Summary
Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.
Abstract
Konventionelle zweidimensionale Zellkulturtechniken und Tiermodelle wurden bei der Untersuchung des menschlichen Thoraxaortenaneurysmas und der Dissektion (TAAD) verwendet. Menschliche TAAD kann jedoch manchmal nicht durch Tiermodelle charakterisiert werden. Es gibt eine offensichtliche Artenlücke zwischen klinischen Studien am Menschen und Tierversuchen, die die Entdeckung therapeutischer Medikamente behindern kann. Im Gegensatz dazu ist das konventionelle Zellkulturmodell nicht in der Lage, biomechanische Reize in vivo zu simulieren. Zu diesem Zweck haben sich Mikrofabrikations- und mikrofluidische Techniken in den letzten Jahren stark weiterentwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die biomechanische Mikroumgebung nachbilden. In dieser Studie wurde ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) entwickelt, um die pathophysiologischen Parameter der Aortenbiomechanik zu simulieren, einschließlich der Amplitude und Häufigkeit der zyklischen Belastung durch menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs), die eine wichtige Rolle bei TAAD spielen. In diesem Modell wurde die Morphologie der HASMCs länglich, senkrecht zur Dehnungsrichtung ausgerichtet und zeigte unter Dehnungsbedingungen einen kontraktileren Phänotyp als unter statischen konventionellen Bedingungen. Dies stimmte mit der Zellorientierung und dem Phänotyp in nativen menschlichen Aortenwänden überein. Darüber hinaus haben wir unter Verwendung von bikuspidalen Aortenklappen-bezogenen TAAD (BAV-TAAD) und Trikuspidal-Aortenklappen-bezogenen TAAD (TAV-TAAD) patientenabgeleiteten primären HASMCs BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Krankheitsmodelle etabliert, die HASMC-Eigenschaften in TAAD replizieren. Das HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform , die Tiermodelle ergänzt, um die Pathogenese von TAAD weiter zu erforschen und therapeutische Ziele zu entdecken.
Introduction
Thoraxaortenaneurysma und -dissektion (TAAD) ist eine lokalisierte Dilatation oder Delaminierung der Aortenwand, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht1. Menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs) spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von TAAD. HASMCs sind keine terminalen differenzierten Zellen, und HASMCs behalten eine hohe Plastizität, so dass sie den Phänotyp als Reaktion auf verschiedene Reize wechseln können2. HASMCs werden hauptsächlich in vivo rhythmischen Zugbelastungen ausgesetzt, was einer der Schlüsselfaktoren ist, die morphologische Veränderungen, Differenzierung und physiologische Funktionen der glatten Muskulatur regulieren 3,4. Daher kann die Rolle der zyklischen Belastung bei der Untersuchung von HASMCs nicht ignoriert werden. Herkömmliche 2D-Zellkulturen können jedoch die biomechanische Stimulation zyklischer Belastungen, die HASMCs in vivo erfahren, nicht replizieren. Darüber hinaus ist die Konstruktion eines Tier-TAAD-Modells für einige Arten von TAAD nicht geeignet, wie z. B. BICUSPIDAL-Aortenklappe (BAV)-bezogene TAAD. Darüber hinaus kann die Artenlücke zwischen klinischen Humanstudien und Tierversuchen nicht ignoriert werden. Es behindert die pharmazeutische Übersetzung in der klinischen Praxis. Daher besteht ein dringender Bedarf an komplexeren und physiologischen Systemen, um die biomechanische Umgebung in vivo bei der Erforschung von Aortenerkrankungen zu simulieren.
