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Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

DOI:

10.3791/64122

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July 6th, 2022

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1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Institutes of Biomedical Sciences and the Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, Shanghai Medical College, Fudan University

In This Article

Summary

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Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.

Abstract

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Konventionelle zweidimensionale Zellkulturtechniken und Tiermodelle wurden bei der Untersuchung des menschlichen Thoraxaortenaneurysmas und der Dissektion (TAAD) verwendet. Menschliche TAAD kann jedoch manchmal nicht durch Tiermodelle charakterisiert werden. Es gibt eine offensichtliche Artenlücke zwischen klinischen Studien am Menschen und Tierversuchen, die die Entdeckung therapeutischer Medikamente behindern kann. Im Gegensatz dazu ist das konventionelle Zellkulturmodell nicht in der Lage, biomechanische Reize in vivo zu simulieren. Zu diesem Zweck haben sich Mikrofabrikations- und mikrofluidische Techniken in den letzten Jahren stark weiterentwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die biomechanische Mikroumgebung nachbilden. In dieser Studie wurde ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) entwickelt, um die pathophysiologischen Parameter der Aortenbiomechanik zu simulieren, einschließlich der Amplitude und Häufigkeit der zyklischen Belastung durch menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs), die eine wichtige Rolle bei TAAD spielen. In diesem Modell wurde die Morphologie der HASMCs länglich, senkrecht zur Dehnungsrichtung ausgerichtet und zeigte unter Dehnungsbedingungen einen kontraktileren Phänotyp als unter statischen konventionellen Bedingungen. Dies stimmte mit der Zellorientierung und dem Phänotyp in nativen menschlichen Aortenwänden überein. Darüber hinaus haben wir unter Verwendung von bikuspidalen Aortenklappen-bezogenen TAAD (BAV-TAAD) und Trikuspidal-Aortenklappen-bezogenen TAAD (TAV-TAAD) patientenabgeleiteten primären HASMCs BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Krankheitsmodelle etabliert, die HASMC-Eigenschaften in TAAD replizieren. Das HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform , die Tiermodelle ergänzt, um die Pathogenese von TAAD weiter zu erforschen und therapeutische Ziele zu entdecken.

Introduction

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Thoraxaortenaneurysma und -dissektion (TAAD) ist eine lokalisierte Dilatation oder Delaminierung der Aortenwand, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht1. Menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs) spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von TAAD. HASMCs sind keine terminalen differenzierten Zellen, und HASMCs behalten eine hohe Plastizität, so dass sie den Phänotyp als Reaktion auf verschiedene Reize wechseln können2. HASMCs werden hauptsächlich in vivo rhythmischen Zugbelastungen ausgesetzt, was einer der Schlüsselfaktoren ist, die morphologische Veränderungen, Differenzierung und physio....

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Protocol

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Menschliche Aortenproben wurden für die primäre HASMC-Isolierung unter Genehmigung des Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortenproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer aufsteigenden Aortenoperation im Zhongshan Hospital der Fudan-Universität unterzogen. Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

1. Primäre Isolierung der glatten Muskelmuskulatur des Menschen

  1. Waschen Sie die rechte laterale Region der aufsteigenden Aorta mit sterilem PBS, 1x-2x.
  2. Entfernen Sie die Intima- und Adventitiaschichten des Gewe....

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Results

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Das HASMC-OOC-Modell besteht aus einem Vakuumsteuerungssystem, einem Umlaufsystem und PDMS-Chips sowie dem schematischen Aufbau des HASMC-OOC-Modells (Abbildung 1). Die Vakuumsteuerung besteht aus einer Vakuumpumpe, Magnetventilen und einer SPS-Steuerung. Als Kreislaufsystem wurde eine Schlauchpumpe verwendet, um das Zellkulturmedium aufzufrischen und Medikamente hinzuzufügen. Der PDMS-Chip bestand aus zwei Vakuumkammern und einer mittleren Kammer, die mit SMCM für das Zellwachstum gefüllt w.......

