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Cancer Research

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन के लिए फार-रेड फ्लोरोसेंट सेनेसेंस-संबद्ध β-गैलेक्टोसिडेस जांच

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

सेल कल्चर या मुराइन ट्यूमर मॉडल में कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा प्रेरित सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट, फ्लो साइटोमेट्रिक परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। वैकल्पिक प्रक्रियाओं में सह-इम्यूनोस्टेनिंग, बड़े बैच या समय बिंदु विश्लेषण की सुविधा के लिए नमूना निर्धारण, और प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग द्वारा व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं का संवर्धन शामिल है।

Abstract

सेलुलर सेनेसेंस जैविक क्षति से प्रेरित प्रोलिफेरेटिव गिरफ्तारी की स्थिति है जो आम तौर पर उम्र बढ़ने वाली कोशिकाओं में वर्षों से होती है, लेकिन विभिन्न कैंसर उपचारों से प्रेरित क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं में भी तेजी से उभर सकती है। ट्यूमर सेल सेनेसेंस को आमतौर पर अवांछनीय माना जाता है, क्योंकि सेनेसेंट कोशिकाएं मृत्यु के लिए प्रतिरोधी हो जाती हैं और ट्यूमर दुर्दमता और उपचार प्रतिरोध को बढ़ाते हुए ट्यूमर छूट को अवरुद्ध करती हैं। इसलिए, सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान कैंसर अनुसंधान समुदाय के लिए चल रही रुचि है। विभिन्न सेनेसेंस परख मौजूद हैं, जिनमें से कई प्रसिद्ध सेनेसेंस मार्कर, सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेज (एसए-β-गैल) की गतिविधि पर आधारित हैं।

आमतौर पर, एसए-β-गैल परख को निश्चित कोशिकाओं पर क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट (एक्स-गैल) का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा "नीली" सेनेसेंट कोशिकाओं की धीमी और व्यक्तिपरक गणना होती है। सेल-परमेंट, फ्लोरोसेंट एसए-β-गैल सब्सट्रेट्स का उपयोग करके बेहतर परख, जिसमें सी12-एफडीजी (ग्रीन) और डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड (डीडीएओजी; दूर-लाल) शामिल हैं, ने जीवित कोशिकाओं के विश्लेषण को सक्षम किया है और फ्लो साइटोमीटर सहित उच्च-थ्रूपुट फ्लोरोसेंट विश्लेषण प्लेटफार्मों के उपयोग की अनुमति दी है। सी12-एफडीजी एसए-β-गैल के लिए एक अच्छी तरह से प्रलेखित जांच है, लेकिन इसका हरा फ्लोरोसेंट उत्सर्जन आंतरिक सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस (एएफ) के साथ ओवरलैप होता है जो लिपोफसिन समुच्चय के संचय के कारण सेनेसेंस के दौरान उत्पन्न होता है। दूर-लाल एसए-β-गैल जांच डीडीएओजी का उपयोग करके, हरे सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग सेनेसेंस की पुष्टि करने के लिए द्वितीयक पैरामीटर के रूप में किया जा सकता है, जिससे परख में विश्वसनीयता जुड़ जाती है। शेष प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग सेल व्यवहार्यता धुंधला या वैकल्पिक फ्लोरोसेंट इम्यूनोलेबलिंग के लिए किया जा सकता है।

फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए, हम सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान के लिए दोहरे पैरामीटर परख के रूप में डीडीएओजी और लिपोफसिन ऑटोफ्लोरेसेंस के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित की जाती है। यदि वांछित हो, तो रुचि के सेल सतह एंटीजन का मूल्यांकन करने के लिए एक वैकल्पिक इम्यूनोलेबलिंग चरण शामिल किया जा सकता है। पहचाने गए सेनेसेंट कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्रिक रूप से क्रमबद्ध किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। एकत्रित सेनेसेंट कोशिकाओं को तुरंत लाइसिस किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, इम्यूनोएसे या 'ओमिक्स विश्लेषण के लिए) या आगे सुसंस्कृत किया जा सकता है।

