling (fotosyntes) som en proxy för primär produktivitet. De uppmätta variablerna är ekosystemets nettoproduktivitet (NEP, som en förändring i O2-koncentrationen över tid under ljusförhållanden) och ekosystemets andning (RE, som en förändring iO2-koncentrationen över tiden i mörker). Bruttoekosystemproduktivitet (GEP) är beräkningen av skillnaden mellan de två (tabell 1). Termen "ekosystem" används här för att beteckna att periphyton består av autotrofa och heterotrofa organismer. Den mest betydande förbättringen av denna traditionella kammarmetod är att använda icke-invasiva syreoptiska sensorer och optimering av denna främst planktoniska metod för att mäta perifytisk primärproduktivitet.
Tekniken beskrivs i exemplet att mäta mikrobiella mattor i kustzonen i nyuppkomna post-mining sjöar i Tjeckien-Milada, Most och Medar. Den metaboliska aktiviteten hos mikrobiella mattor bestäms med hjälp av direkt in situ-mätning avO2-flöden som utförs direkt på specifika djup, där de studerade samhällena naturligt förekommer. Heterotrofisk och fototrofisk aktivitet mäts i slutna glasflaskor utrustade med icke-invasiva optiska syresensorer. Dessa sensorer detekterar partialtrycket av syre med hjälp av fluorescensen hos ljuskänsliga färgämnen. Flaskorna med mikrobiella mattor suspenderas och inkuberas på en flytande anordning på lämpligt djup. Syrekoncentrationen inuti flaskorna mättes kontinuerligt under dagsljusperioden från den lilla båten.
Prover av intakta mikrobiella mattor samlas in och placeras i gastäta inkubationsflaskor på bestämda djup av dykare. Varje flaska är utrustad med en icke-invasiv optisk syremikrosensor, som övervakar O2-produktiviteten / förbrukningen över tid. Alla mätningar görs i fem replikerade mörka/ljusa par i varje djup. Temperaturen och den fotosyntetiskt aktiva strålningsintensiteten (PHA) mäts på respektive djup under hela inkubationen. Efter 6 timmars inkubation på plats (dagsljus) skördas de mikrobiella mattorna från flaskorna och torkas. O2-flöden normaliseras till mikrobiell biomassa. Som en kontroll korrigeras flöden för förändringar i O2-koncentrationen i separata ljusa och mörka gastäta flaskor (tomma kontroller) som innehåller sjövatten utan mikrobiell mattbiomassa. Nedan följer detaljerade instruktioner för att bygga den flytande pråmen och utföra hela experimentet steg för steg. Detta dokument presenterar också representativa resultat från mätningarna av mikrobiella mattor på två djup (1 m och 2 m), med fem replikat på varje djup. Faktisk temperatur och ljusintensitet mättes under hela experimentet med hjälp av dataloggers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Innan du samplar, bestäm graden av replikeringar baserat på de övergripande projektbehoven, statistisk design eller förväntad mängd provvariation. Fem replikatpar av ljusa och mörka inkubationsflaskor föreslås för exakt statistisk analys och för att ta hänsyn till potentiell provförlust eller brott. Den beskrivna flytande experimentpråmen är konstruerad för att bära fem replikat plus ett par blankkontroller. Se figur 1 för en teknisk ritning av experimentpråmen.
Figur 1: Tekniska ritningar av experimentpråmen och sidoflottören. (A) Ovanifrån: pråmens ram består av fyra aluminiumvinkel L-profilstycken (blå) som är sammanfogade med fyra platta aluminiumstänger (grå). XPS-flottörer (rosa) monteras på ramen vid två punkter, var och en på de parallella aluminiumbitarna. Kedjor för inkubationsflaskor fästs på ramen på båda sidor med snäppkrokar i förborrade hål (röda pilar) med 550 mm avstånd mellan dem. Kedjor var försedda med snäppkrokar på 1 m och 2 m avstånd för inkubationsflaskfäste (välj snäppkrokarnas position enligt experimentdjupet). Betongankaret fästs i pråmens båge, där ett överhäng på 25 mm gör att två förborrade hål (gula pilspetsar) kan fungera som fästpunkt för ankarets kedja och forskningsfartyg. Ramen monteras eller demonteras enkelt via de parallella fogarna mellan de fyra aluminiumvinkelstyckena (gröna pilspetsar). (B) Sidovyn visar de upphängda kedjorna med hängande inkubationsflaskor och betongankare (brun fyrkant). (C) Sidan XPS-flottör: Parallellaluminiumvinkel L-bitar (blå) förenas med vertikala aluminiumplatta stänger (grå). Under tvärstångssektionen är XPS-flottören (rosa) monterad med nödvändiga hålstorlekar angivna (4 mm). De upphängda kedjorna fästs med snäppkrokar i 8 mm hål (röd pilspets). Vid pråmens båge borras två 8 mm hål i det överhängande aluminiumet, ett för att säkra ankaret till pråmen (gul pilspets) och ett annat för att förtöja forskningsfartyget till pråmen (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Konstruktion av försökspråmen
OBS: Den flytande pråmen består av två lika stora sektioner monterade tillsammans, vilket möjliggör enkel montering / demontering. Alla begagnade delar kan köpas på vilken hobbymarknad eller butik som helst som säljer byggmaterial.