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Discussion

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Mit der rasanten Entwicklung der mikrofluidischen Technologie sind in den letzten Jahren OOC-Modelle entstanden, die die biologische Funktion und Struktur eines oder mehrerer Organe in vitro für Anwendungen in Biologie, Medizin und Pharmakologie replizieren können15. OOC kann Schlüsselfunktionen der menschlichen physiologischen Mikroumgebung simulieren, die für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Förderung der präklinischen Arzneimitteltranslation unerlässlich sind

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Die Autoren bestätigen, dass diese Arbeit durch Zuschüsse der Science and Technology Commission der Stadtverwaltung Shanghai (20ZR1411700), der National Natural Science Foundation of China (81771971) und des Shanghai Sailing Program (22YF1406600) unterstützt wurde.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydBeyotimeP0099-100mlWird zur Zellimmobilisierung
verwendet Alexa Fluor 350-markierte Ziege Anti-KaninchenIgG BeyotimeA0408Antikörper zur Immunfärbung von
RinderserumalbuminBeyotimeST025-20g
Calcium AM/PIInvitrogenL3224
ZellkulturflascheCorning430639
CNN1Abcam Ab46794
Kommerzielle flexible
PDMS-Membran		Hangzhou Bald Advanced MaterialsKYQ-200
F-AktinInvitrogenR415
FBSSigmaM8318
SchläucheRunze Fluid964101 mm Innendurchmesser; 3 mm Außendurchmesser; 1 mm Wandstärke; Offizielle Website-Adresse: https://www.runzefluidsystem.com
Menschliche Aorten-Glatt
-Muskelzelllinie CRL1999		ATCCChargennummer: 70019189
Bild JImagej.net/fiji/downloadsKostenloser Download: https://fiji.scBildgebungsplattform, die zur Identifizierung der Fluoreszenzintensität verwendet wird
InkubatorThermo Fisher ScientificStellt sicher, dass die Temperatur,
Luftfeuchtigkeit und die Lichteinwirkung während des gesamten Experiments <
/> genau gleich sind.
LuerRunze FluidRH-M016Offizielle Website-Adresse: https://www.runzefluidsystem.com.
MikroskopOlympus
Maus KollagenSigmaC7661
Sauerstoffplasma Changzhou Hongming InstrumentHM-Plasma5L
Pasteur-PipetteBiologix30-0138A1
PBSBeyotimeC0221A
Pen-StrepSigmaP4458-100mlAntibiodics zur Verhinderung einer bakteriellen
Kontamination von Zellen während der Kultur.
SchlauchpumpeKamoerF01A-STP-B046
PetrischaleCorning430167
SPS-SteuerungZhejiang Jun Teng (BenT) CNC-FabrikBR010-11T8X2MDie detaillierte Programmeinstellung finden Sie in der Ergänzung. Offizielle Website-Adresse: files.http://www.btcnc.net
Polydimethylsiloxan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
SM22Abcam ab14106
SMCMScienCellCat 1101
MagnetventilSMC (China)VQZ300
SpritzeBecton, Dickinson and Company300841
Triton-X 100BeyotimeST795Zum Durchdringen von Zellmembranen
TrizolInvitrogen10296010Wird für die RNA-Extraktion
Trypsin verwendetSigma15400054
VakuumfilterSMC (China)ZFC5-6Offizielle Website-Adresse: https://www.smc.com.cn
VakuumpumpeKamoerKVP15-KL-S
VakuumreglerAirTACGVR-200-06
Primers
Primer NameVorwärts (5' bis 3')Rückwärtsgang (5' bis 3')
SM22CCGTGGAGATCCCAACTGGCCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1CTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
  2. van Varik, B. J., et al.

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Organ On A ChipSmooth Muscle CellsAortic Biomechanical StrainHuman Aorta ModelMicrofluidic TechniquesPDMS ChipCyclic StrainImmunofluorescence AnalysisCell MorphologyThoracic Aortic Aneurysm

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