Tierversuche, die in der biomedizinischen Forschung und Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden, sind kostspielig, zeitaufwendig und ethisch fragwürdig. Darüber hinaus können die Ergebnisse aus Tierstudien häufig nicht die Ergebnisse vorhersagen, die in klinischen Studien am Menschen erzielt wurden 5,6. Der Mangel an präklinischen Modellen am Menschen und die hohe Ausfallrate in klinischen Studien haben zu wenigen wirksamen Medikamenten für die Klinik geführt, was die Gesundheitskosten erhöht hat7. Daher ist es dringend notwendig, andere experimentelle Modelle zu finden, die Tiermodelle ergänzen. Mikrofabrikation und mikrofluidische Techniken haben sich in den letzten Jahren stark entwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die Nachteile traditioneller 2D-Zellkulturtechniken beheben und ein realistischeres, kostengünstigeres und effizienteres In-vitro-Modell für physiologische Studien und Arzneimittelentwicklung etablieren. Mit Hilfe mikrofluidischer Geräte werden Organe-on-Chips etabliert, um lebende Zellen in mikrometergroßen Kammern mit unterschiedlichen Reizen zu kultivieren, um die Schlüsselfunktionen eines Gewebes oder Organs zu replizieren. Das System besteht aus einzelnen oder mehreren mikrofluidischen Mikrokanälen, wobei entweder eine Zellart in einer perfundierten Kammer kultiviert wird, die Funktionen eines Gewebetyps repliziert, oder verschiedene Zelltypen, die auf porösen Membranen kultiviert werden, um Grenzflächen zwischen verschiedenen Geweben nachzubilden. Mikrofluidische Organoide in Kombination mit patientenbasierten Zellen haben den einzigartigen Vorteil, den großen Artenunterschied zwischen Maus- und Humankrankheitsmodellen zu überbrücken und die Nachteile der traditionellen 2D-Zellkultur für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Wirkstoffforschung zu überwinden. Mit der rasanten Entwicklung der Mikrofluidik in den letzten Jahren haben Forscher die Nützlichkeit von In-vitro-Organ-on-a-Chip (OOC)-Modellen erkannt, die komplexe biologische In-vivo-Parameter replizieren8. Diese mikrofluidischen Organoide simulieren biomechanische In-vitro-Umgebungen wie zyklische Dehnung, Scherspannung und Flüssigkeitsdruck und bieten eine dreidimensionale (3D) Zellkulturumgebung. Bis heute wurden mehrere OOC-Modelle etabliert, um biomechanische Reize in Organen wie Lunge9, Niere 10, Leber11, Darm12 und Herz13 zu simulieren, aber diese wurden nicht weit verbreitet auf die Untersuchung menschlicher Aortenerkrankungen angewendet.
In dieser Studie präsentieren wir ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) für glatte Aortenmuskelzellen, das die biomimetischen mechanischen Kräfte und Rhythmen steuern kann, die auf von TAAD-Patienten abgeleitete primäre HASMCs angewendet werden. Der Chip besteht aus dreischichtigen, dicken Platten aus Polydimethylsiloxan (PDMS), die mit Kanälen geätzt sind, und zwei kommerzialisierten hochflexiblen PDMS-Membranen. HASMCs werden auf den PDMS-Membranen kultiviert. Der Kanal in der Mitte des Chips ist mit einem Kulturmedium für die Zellkultur gefüllt. Die oberen und unteren Kanäle des Chips sind mit einem Vakuumdruckversorgungssystem verbunden, das den Rhythmus und die Frequenz der mechanischen Zugdehnung der PDMS-Membranen steuern kann. Rhythmische Belastungen, denen HASMCs ausgesetzt sind, können in HASMC-OOC simuliert werden, wodurch die biomechanische Mikroumgebung von Gewebe oder Organen repliziert wird, die mit herkömmlichen 2D-Kultursystemen nicht funktionell erreichbar ist. Mit dem Vorteil der hochauflösenden Echtzeit-Bildgebung und der biomechanischen Mikroumgebung können die biochemischen, genetischen und metabolischen Aktivitäten lebender Zellen für Gewebeentwicklung, Organphysiologie, Krankheitsätiologie, molekulare Mechanismen und Biomarkeridentifizierung, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Aortenerkrankungen untersucht werden. In Kombination mit gewebespezifischen und Patientenzellen kann dieses System für Medikamentenscreenings, personalisierte Medizin und Toxizitätstests eingesetzt werden. Dieses HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform zur Untersuchung der Pathogenese der Aortenerkrankung.
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Protocol
Menschliche Aortenproben wurden für die primäre HASMC-Isolierung unter Genehmigung des Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortenproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer aufsteigenden Aortenoperation im Zhongshan Hospital der Fudan-Universität unterzogen. Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
1. Primäre Isolierung der glatten Muskelmuskulatur des Menschen
- Waschen Sie die rechte laterale Region der aufsteigenden Aorta mit sterilem PBS, 1x-2x.
- Entfernen Sie die Intima- und Adventitiaschichten des Gewebes mit zwei Augenzangen und behalten Sie die Medienschicht bei, um die Zellen zu ernten.
- Legen Sie die Medienschicht auf eine 10 cm große Kulturschale und schneiden Sie sie mit einer Schere in kleine Stücke (2-3 mm). Fügen Sie 5 ml glattes Muskelzellkulturmedium (SMCM) hinzu, das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.