- Montera först pråmens ram genom att sammanfoga fyra L-profilstycken med aluminiumvinkel (40 mm x 40 mm x 3 mm; längd på 2 000 mm) med fyra platta aluminiumstänger (40 mm x 3 mm x 350 mm), 16 skruvar (4 mm x 15 mm med sexkantiga muttrar) och 32 brickor (4 mm x 10 mm).
OBS: De plana stängernas avstånd och position visas i den tekniska ritningen i figur 1A. Den detaljerade fastsättningen av flottörerna på de plana sidostängerna visas i figur 1B. - För att sammanfoga de två lika stora sektionerna av ramen, använd fyra 4 mm x 15 mm skruvar med vingmuttrar och åtta 4 mm x 10 mm brickor för att skruva ihop aluminiumvinkel L-profilerna i ändarna (figur 1A, gröna pilar).
- Använd fem bitar av extruderad polystyren (XPS) -material (500 mm x 200 mm x 150 mm), tio 10 mm x 170 mm skruvar med sexkantiga muttrar och tjugo 10 mm x 50 mm brickor för att förbereda fem extruderade polystyrenflottor (500 mm x 200 mm x 150 mm vardera). Fäst flottörerna på ramen vid fem punkter som visas i den tekniska ritningen (figur 1A).
- Borra hål i ramen (se röda pilar i figur 1A som markerar hålens positioner och avstånd för kedjorna). Fäst 12 m stålkedjorna (tråddiameter på 3 mm, invändig länk på 5,5 mm x 26 mm) för inkubationsflaskorna på hålen i ramen med stålkarbinkrokar (50 mm x 5 mm). Förse varje kedja med par snäppkrokar (50 mm x 5 mm) för att installera inkubationsflaskorna till önskat djup enligt experimentell design. I det här fallet satt de på 1 m och 2 m djup.
- För ankaret fyller du 15 L hinken med betong. Sätt i en ögonbult i betongen och låt den torka ostört. Fäst 5 m stålkedjan på kroken. Fäst ankaret i det förborrade hålet på pråmens båge (markerat med gula pilar i figur 1A,B).
OBS: Tekniska ritningar med monteringsbeskrivningen visas i figur 1A-C. Figur 2 visar bilden av den monterade experimentpråmen. Figur 3 visar inkubationsflaskornas fastsättning i kedjan.
Figur 2: Monterad experimentpråm. Fotografi av den monterade experimentpråmen. Röda pilspetsar visar hålen för fastsättning av kedjor med inkubationsflaskor. De gröna pilspetsarna pekar på var de två halvorna av flottören är sammanfogade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Inkubationsflaskor. Foto av två par mörka och ljusa inkubationsflaskor som hänger på ett djup av 1 m. Ett par flaskor innehåller provet av intakta mikrobiella mattor som fortfarande växer på stenen (röd pilspets). Den andra är den tomma flaskan med sjövattnet från respektive djup. En gul pilspets pekar på syresensorplatsen fäst vid inkubationsflaskans innervägg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Installation i fält
- Användning av en uppblåsbar kajak föreslås för pråmplacering och genomförande av experiment eftersom den är lätt att transportera.
- Välj en plats med ett idealiskt djup för att förankra flottören. Välj djupet så att de nedre inkubationsflaskorna är minst 2 m över botten för att undvika att störa sedimentet i vattenkolonnen runt inkubationsflaskorna.
- Fäst den monterade pråmen bakom båtens akter. Sänk försiktigt ankaret längs båtens sida och rikta in det så att det hänger något under vattenytan så att flottören enkelt kan bogseras tillsammans med ankaret till platsen med önskat djup.
- Lossa ankaret från båten, sänk det till botten och säkra pråmen till ankarkedjan.
- Säkra kedjorna för att fästa inkubationsflaskorna på pråmen.
3. Inkubationsflaska förberedelse
- Använd de genomskinliga bredhalsade 0,5 L-flaskorna med gastäta tätningar.
OBS: Det är möjligt att justera storleken på flaskorna men kom ihåg att öka flytningen av pråmen med fler polystyrenark också. Pråmen som beskrivs här kan på ett tillförlitligt sätt bära 24 0,5 L glasflaskor. - Fäst de syreoptiska sensorfläckarna på varje flaskas innervägg.
- Lägg ett ogenomskinligt lager på de mörka behandlingsflaskorna genom att förpacka dem med svart elektrisk tejp.
- Skär ett litet hål på platsen med den optiska sensorn. För att förhindra att ljus kommer in i flaskan, gör hålet något mindre än sensorns diameter.
OBS: Alla ogenomskinliga lager som förhindrar att ljus kommer in i flaskan fungerar också. Fördelen med svart elektrisk tejp är att den motstår nötning och inte skalar av i vatten.
4. Insamling och hantering av prover
OBS: Dykare utför manuell insamling av prover på djupare vatten. På grunt vatten kan det göras genom snorkling eller vadning.
- Placera inkubationsflaskorna i den bärbara lådan.
- Dyk med lådan till respektive djup. Undvik att störa sedimentet i det omgivande vattnet.
- Fyll inkubationsflaskorna med proverna försiktigt. Försök att störa provets biomassa så lite som möjligt, till exempel genom att använda en lång pincett. Om de mikrobiella mattorna växer på en fast yta, till exempel en liten sten, överför försiktigt hela stenen med intakt biomassa till flaskan.
OBS: Undvik att samla stora stenar när provtagningsmattor växer på stenar - glasflaskorna kan brytas under ytterligare manipulation. - Fyll ett par ljusa/mörka flaskor med rent vatten från respektive djup för att fungera som tomma kontroller.
OBS: Flaskorna utan periphytonprovet fungerar som en kontroll som bestämmer syreproduktionen / förbrukningen av omgivande vattenorganismer. Det säkerställer att den beräknade netto- eller bruttoprimärproduktiviteten för perifyton är opartisk. - Se till att vattnet i alla inkubationsflaskor är rent och inte innehåller något störande sediment.
- Stäng flaskorna och ta dem till båten förankrad i den flytande pråmen.
5. Mätning av primärproduktiviteten
OBS: Personen som sitter i båten tar lådan från dykaren och utför följande steg.
- Fäst de två första paren inkubationsflaskor på snäppkrokarna på den första kedjan.
- Mät den initiala syrekoncentrationen i varje flaska med hjälp av den fiberoptiska syremätaren. Fäst mätarens optiska kabel på syresensorn monterad inuti flaskan och läs omedelbart (inom några sekunder) ut O2-koncentrationen kontaktlös (genom flaskväggen). Registrera det uppmätta värdet.
OBS: Hanteringstiden är kort; Från att ta flaskorna från dykarna till den ursprungliga inställningen till respektive djup tar det bara några minuter. - Omedelbart därefter, sänk försiktigt kedjan med de bifogade flaskorna tillbaka i vattnet. Se till att inkubationsflaskorna placeras på samma djup som provsmakningen av biomassan som placerades i dem.
- Gör en ny mätning från fartyget efter 1 h (se OBS nedan). Dra försiktigt in varje kedja med flaskorna i båten, läs av syrevärdet genom att fästa den optiska kabeln på sensorn och sänk ner proverna i vattnet igen.
OBS: Justera tiden mellan enskilda mätningar under inkubationen enligt intensiteten av O2-produktivitet / förbrukning av prover för att undvika övermättnad av flaskor. - Upprepa denna procedur minst fyra eller fem gånger med alla par flaskor.
OBS: Hela installationen av experimentet i fältet visas i figur 4.
Bild 4: Schema över experimentell installation i fältet. Illustration av den förankrade experimentpråmen på sjöytan. Inkubationsflaskorna (0,5 L) med mikrobiell mattbiomassa hängs på två olika djup (1 m och 2 m). Dykarna samlade prover av mikrobiella mattor direkt i inkubationsflaskorna på lämpliga djup. Syrekoncentrationen i enskilda flaskor mäts från fartyget. Flaskorna dras upp ur vattnet. Syrekoncentrationsvärdet mäts på några sekunder genom att fästa en optisk kabel på syresensorn. Flaskorna sänks sedan försiktigt tillbaka i vattnet. Hela proceduren för att mäta två par inkubationsflaskor från två djup tar ~ 2 min.
6. Provanalyser
- Efter mätningarnas slut tar du proverna direkt från flaskorna och överför biomassan i mikrobiell matta till de små plastkolvarna. Om mattorna växer på fasta underlag (t.ex. stenar), skrubba dem med en tandborste eller en liten kniv.
- I laboratoriet filtrerar du varje replikat genom förvägda glasfiberfilter för att bestämma torrvikten9.
7. Analys av data
- Under inkubationsperioden mäter du syrekoncentrationen i de ljusa och mörka flaskorna och jämför den med syrekoncentrationen i vattenkolonnen när flaskorna är fyllda.
OBS: Förändringen i syre i ljusflaskan över tid är det kombinerade resultatet av bruttoekosystemproduktivitet (GEP) och andning av alla organismer i flaskan (autotrofer och heterotrofer från det omgivande vattnet och det perifytiska samhället). Minskningen av syre i den mörka flaskan mäter andningsförlusterna hos både autotrofer och heterotrofer. Förändringen i syrekoncentrationen i kontrollen (dvs flaskor utan periphyton) är endast en produkt av heterotrofa eller autotrofa organismer i det omgivande vattnet. Perifytonproduktivitet och andning uppskattades genom att subtrahera omgivande vattenproduktivitet och andning mätt i tomma inkubationsflaskor. - NoteraO2-koncentrationen i procent syremättnad (dvs. kalibrera syresensorerna till 0% och 100% syremättnad). Innan du uppskattar den primära produktiviteten ska du konvertera rådata (
) till någon rimlig enhet.