- Bewegen Sie das kleine Gewebe mit einer sterilen Pipette in die Kulturflasche und verteilen Sie das Gewebe gleichmäßig. Entsorgen Sie das Kulturmedium so weit wie möglich und drehen Sie die Flasche dann verkehrt um.
- 2 ml SMCM in die invertierte Kulturflasche geben und bei 37 °C für 1-2 h in den Inkubator (5%CO2) stellen, dann langsam auf die rechte Seite drehen und weitere 2 mL SMCM hinzufügen.
- Nach 5-7 Tagen Inkubation das SMCM gegen 4 ml frisches SMCM austauschen. Im Allgemeinen klettern sporadische glatte Muskelzellen in etwa 2 Wochen heraus.
- Verwerfen Sie das SMCM langsam und fügen Sie es langsam hinzu, wenn Sie das Medium wechseln. Transportieren Sie die Kulturflasche langsam, wenn Sie sich zu einer Mikroskopstation bewegen. Andernfalls schwimmen die Gewebe und die Zellen wachsen langsam.
- Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz erreicht haben, waschen Sie mit 2 ml PBS, verdauen Sie sie mit 2 ml 0,25% Trypsin und teilen Sie sie in zwei neue Kulturflaschen mit 4 ml frischem SMCM.
- Identifizieren Sie die Zellen durch eine Immunfluoreszenzanalyse von vier verschiedenen spezifischen Markern für glatte Muskelzellen (CNN1, SM22)14.
2. Vorbereitung des PDMS-Chips
- Um PDMS zu polymerisieren, fügen Sie Härter (B-Komponente) zur Basis (A-Komponente) mit einem Gewichtsverhältnis von A: B = 10: 1 w/w hinzu und mischen Sie den Komplex vollständig für 5 min; Das Volumen hängt von der Notwendigkeit der Studie ab.
- Das vorbereitete PDMS-Gel für 30-60 min in einen Vakuumextraktionstank geben und den Druck unter -0,8 mPa halten.
HINWEIS: Hoher Druck führt zu einer unzureichenden Extraktion kleiner Blasen im PDMS-Gel, die den nächsten Schritt der Chipherstellung beeinträchtigen. - Entwerfen Sie die Form mithilfe einer CAD-Software (Computer Aided Design) mit einer 100 mm × 40 mm × 8 mm Außenrahmenstruktur und einem 70 mm × 6 mm × 4 mm Kanal.
- Maßgeschneiderte Herstellung der Formen der drei Schichten mit einer hochpräzisen numerisch gesteuerten Graviermaschine. Schneiden Sie den Rahmen der Formen und die Mikrokanäle mit Polymethylmethacrylat (PMMA) -Platten heraus und kleben Sie sie dann auf eine andere PMMA-Platte.
- Gießen Sie das vorbereitete PDMS-Gel auf eine Form mit einem 100 mm × 40 mm × 6 mm Außenrahmen und 70 mm × 6 mm × 4 mm Kanal und vernetzen Sie dann bei 70 °C für 1-2 h.
- Die vernetzten PDMS-Platten aus der Form abziehen und die kommerzialisierten PDMS-Membranen in 100 mm × 40 mm Abschnitte schneiden.
- Behandeln Sie die drei vorbereiteten PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen 5 min lang mit Sauerstoffplasma zur PDMS-Oberflächenaktivierung. Wenden Sie die folgenden spezifischen Einstellungen an: Raumluft als Prozessgas; Druck eingestellt auf -100 kPa; Strom auf 180--200 Ma eingestellt; Spannung auf 200 V eingestellt; Prozesszeit bis 5 min.
- Stanzen Sie Löcher auf den drei PDMS-Platten mit einem 1-mm-Locher, um den Ein- und Auslass von Luft und mittleren Mikrokanälen auf dem PDMS-Chip herzustellen.
- Verbinden Sie drei PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen in der Reihenfolge: Luftkanal-PDMS-Platte (oberste Schicht) - PDMS-Membran - Mittelkanal-PDMS-Platte (mittlere Schicht) - PDMS-Membran- Luftkanal-PDMS-Platte (untere Schicht). Führen Sie diesen Schritt unter einem stereoskopischen Mikroskop bei 4x durch, um die Luftmikrokanäle vollständig mit den mittleren Mikrokanälen zu überlappen.
- Legen Sie den bestückten PDMS-Chip für 1 h in einen 70 °C Inkubator.