OBS: I denna studie omvandlas data till mmol avO2 per gram organiskt material (OM) av perifytonmassan vid torrviktsbasen, enligt Benson och Krause10.- Beräkna omvandlingen med ekvation (1):
(1)
Där Cp är O2-koncentration i vatten (mg (O2) L-1) när den är helt mättad medO2, VFlaska är flaskans volym i ml, VStenar är volymen som upptas av stenen i ml, är vikten av perifytonmassan i g och 32 är molvikten avO2. - Beräkna Cp med ekvation (2):
(2)
Där Cs är standard O2-koncentrationen, P är atmosfärstrycket vid sjöytan, Pw är partialtrycket för vattenångan vid sjöytan och ω är vattentätheten. - Beräkna Cs, ω, P och Pw från tidigare definierade empiriska ekvationer (3-6) när sjöhöjd (h i km) och vattentemperatur vid sjöytan (t i °C) är kända:
(3)
(4)
(5)
(6)
OBS: Från ekvationer (1-6) är det uppenbart att den beräknade O2-koncentrationen är mest exakt för grunda djup. När djupet ökar blir den beräknade koncentrationen mer partisk när det gäller absolut koncentration. Det är optimalt när förändringshastigheten för syrekoncentrationen längs djupet är känd för varje sjö så att den absolutaO2-koncentrationen kan korrigeras vid behov. När O2-koncentrationen har beräknats kan dess förändring över tiden användas för att beräkna två olika flöden avO2 vid två olika förhållanden. Under ljusförhållanden är nettoekosystemproduktiviteten (NEP) direkt proportionell mot förändringen iO2-koncentrationen över tid (se nedan). Termen "ekosystem" används här för att beteckna att periphyton består av autotrofa och heterotrofa organismer. I mörkret är förändringen iO2-koncentration över tid proportionell mot summan av andningsförluster av autotrofa och heterotrofa organismer, vilket definierar ekosystemandning (RE). Skillnaden mellan NEP och RE definierar bruttoekosystemproduktiviteten (GEP). Om andningsförlusterna i den heterotrofa delen av samhället är försumbara blir GEP lika med bruttoproduktiviteten i ekosystemet.
- Beräkna omvandlingen med ekvation (1):
- Bestäm förändringshastigheten förO2-koncentrationen över tiden genom tredje gradens polynomregression, som visas i ekvation (7).
(7)
Där A 0 ärO2 koncentration vid tid noll och A 1-A2 är koefficienter för polynomregression.
OBS: Polynomfunktionen används eftersom den kan fungera som en approximation av vilken differentialekvation som helst. Således är det inte nödvändigt att känna till det exakta funktionella förhållandet mellanO2-koncentration och tid. Därför behöver inga antaganden som är förknippade med det funktionella förhållandet (t.ex. linjäritet) kontrolleras. Per definition definierar den andra termen för polynomregression, A1, förändringshastigheten för O2-koncentrationen vid tiden noll (dvs omedelbar hastighet), som är oberoende av A0 och därmed den absoluta O2-koncentrationen vid tiden noll. Av den anledningen påverkas inte uppskattningen av O2-flödet av den bias i absolutaO2-koncentrationsberäkningar som orsakas av tryckförändring över djupgradienten. A 1 har enheternaO2 (mmol g(OM)-1) per gång (1 h i denna studie).- Beräkna A1, beräknat separat för flaskor med och utan exponering för ljus och som innehåller mikrobiell mattbiomassa (dvs. V Stones > 0) och för kontrollflaskor med och utan exponering för ljus och som innehåller fritt vatten (dvs. V Stones = 0).
OBS: Genom att tilldela dessa olika regressionskoefficienter notationer
, , , respektive 
, 
kan ekvationen (8) för produktivitet GEP-beräkning skrivas som:
(8.1)
(8.2)
(8.3)
Termen
definierar nettoekosystemproduktivitet (figur 5A; dvs. nettosyreproduktivitet ), och termen 
representerar summan av autotrofisk och heterotrofisk andning (figur 5B; RE, dvs förutsatt att båda andningsorganen är likartade under mörka och ljusa förhållanden). - Subtrahera R från NEP för att erhålla GEP (figur 5C).
OBS: Ekvation (8) förutsätter implicit att och är både positiva och och båda är negativa. Om det är positivt, kontrollera rådata noggrant för outliers . kan vara teoretiskt negativa eftersom andningsförlusterna orsakade av heterotrofisk aktivitet kan vara högre än fotosyntetisk aktivitet.
- Beräkna A1, beräknat separat för flaskor med och utan exponering för ljus och som innehåller mikrobiell mattbiomassa (dvs. V Stones > 0) och för kontrollflaskor med och utan exponering för ljus och som innehåller fritt vatten (dvs. V Stones = 0).