- Bereiten Sie mehrere 1 mm Innendurchmesser und 3 cm lange Latexschläuche vor. Führen Sie eine 1 mm Außendurchmesser und eine 1 cm lange Edelstahlnadel in ein Ende des vorbereiteten Schlauchs ein und führen Sie dann einen Luer in das andere Ende des Schlauchs ein, um das Rohr zu erzeugen, das mit den Luft- und mittleren Mikrokanälen des PDMS-Chips verbunden ist.
- Stecken Sie die vorbereiteten Röhrchen in die Aus- und Einlässe der Luft- und Medienmikrokanäle auf dem PDMS-Chip.
3. PDMS-Chip-Oberflächenbehandlung und Sterilisation
- Infusion von 2 ml 80 mg/ml Mauskollagen in den mittleren Mikrokanal des PDMS-Chips mit einer 2-ml-Spritze und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min.
- Entfernen Sie nach der Inkubation das Kollagen aus dem Kanal und sammeln Sie es mit einer 2-ml-Spritze. Legen Sie die kollagenbeschichteten PDMS-Chips über Nacht in einen 60 °C heißen Inkubator.
- Legen Sie die PDMS-Chips für mehr als 1 h in einen UV-Sterilisator. Legen Sie die sterilisierten PDMS-Chips zur Vorbereitung auf das Zellexperiment auf eine ultrareine Bank.
4. Zellaussaat auf dem PDMS-Chip und Zelldehnungsprozess
- Kultur 4 x 10 5 primäre menschliche glatte Muskelzellen (HASMCs) von Patienten, die glattes Muskelzellmedium (SMCM) mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin in einem5 %CO2-Inkubator bei 37 °C verwenden.
- Wenn die HASMC-Dichte 80% erreicht, verwerfen Sie die SMCM und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS.
- Die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin für 2 min verdauen und bei 100 x g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem SMCM. Verwenden Sie 8 ml SMCM, um die Zellen auf einer 10 cm großen Kulturschale zu kultivieren.
- Berechnen Sie die Zellzahl mit einem Zytometer und verwenden Sie die Zellen in einer Endkonzentration von 2 x 105 Zellen/ml.
- Gießen Sie langsam 2 ml PBS in den kollagenbeschichteten und sterilisierten PDMS-Chip-Mikrokanal und entsorgen Sie ihn später mit einer 2-ml-Spritze.
- Gießen Sie langsam insgesamt 2 mL 2 x 105 Zellen/ml HASMC-Suspension mit einer 2-ml-Spritze in den mittleren Mikrokanal des PDMS-Chips. Schließen Sie dann den Luer am Ein- und Ausgang des PDMS-Chips. Legen Sie den PDMS-Chip für 1 Tag bei 37 °C in einen Inkubator (5%CO2).
- Nachdem die Zellen an der PDMS-Membran im PDMS-Chip befestigt sind, verbinden Sie fast nach 24 h den Auslass des Luftmikrokanals auf dem PDMS-Chip mit dem Vakuum-Controller-System. Wenn die Zelle befestigt ist, kann eine längliche, normale Zellform unter dem Mikroskop gesehen werden, im Gegensatz zu den suspendierten runden Zellen.
- Schalten Sie das Magnetventil und die Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie den Vakuumregler und stellen Sie das Druckniveau auf 10 kPa für 7,18 ± 0,44% Dehnung und 15 kPa für 17,28 ± 0,91% Dehnung ein.
- Nachdem die Parameter der Steuerung eingestellt sind, legen Sie die PDMS-Chips in einen Inkubator (5% CO2) bei 37 °C und dehnen sie für 24 h.
5. Vorbereitung der mechanischen Steuerung
- Bereiten Sie mehrere Magnetventile, Vakuumfilter, Vakuumregler, eine Vakuumpumpe, eine Schlauchpumpe und eine speicherprogrammierbare Steuerung (SPS) vor, die das Magnetventil steuert.
- Programmieren Sie die SPS-Steuerung und stellen Sie das Ein-/Aus-Zeitintervall auf 1 Hz ein. Verbinden Sie die Magnetventile mit der programmierten Steuerung.
- Verbinden Sie den Einlass der Vakuumpumpe mit den Vakuumfiltern und dann den Ausgang der Vakuumfilter mit den Vakuumreglern. Verbinden Sie den Ausgang der Vakuumregler mit Magnetventilen und schließlich den Ausgang der Magnetventile mit den Auslässen der Luftmikrokanäle der PDMS-Chips.
- Verbinden Sie den Ausgang der Schlauchpumpe mit dem Einlass des mittleren Mikrokanals des PDMS-Chips und den Einlass der Schlauchpumpe mit dem Ausgang des mittleren Mikrokanal-PDMS-Chips für den Austausch des Kulturmediums und die Handhabung von Medikamenten.
- Stellen Sie die Amplitude der Dehnung durch den Regler und die Dehnungsfrequenz durch den Mikrocontroller ein.
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Representative Results
Das HASMC-OOC-Modell besteht aus einem Vakuumsteuerungssystem, einem Umlaufsystem und PDMS-Chips sowie dem schematischen Aufbau des HASMC-OOC-Modells (Abbildung 1). Die Vakuumsteuerung besteht aus einer Vakuumpumpe, Magnetventilen und einer SPS-Steuerung. Als Kreislaufsystem wurde eine Schlauchpumpe verwendet, um das Zellkulturmedium aufzufrischen und Medikamente hinzuzufügen. Der PDMS-Chip bestand aus zwei Vakuumkammern und einer mittleren Kammer, die mit SMCM für das Zellwachstum gefüllt war. Entsprechend dem Design der Chipstruktur wurde die PMMA-Form vorbereitet, und die drei PDMS-Brammen wurden durch Gießen in Formen und Vernetzung bei 70 °C für 2 h vorbereitet. Nach der Behandlung mit Plasma wurden die drei PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen miteinander verbunden (Abbildung 2). Als die PDMS-Chips vorbereitet wurden, wurden die HASMCs auf der PDMS-Membran im Chip kultiviert und die PDMS-Chips wurden mit dem Vakuumsteuerungssystem und dem Umlaufsystem verbunden. Eine schematische Darstellung des gesamten Systems ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die PDMS-Chipparameter sind in Abbildung 3A und die mechanischen Eigenschaften der PDMS-Membran in Abbildung 3B dargestellt. Um die Zugdehnungen der PDMS-Membran zu quantifizieren, erfassten wir die Echtzeitverformungen der PDMS-Membranen aus einer Querschnittsansicht des mikrofluidischen Modells mit Vakuumdrücken von 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa und 30 kPa. Wir haben auch die Längenänderungen gemessen, um die Dehnungsgröße der PDMS-Membran in verschiedenen Kulturkanalbreiten von 2 mm, 4 mm und 6 mm zu bewerten (Abbildung 3C-E). Im PDMS-Chip wurden Mikrokanäle mit einer Breite von 6 mm verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Vakuumdruck von 10 kPa 7,18 ± 0,44% Dehnung und 15 kPa induzierte 17,28 ± 0,91% Dehnung induzierte (Abbildung 3E).
Um die Zelllebensfähigkeit der HASMC-Zelllinie (CRL1999) im PDMS-Chip zu überprüfen, wurde an den Tagen 3 und 5 nach der Kultivierung der Zellen ein LIVE/DEAD-Assay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zelllebensfähigkeit an Tag 3 und Tag 5 höher als 90% war (Abbildung 4A). Die Färbung des Zytoskeletts (F-Aktin) von CRL1999 im PDMS-Chip zeigte eine normale Zellmorphologie und Zellen, die nach 24 h Dehnung senkrecht zum Stamm ausgerichtet waren (Abbildung 4B-C). Die Immunfluoreszenzfärbung der kontraktilen Marker SM22 und CNN1 wurde mittels HASMC-OOC nach 24 h rhythmischer Belastung durchgeführt (Abbildung 4D-E). Zu Beginn wurden 2 ml PBS langsam in den Kanal gegossen und mit einer 2-ml-Spritze verworfen. Anschließend wurden 2 mL 4% (v/v) Paraformaldehyd in den Kanal gegossen und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 2 mL 0,2% (v/v) Triton X-100 mit einer 2-ml-Spritze in den Kanal gegossen und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 2 ml PBS langsam in den Kanal gegossen und nach dem Waschen der Zellen mit einer 2-ml-Spritze verworfen. Als nächstes wurden 2 ml 5% (w/v) Rinderserumalbumin langsam in den Kanal gegossen und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde 1 ml SM22- oder CNN1-Antikörper langsam in den Kanal gegossen und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde 1 ml sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper für Ziegen langsam in den Kanal gegossen und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde 1 ml DAPI-Lösung langsam in den Kanal gegossen und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fluoreszenzintensität von SM22 und CNN1 unter Dehnungsbedingungen höher war als unter statischen Bedingungen (Abbildung 4F). Im Vergleich zu statischen Bedingungen wurden die SM22- und CNN1-Gene in HASMCs unter Stammbedingungen hochreguliert (Abbildung 4G). Diese Daten deuteten darauf hin, dass CRL1999 senkrecht zur Stammrichtung ausgerichtet war und dass ein kontraktiler Phänotyp unter Stammbedingungen stärker ausgeprägt war als unter konventioneller Zellkultivierung unter statischen Bedingungen.