) till någon rimlig enhet.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
, , , respektive 
, 
kan ekvationen (8) för produktivitet GEP-beräkning skrivas som:
(8.1)
(8.2)
(8.3)
definierar nettoekosystemproduktivitet (figur 5A; dvs. nettosyreproduktivitet ), och termen 
representerar summan av autotrofisk och heterotrofisk andning (figur 5B; RE, dvs förutsatt att båda andningsorganen är likartade under mörka och ljusa förhållanden).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5: Netto- och bruttoekosystemproduktivitet för mikrobiella mattor under dagsljus. (A) Produktivitet i ekosystemet med lätt flaska/nät: tidsförloppsdata för nettosyreproduktiviteten hos mikrobiella mattor från ljusflaskorna. Syrekoncentrationsförändringen i inkubationsflaskor mättes efter 1 timme under dagsljus. Grå cirklar: flaskor med prover av mikrobiella mattor. Vita cirklar: tomma flaskor med endast sjövatten. (B) Mörk flaskandning: summan av autotrofisk och heterotrofisk andning från de mörka flaskorna. Förändringen i syrekoncentrationen i inkubationsflaskor mättes efter 1 timme under dagsljusperioden. Grå cirklar: flaskor med prover av mikrobiella mattor. Vita cirklar: tomma flaskor med endast sjövatten. (C) Jämförelse av nettoekosystemets produktivitet, andning och bruttoekosystemproduktivitet: subtrahering av andningshastigheter från nettoproduktivitetsnivåer för ekosystem resulterar i bruttoekosystemproduktivitet för biomassan för mikrobiella mattor. Förkortningar: NEP = nettoekosystemproduktivitet; RE = andning; GEP = bruttoproduktivitet i ekosystemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett schema för den experimentella inställningen av flytande pråm och inkubationsflaskor visas i figur 1, figur 2 och figur 3. Figur 4 visar hur experimentet kan ställas in i fält. Figur 5 visar den representativa datauppsättning som används för att beräkna den slutliga netto- och bruttoproduktiviteten i ekosystemet. I figur 5A visas förändringen i O2-koncentrationen (dvs. omräknad till mmol (O2) g(OM)-1) över tid för flaskor med (betecknat som "prov") eller utan (betecknad som "kontroll") de mikrobiella mattor som utsattes för ljus. Ökningen avO2-koncentrationen är uppenbar i kontrollen såväl som i provet. Ändå är lutningen av ökningen betydligt högre i flaskor med mikrobiella mattor. Det visar att signalen från den mikrobiella mattaktiviteten är detekterbar mot bakgrunden.
Detsamma gäller data från flaskor som förvaras i mörker, som visas i figur 5B. I detta fall är emellertid lutningen av O2-koncentrationsförändringen över tiden i kontrollen inte signifikant annorlunda än noll. Figur 5C visar produkterna av data som visas i figur 5A,B, nettoekosystemproduktiviteten (NEP) respektive andningen (RE). Per definition måste den första vara positiv och den senare negativ. Uppgifterna överensstämmer med definitionen väl. Summan av NPP och RE är då bruttoekosystemproduktiviteten (GEP). Observera att felet i GEP ökar eftersom det är kvadratroten av de kvadratiska summorna av fel som beräknats för NEP och RE. Varje mäthändelse producerar en serieO2-koncentrationer över dagsljus för var och en av de övervakade inkubationsflaskorna, vilket är grunden för att uppskatta netto- och bruttoekosystemproduktiviteten. Figur 5A visar tidsförloppsdata för nettosyreproduktivitet (fotosyntes och andning) av mikrobiella mattor från ljusflaskorna. Figur 5B visar tidsförloppsdata för andning av mikrobiella mattor från mörka flaskor. Att subtrahera andningsfrekvenser från ekosystemets nettoproduktivitet ger nivåerna för ekosystemets bruttoproduktivitet (figur 5C). Figur 6 visar resultaten från den praktiska tillämpningen av metoden i fältet. Den perifytiska samhällets bruttoekosystemproduktivitet mättes i tre sjöar efter gruvdrift i Tjeckien under vegetationssäsongen.
Figur 6. Bruttoekosystemproduktivitet av periphyton i tre sjöar efter gruvdrift. Exempel på säsongsvariationer i bruttoekosystemproduktiviteten (GEP) för perifytonbiomassa i tre sjöar efter gruvdrift i Tjeckien (Milada, Most, Medard). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Uppskatta | |||
| Experimentell enhet | O2 flödesproxy | μmolO2 g OM1 h-1 | SE |
| Lätt flaska | Nettoproduktivitet i ekosystemet (NEP) | 38.6 | 1.98 |
| Mörk flaska | Ekosystemets andning (RE) | -18.1 | 2.3 |
| Bruttoekosystemets produktivitet (GEP) | 53.8 | 13.6 | |
Tabell 1: En sammanfattande resultattabell. Resultaten av den linjära regressionen beräknas som medelvärde och standardfel. Genomsnittliga uppskattningsvärden från fem replikat av mörka och ljusa inkubationsflaskor. SE = standardfel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs i detta dokument är baserad på principen om ljus- och mörkflaskans syreteknik i kombination med den icke-invasiva tekniken för att mätaO2-koncentration med optiska syresensorer. Detta system möjliggör parallell mätning av olika inkubationsinställningar eftersom den optiska fibern för mätning avO2 snabbt kan flyttas från flaska till flaska. De bentiska samhällena från olika djup kan skilja sig åt i taxonomisk sammansättning och produktivitet; Att samtidigt mäta dem parallellt kan spara tid och göra resultaten mer exakta, vilket möjliggör beräkning av heldjupsprofiler där periphyton växer. Icke-invasiva syresensorer integrerade i skakkolvar möjliggör övervakning av syreflöde i realtid.
Den utformade experimentella installationen möjliggör mätning av den primära produktiviteten hos mikrobiella samhällen på respektive djup där samhällena naturligt förekommer, vilket är svårt att simulera i laboratoriet (lämpligt tryck, spåra förändringarna i dygnsförloppet för temperatur och ljusintensitet på plats, olika näringstillgänglighet). De största förbättringarna i den föreslagna metoden är icke-invasivitet, kostnadseffektivitet och möjligheten till flera samtidiga mätningar på en enda koordinatplats nära platsen för provtagning. Metoden är miljövänlig eftersom alla material kan användas upprepade gånger. Det möjliggör också insamling av stora datamängder utan extra kostnader. Införandet av mycket känsligaO2-sonder (dvs. detektionsgräns 15 ppb, upplösning 0,1% av 0,04 mgO2 L-1) flyttar också användningen av metoden till mindre produktiva vattenmiljöer.
Den föreslagna metoden har dock också begränsningar som är förknippade med det experimentella arrangemangets karaktär. Den första begränsningen är möjligheten tillO2-övermättnad av de slutna flaskorna. Detta sker särskilt under soliga dagar om den högproduktiva biomassan inkuberas. Det kan resultera i en underskattning av fotosyntesen orsakad av ofullständig upplösning avO2 i vattnet7. Höga koncentrationer avO2 kan också inaktivera PSII11. För att undvika övermättnad rekommenderas starkt preliminära experiment med fokus på optimering av biomassamängden. För det andra kan utbytet av producerade gaser begränsas av det tjocka diffusiva gränsskiktet i den perifytiska mattan. Tillsammans med de stillastående förhållandena i inkubationsflaskor kan det leda till underskattning av produktiviteten. Men inom ramen för den beskrivna metodiken manipuleras inkubationsflaskorna varje timme när de dras ut ur vattnet under mättiden och sänks då. Under inkubation kan det autotrofa samhället också begränsas av upplöst oorganiskt kol (DIC), vilket orsakar en inbromsning i produktionen. Därför är ökningen iO2 inte linjär över hela inkubationstiden. Vanligtvis löses problemet genom att endast välja det linjära området förO2 till tidsförhållandet för hastighetsberäkning. Här använde vi en tredje graders polynomregression, som fungerar som en approximation av någon differentierbar funktion som definierar förändringshastigheten förO2 över tiden. Det möjliggör beräkning av förändringshastigheten vid tid noll; därför är samhället ännu inte begränsat av DIC vid tiden noll.
Studier har visat att minimal omrörning för homogenisering av gaser mellan perifytiska mattor och överliggande vatten är nödvändigt12. I lentiska miljöer är hydrodynamiken i kustzonerna ändå inte stark, så att blanda vattnet i inkubationsflaskan under de enskilda mätningarna kan vara en tillräcklig kompromiss för naturliga homogeniseringsprocesser. Ett annat problematiskt steg är att dra ut det perifytiska provet från bottenens fysiska sammanhang, vilket kan leda till förändring av ljusexponering och gaspenetration till mattan. Mängden belysning av periphyton kan moduleras något, särskilt vid kanterna av de uppsamlade mattorna. Fotosyntetiska organismer möter emellertid ljusintensitetsfluktuationer naturligt, så de är anpassade för att upprätthålla sådana förändringar13,14. För att undvika en högre grad av störning rekommenderas att man noggrant provtar en kompakt bit av den perifytiska mattan för inkubation. Prover kan utsättas för mer intensiv strålning när de dras ut ur vattnet under mätningar. Ändå är inkubationstiden för flaskorna i respektive djup mycket större än den tid som krävs för att genomföra O2-koncentrationsavläsning. Inkubationstiden är 4 h och en avläsning tar cirka 30 s.
Den presenterade metoden uppfanns för de lentiska vattenekosystemen. Det kan också användas i rinnande vatten, men några mindre tekniska problem måste lösas. I rinnande vatten kan inkubationsflaskorna lättare brytas och att förankra hela systemet skulle vara utmanande i flödet. Men även i stillastående vatten måste inkubationsflaskor hanteras försiktigt så att de inte bryter varandra under manipuleringen. Särskild uppmärksamhet måste ägnas om inkubationsflaskorna innehåller mikrobiella mattor som växer på stenar. Det är viktigt att inte ta prov på stora stenar för att undvika att glasflaskorna går sönder.