Unter Verwendung von bikuspiden Aortenklappen-assoziierten TAAD (BAV-TAAD) und Trikuspidal-Aortenklappen-bezogenen TAAD (TAV-TAAD) patientenabgeleiteten primären HASMCs etablierten wir BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Krankheitsmodelle. Die Ergebnisse der F-Aktin-Färbung von BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Patienten-abgeleiteten primären HASMCs zeigten eine normale Zellmorphologie und Zellen, die nach 24 h Dehnung senkrecht zur Stammrichtung ausgerichtet waren (Abbildung 5A-B). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die SM22- und CNN1-Expression in BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Patienten-abgeleiteten primären HASMCs unter Stammbedingungen höher war als unter statischen Bedingungen (Abbildung 5C-G,I). Die Genexpressionsniveaus von SM22 und CNN1 in BAV-TAAD- und TAV-TAAD-patientenabgeleiteten primären HASMCs wurden unter Stammbedingungen im Gegensatz zu statischen Bedingungen hochreguliert (Abbildung 5H,J). Diese Ergebnisse in BAV-TAAD- und TAV-TAAD-patientenabgeleiteten primären HASMCs im PDMS-Chip stimmten mit den Ergebnissen der HASMC-Zelllinie CRL1999 überein, was darauf hindeutet, dass die Kombination von patientenabgeleiteten primären HASMCs und dem HASMC-OOC-Modell HASMC-Eigenschaften in TAAD repliziert, was ein BAV-TAAD- und TAV-TAAD-In-vitro-Krankheitsmodell für die weitere Untersuchung der molekularen Mechanismen der Krankheit und das Arzneimittelscreening bietet.
Abbildung 1: Schematischer Aufbau des HASMC-OOC-Systems. Das System besteht aus einer Vakuumsteuerung, einem Umlaufsystem und PDMS-Chips. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: PDMS-Chipvorbereitung. Das PDMS-Gel wurde in eine PMMA-Form gegossen und bei 70 °C für 1-2 h vernetzt. Dann wurden die drei PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen 5 min lang mit Plasma behandelt und miteinander verbunden. Schließlich wurden die vorbereiteten PDMS-Chips sterilisiert und eine Konzentration von 2 x 105 Zellen/ml HASMC-Suspension langsam in den mittleren Mikrokanal des PDMS-Chips gegossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die detaillierten Parameter und mechanischen Eigenschaften des PDMS-Chips. (A) Die detaillierten Parameter des PDMS-Chips. Die PDMS-Plattengröße betrug 100 mm × 40 mm × 6 mm und die Mikrokanalgröße 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Die Parameter der kommerziellen PDMS-Membran. Die berechnete Streckamplitude der PDMS-Membran bei unterschiedlichen Vakuumdrücken für Mikrokanalbreiten von 2 mm (C), 4 mm (D) und 6 mm (E). Die Daten zeigen Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Zellmorphologie, Orientierung und Phänotyp-Veränderung von HASMCs unter zyklischen Stammbedingungen. (A) Repräsentatives Bild des LIVE/DEAD-Assays an Tag 3 und Tag 5 nach der Kultivierung der HASMC-Zelllinie (CRL1999) auf einem PDMS-Chip. (B) F-Aktin-Färbung von CRL1999 unter statischen und Dehnungsbedingungen. (C) Die Zellorientierung von CRL1999 unter statischen und Dehnungsbedingungen. Repräsentatives Bild der Immunfluoreszenzfärbung von SM22 (D) und CNN1 (E) in CRL1999 unter statischen und Dehnungsbedingungen. (F) Die relative Intensität der Immunfluoreszenzfärbung von SM22 und CNN1. (G) SM22 - und CNN1-mRNA-Expression in CRL1999 unter statischen und Stammbedingungen. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, zweiseitig Student's t-Tests wurden verwendet, um die beiden Gruppen zu vergleichen. Die Daten zeigen Mittelwert ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Zellmorphologie und phänotypische Veränderungen in BAV-TAAD und TAV-TAAD-patientenabgeleitetem HASMC-OOC. Repräsentatives Bild der F-Aktin-Färbung von BAV-TAAD (A)-abgeleiteten primären HASMCs und TAV-TAAD (B)-abgeleiteten primären HASMCs unter statischen und Dehnungsbedingungen. SM22-Immunfluoreszenzfärbung in BAV-TAAD (C)-abgeleiteten primären HASMCs und TAV-TAAD (D)-abgeleiteten primären HASMCs unter statischen und Stammbedingungen. Repräsentatives Bild der Immunfluoreszenzfärbung von CNN1 in BAV-TAAD (E)-abgeleiteten primären HASMCs und TAV-TAAD (F)-abgeleiteten primären HASMCs unter statischen und Stammbedingungen. (G) Die relative Intensität der SM22- und CNN1-Immunfluoreszenzfärbung in BAV-TAAD-abgeleiteten primären HASMCs. (H) SM22 - und CNN1-mRNA-Expression in BAV-TAAD-abgeleiteten primären HASMCs unter statischen und Stammbedingungen. (I) Die relative Intensität der SM22- und CNN1-Immunfluoreszenzfärbung in TAV-TAAD-abgeleiteten primären HASMCs. (J) SM22 - und CNN1-mRNA-Expression in TAV-TAAD-abgeleiteten primären HASMCs unter statischen und Stammbedingungen. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, zweiseitig Student's t-Tests wurden verwendet, um die beiden Gruppen zu vergleichen. Die Daten zeigen Mittelwert ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Schematische Anleitung zur Gerätevorbereitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Mit der rasanten Entwicklung der mikrofluidischen Technologie sind in den letzten Jahren OOC-Modelle entstanden, die die biologische Funktion und Struktur eines oder mehrerer Organe in vitro für Anwendungen in Biologie, Medizin und Pharmakologie replizieren können15. OOC kann Schlüsselfunktionen der menschlichen physiologischen Mikroumgebung simulieren, die für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Förderung der präklinischen Arzneimitteltranslation unerlässlich sind 8,16. Obwohl sich OOC noch in einem frühen Stadium befindet und mehr Input benötigt wird, um das Design von OOC zu optimieren, wurden in den letzten Jahren große Fortschritte erzielt17,18. Im Gegensatz zu anderen dreidimensionalen Zellkulturmodellen kann OOC die biomechanischen Parameter des menschlichen Körpers nachahmen, die für die Gewebeentwicklung und die Aufrechterhaltung der Organfunktion unerlässlich sind. Organe und Gewebe des Herz-Kreislauf-Systems sind in vivo ständig flüssigkeitsinduzierter Scherung und zyklischer Spannung ausgesetzt. Daher müssen in vitro zelluläre Experimente des Herz-Kreislauf-Systems in einer experimentellen Plattform durchgeführt werden, die solche biomechanischen Parameter liefert, um realistische experimentelle Ergebnisse zu erhalten, die mit denen aus In-vivo-Studien vergleichbar sind.
In dieser Studie haben wir ein HASMC-OOC etabliert, das die Parameter der biomechanischen Belastung, der HASMCs ausgesetzt sind, präzise steuern kann. Es ist möglich, die Flüssigkeitsgeschwindigkeit und Flüssigkeitsscherung, der die Zellen ausgesetzt sind, sowie die Amplitude, Frequenz und den Rhythmus verschiedener zyklischer Dehnungsmuster präzise zu steuern. Von den vielen Materialien, die im Bereich OOC verwendet wurden, ist PDMS eines der am weitesten verbreiteten 19,20,21. PDMS ist transparent, flexibel, biokompatibel und atmungsaktiv, und diese Eigenschaften tragen zu seiner breiten Verwendung im Bereich der mikrofluidischen Chipsbei 19. Angelegte Druckänderungen können PDMS verformen, um die mechanische Kraft der Kontraktion und Entspannung zu erreichen, und die Permeabilität von PDMS stellt sicher, dass die Zellkulturumgebung auf dem Chip mit den Inkubationsbedingungen von 5% CO2 bei 37 °C im Inkubator konsistent sein kann. Daher bietet PDMS nicht nur kontrollierte mechanische Kraft für die Zellen, sondern auch eine Kulturumgebung, die für normales Zellwachstum geeignet ist. Unsere experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Morphologie und Aktivität der im PDMS-Chip kultivierten Zellen mit den 2D-Kulturbedingungen übereinstimmen, was darauf hindeutet, dass PDMS biokompatibel ist.