Som noterats i protokollavsnitt 7 ger den beskrivna metoden uppskattningar av nettoekosystemproduktivitet, ekosystemets andningsfrekvens och deras produkt-bruttoekosystemproduktivitet. I denna metod kan andningshastigheter för heterotrofa och autotrofa delar av det mikrobiella samhället inte särskiljas. Därför är bruttoekosystemets produktivitet lägre än bruttoprimärproduktiviteten med en hastighet som är lika med heterotrofisk andning. Därför är denna metod inte direkt jämförbar med den ofta använda metoden för primärproduktivitetsuppskattning genom 14C isotopmärkning15,16,17. Denna metod är baserad på att införa en känd mängd märkt 14C-CO2 i inkubationsflaskor fyllda med vatten med känd upplöst oorganisk C-koncentration18. Radioaktivitetsförlusten över tid är direkt proportionell mot primärproduktiviteten brutto. Den föreslagna metoden kompletterar faktiskt radiomärkningsmetoden eftersom kombinationen av båda metoderna teoretiskt möjliggör att skilja alla kolflöden, inklusive heterotrofisk och autotrofisk andning. Radiomärkningsmetoden har emellertid också flera begränsningar. Till exempel bygger det på antagandet om snabb och homogen införlivande av det märkta elementet i den perifytiska mattan19, vilket vanligtvis inte är möjligt utan den mekaniska störningen av perifytonmatrisen. För att få exakta dagliga uppskattningar måste prover samlas in, inkuberas och provtas flera gånger under dagen, och metoden bör köras under laboratorieförhållanden för att undvika radioaktiv kontamination7. Kontinuerlig och icke-invasiv mätning är inte möjlig.
Andra vanliga metoder för att uppskatta primärproduktiviteten i akvatiska ekosystem har samma experimentella design men inkluderar olika typer av syreprober, som är mindre praktiska, särskilt för att uppskatta den primära produktiviteten hos periphyton20. Användningen av vissa typer av syreprober kan hjälpa till att upptäcka den faktiska syrekoncentrationen i den perifytiska mattan men kan inte uppskatta förändringshastigheten över tiden om den inte förseglas i ett slutet system. Tätning av syresonden är mer benägen att läcka än icke-invasiva optiska sensorer. På grund av deras behov av trådbundna anslutningar tillåter andra flaskbaserade metabolismmetoder inte mätning av syrekoncentrationer på större djup. Detta gör den föreslagna metoden, som inte kräver en trådbunden anslutning, mer kapabel att ge exakta uppskattningar av djupvattenbentisk metabolism. Eftersom varje optisk sensor är en oberoende enhet är det möjligt att samtidigt mäta förändringen i syrekoncentration över tid på flera djup på en enda koordinatplats. Som ett resultat kan metoden ge en robust datauppsättning som till och med tillåter uppskalning till hela vattenkroppen om det behövs. Fjärranalystekniken är till exempel inte på samma sätt tillämplig eftersom denna metod inte kan användas på varierande djup under ytan.
Detaljerade säsongsbetonade in situ-mätningar av bruttoproduktiviteten hos perifyton (eller andra bentiska organismer) kan förbättra nuvarande kunskap om de processer som styr primärproduktivitetsdynamiken i lentiska vatten. Att uppskatta den totala primära produktiviteten i varje sjös kustzon kan ge en bättre uppfattning om dess relativa betydelse för kolmetabolismen i hela sjön. Denna metod är emellertid olämplig för att mäta plankton primärproduktivitet i oligotrofa vatten. Jämfört med bentiska samhällen är planktonbiomassan i öppet vatten för låg. Således skulle förändringarna iO2-koncentrationen vara för långsamma för att detekteras samtidigt under experimentet med bentisk biomassa. I detta fall kan planktons metaboliska aktivitet mätas med hjälp av 14C-bikarbonatmetoden som beskrivs av Šimek et al.21 under samma provtagningstid. I eutrofiska vatten är det möjligt att använda denna metod för att mäta den primära produktiviteten hos plankton också. Varje teknik för att mäta primärproduktivitet som nämns ovan har fördelar och nackdelar som har diskuterats. Den bästa tekniken bör väljas enligt de vetenskapliga frågor som undersöks. Vidare bör metoden efterlikna de ekologiska parametrarna för studerade ekosystem så mycket som möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna bekräftar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Czech Science Foundation (GACR 19-05791S), RVO 67985939 och av CAS inom programmet för Strategy AV 21, Land save and recovery. Stort tack till Ondřej Sihelský för att han tog bilderna på planen - utan honom hade inspelningen varit ett fullständigt. Projektet skulle inte vara möjligt utan ett nära samarbete med företag, Palivový Kombinát Ústí s.p. och Sokolovská Uhelná, som gav tillgång till de studerade orterna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum angle L profile 40 x 40 mm x 3 mm, length 2,000 mm | |||
| Aluminum flat bar 40 x 3 x 350 mm | |||
| Bucket 15 L with concrete infill | |||
| Carabine hook with screw lock 50 x 5 mm | |||
| electric tape black | |||
| Extruded polystyrene (XPS) material 500 x 200 x 150 mm | |||
| Fibox 3 LCD trace | PreSens Precision Sensing GmbH | stand-alone fiber optic oxygen meter | |
| Hondex PS-7 Portable Depth Sounder | Hondex - Honda Electronics | to measures distances through water - to bottom depth measurement; https://www.honda-el.net/industry/ps-7e | |
| KORKEN - glass tight-seal jar 0.5 L | IKEA | incubation bottles; https://www.ikea.com/cz/en/p/korken-jar-with-lid-clear-glass-70213545/ | |
| metal hook | |||
| Oxygen Sensor Spot SP-PSt3-NAU-D5 | PreSens Precision Sensing GmbH | non-invasive optical oxygen sensor for measurements under Real Conditions | |
| SCOUT infantable canoe | GUMOTEX | https://www.gumotexboats.com/en/scout-standard#0000-044667-021-13/11C | |
| Screw 10 x 170 mm with hexagonal nuts | |||
| Screw 4 x 15 mm with hexagonal nuts | |||
| Screw 4 x 15 mm with wing nuts | |||
| Snap hooks 50 x 5 mm | |||
| Steel Carabine hook 50 x 5 mm | |||
| Steel chain with wire diameter 3 mm, inside link 5.5 x 26 mm | |||
| Steel chain, 5 m | |||
| toothbrush | |||
| tweezer | |||
| Washer 10 x 50 mm | |||
| Washer 4 x 10 mm | |||
| Washer 4 x 10 mm |
References
- Blachart, J. L., et al. Potential consequences of climate change for primary production and fish production in large marine ecosystems. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 367 (1605), 2979-2989 (2012).
- Howarth, R. W., Michaels, A. F. The Measurement of primary production in aquatic ecosystems. Methods in Ecosystem Science. Sala, O. E., Jackson, R. B., Mooney, H. A., Howarth, R. W. , Springer. New York, NY. 72-85 (2000).
- Vadenbecouer, Y. E. G., Peterson, M. J., Vander, Z., Kalff, J. Benthic algal production across lake size gradients: Interactions among morphometry, nutrients, and light. Ecology. 89 (9), 2542-2552 (2008).
- Reimer, A., Landmann, G., Kempe, S. Lake Van, eastern Anatolia, hydrochemistry and history. Aquatic Geochemistry. 15 (1), 195-222 (2009).
- Cantonati, M., Lowe, R. L. Lake benthic algae: toward an understanding of their ecology. Freshwater Sciences. 33 (2), 475-486 (2014).
- Gaarder, T., Gran, H. H. Investigation of the production of plankton in the Oslo Fjord. Rapports et Proces-verbaux des Réunions. Conseil International pour l'Éxploration de la Mer. 42, 1-48 (1927).
- Hall, R. O., Thomas, S., Gaiser, E. E. Measuring Freshwater Primary Productivity and Respiration. Principles and Standards for Measuring Primary Productivity. Fahey, T. J., Knapp, A. K. , Oxford Academic. New York. The Long-Term Ecological Research Network Series (2007).
- Howart, R., Michaels, A. Chapter 6 The Measurement of Primary Production in Aquatic Ecosystems. Springer Science and Business Media LLC. , (2000).
- Kopáček, J., Hejzlar, J. Semi-micro determination of total phosphorus in soils, sediments, and organic materials: a simplified perchloric acid digestion procedure. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (11-12), 1935-1946 (1995).
- Benson, B. B., Krause, D. The concentration and isotopic fractionation of oxygen dissolved in freshwater and seawater in equilibrium with the atmosphere1. Limnology and Oceanography. 29 (3), 620-632 (1984).
- Dodds, W. K., Biggs, B. J., Lowe, R. L. Photosynthesis-irradiance patterns in benthic microalgae: variations as a function of assemblage thickness and community structure. Journal of Phycology. 35 (1), 42-53 (1999).
- Bott, T. L., et al. An evaluation of techniques for measuring periphyton metabolism in chambers. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 54 (3), 715-725 (1997).
- Blankenship, R. E. Structural and functional dynamics of photosynthetic antenna complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (45), 13751-13752 (2015).
- Hawes, I., Schwartz, A. -M. Photosynthesis in an extreme shade environment, benthic microbial mats from Lake Hoare, a permanently ice-covered Antarctic lake. Journal of Phycology. 35 (3), 448-459 (1999).
- Aristegui, J., et al. Planktonic primary production and microbial respiration measured by 14C assimilation and dissolved oxygen changes in coastal waters of the Antarctic peninsula during austral summer: Implications for carbon flux studies. Marine Ecology-Progress Series. 132, 191-201 (1996).
- Steemann-Nielsen, C. The use of radioactive carbon (14C) for measuring organic production in the sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 18 (2), 117-140 (1952).
- Sanz-Martín, M., et al. Relationship between carbon-and oxygen-based primary productivity in the Arctic Ocean, svalbard archipelago. Frontiers in Marine Science. 6, 468 (2019).
- Nielsen, E. S. Measurement of the production of organic matter in the sea by means of carbon-14. Nature. 167 (4252), 684-685 (1951).
- Jönsson, B. A 14C-incubation technique for measuring microphytobenthic primary productivity in intact sediment cores. Limnology and Oceanography. 36 (7), 1485-1492 (1991).
- Bender, M. L., et al. A comparison of four methods for determining planktonic community production. Limnology and Oceanography. 32 (5), 1085-1098 (1987).
- Šimek, K., et al. Spatio-temporal patterns of bacterioplankton productivity and community composition related to phytoplankton composition and protistan bacterivory in a dam reservoir. Aquatic Microbial Ecology. 51 (3), 249-262 (2008).