Unter biomimetischen in vivo physiologischen Bedingungen werden HASMCs in der Aortenwand der zyklischen Belastung von ca. 9% ausgesetzt22. Bei pathologischen Zuständen wie Bluthochdruck, Aortendilatation und Aortenaneurysma sind HASMCs einer zyklischen Belastung von mehr als 16% ausgesetzt23. Wir charakterisierten die Zugeigenschaften des PDMS-Chips, und die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass ein Vakuumdruck von 10 kPa 7,18 ± 0,44% Dehnung und 15 kPa induzierte 17,28 ± 0,91% Dehnung induzierte. Zusätzlich kann die Frequenz der Dehnung und der Flüssigkeitsscherspannung durch dieses PDMS-Chipsystem gesteuert werden. Unter Verwendung von BAV-TAAD und TAV-TAAD patientenabgeleiteten primären HASMCs können die molekularen Mechanismen und das Arzneimittelscreening dieser Aortenerkrankungen mit diesem HASMC-OOC in vitro Modell durchgeführt werden, das die Krankheitspathogenese verschiedener Aortenerkrankungen replizieren kann. Mit diesem System haben wir ein Krankheitsmodell zur Untersuchung der Pathogenese von BAV-TAAD etabliert und gezeigt, dass der mitochondriale Fusionsaktivator die mitochondriale Dysfunktion in erkrankten Zellen teilweise retten könnte24.
Das HASMC-OOC wurde basierend auf der Inspiration und Referenz von Lung-on-a-Chip aus Ingbers Arbeit9 entworfen. Ihr Gerät replizierte physiologische Atembewegungen der Alveolen in der Lunge, und der Chip bestand aus drei Schichten: oberen und unteren Medienkanälen, einer porösen PDMS-Membran und zwei seitlichen Vakuumkammern. Seitliche Vakuumkammern können nur in spezialisierten Laboratorien mit fortschrittlicher mikrofluidischer Ausrüstung hergestellt werden. Um die Montage unter allgemeineren Laborbedingungen zu ermöglichen, haben wir die Vakuumkammern oben und unten auf dem Chip platziert. Beide Dehnungsansätze haben ähnliche Funktionen, so dass die Chipstruktur entsprechend den Laborbedingungen und dem Forschungsbedarf so gewählt werden kann. Um die röhrenförmige Struktur der menschlichen Aorta strukturell zu etablieren und mehr biologische Proben aus den Zellen für die Durchführung weiterer komplexer biologischer Analysen und experimenteller Assays zu erhalten, etablierten wir einen fünfschichtigen PDMS-Chip mit größeren Kanälen, der aus einem mittleren Mittelkanal, zwei PDMS-Membranen sowie oberen und unteren Vakuumkammern bestand. Zwei PDMS-Membranen und die großen Kanäle des PDMS-Chips vergrößerten die Zellkulturfläche auf bis zu 8,4cm2 und lieferten genügend Proben für die Proteinanalyse. Die zuvor berichteten Plattformen konzentrierten sich hauptsächlich auf die Untersuchung kleinerer arterieller Erkrankungen wie einer Hirnarterie, eines peripheren Gefäßes oder anderer arterieller Erkrankungen25,26. Die Aorta ist ein großes Gefäß mit einem Durchmesser von 25-35 mm, und die Tunica media der Aorta besteht hauptsächlich aus glatten Muskelzellen, die einer hohen Zugbelastung ausgesetzt sind. Die Pathologie der Aortopathie ist mit dem Umbau der Aortenwand, der Apoptose glatter Muskelzellen und dem phänotypischen Schalten verbunden, die alle durch mechanische Belastung reguliert werden können. Daher sind patientenabgeleitete HASMCs und Zugbelastungen wesentliche Komponenten für den Erfolg von HASMC-OOC. Es gibt jedoch einige Einschränkungen für diese Studie. HASMC-OOC verwendete keine kokultivierten vaskulären Zellen, einschließlich HASMCs, Aortenendothelzellen und Fibroblasten, die die In-vivo-Mikroumgebung der menschlichen Aorta besser simulieren könnten und verwendet werden können, um die Interaktion zwischen diesen Zellen zu untersuchen. Obwohl HASMCs einer rhythmischen Belastung ausgesetzt sind, werden die Zellen immer noch auf einer flachen PDMS-Membran kultiviert, die die extrazelluläre Matrix nicht nachahmt. In zukünftigen Studien werden wir diese Einschränkungen überwinden, indem wir mikrofluidische Chips mit 3D-Bioprinting-Technologie kombinieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren bestätigen, dass diese Arbeit durch Zuschüsse der Science and Technology Commission der Stadtverwaltung Shanghai (20ZR1411700), der National Natural Science Foundation of China (81771971) und des Shanghai Sailing Program (22YF1406600) unterstützt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