Introduction

सामान्य जैविक उम्र बढ़ने के दौरान सेनेसेंट कोशिकाएं आमतौर पर जीवों में जमा होती हैं, लेकिन विकिरण और कीमोथेरेपी सहित विभिन्न कैंसर उपचारों से प्रेरित क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं में तेजी से विकसित हो सकती हैं। हालांकि अब प्रसार नहीं हो रहा है, चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंट (टीआईएस) ट्यूमर कोशिकाएं उपचार प्रतिरोध में योगदान कर सकती हैं और पुनरावृत्ति 1,2,3 चला सकती हैं। टीआईएस कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारक प्रतिरक्षा चोरी या मेटास्टेसिस4,5 को बढ़ावा देकर ट्यूमर घातकता को बढ़ा सकते हैं। टीआईएस कोशिकाएं जटिल, संदर्भ-विशिष्ट फेनोटाइप, परिवर्तित चयापचय प्रोफाइल और अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं विकसित करती हैं 6,7,8। इसलिए, विभिन्न कैंसर उपचार दृष्टिकोणों द्वारा प्रेरित टीआईएस ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन कैंसर अनुसंधान समुदाय के लिए चल रही रुचि का विषय है।

टीआईएस ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, पारंपरिक सेनेसेंस परख का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, मुख्य रूप से सेनेसेंस मार्कर एंजाइम, लाइसोसोमल बीटा-गैलेक्टोसिडेस जीएलबी 19 की बढ़ती गतिविधि का पता लगाने के आधार पर। निकट-तटस्थ (अम्लीय के बजाय) लाइसोसोमल पीएच पर पता लगाने से सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस (एसए-β-गैल) 10 का विशिष्ट पता लगाने की अनुमति मिलती है। एक मानक एसए-β-गैल परख जिसका उपयोग कई दशकों से किया जा रहा है, प्रकाश माइक्रोस्कोपी11 द्वारा निश्चित कोशिकाओं में एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए एक्स-गैल (5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड), एक नीले क्रोमोजेनिक बीटा-गैलेक्टोसिडेस सब्सट्रेट का उपयोग करता है। एक्स-गैल परख आमतौर पर उपलब्ध अभिकर्मकों और प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके टीआईएस की गुणात्मक दृश्य पुष्टि की अनुमति देती है। एक बुनियादी संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोप नीले क्रोमोजेन की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक एकमात्र उपकरण है। हालांकि, एक्स-गैल स्टेनिंग प्रक्रिया में संवेदनशीलता की कमी हो सकती है, कभी-कभी रंग विकसित करने के लिए 24 घंटे से अधिक की आवश्यकता होती है। धुंधलापन के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नीले क्रोमोजेन की तीव्रता के कुछ स्तर का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं की गिनती के आधार पर व्यक्तिगत सेनेसेंट कोशिकाओं का कम-थ्रूपुट, व्यक्तिपरक स्कोरिंग होता है। चूंकि एक्स-गैल सेल-अभेद्य है, इस परख को विलायक-निश्चित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जिसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता है। जानवरों या रोगियों के सीमित नमूनों के साथ काम करते समय, यह एक बड़ी खामी हो सकती है।

सेल-परगम्य, फ्लोरोसेंट एंजाइम सब्सट्रेट्स का उपयोग करके बेहतर एसए-β-गैल परख, जिसमें सी12-एफडीजी (5-डोडेकैनोइलामिनोफ्लोरेसिन डी-β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड, ग्रीन) और डीडीएओजी (9एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन-7-वाईएल) β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड, दूर-लाल) शामिल हैं। डीडीएओजी की रासायनिक जांच संरचना और ऑप्टिकल विशेषताओं को पूरक चित्र एस 1 में दिखाया गया है। ये सेल-परगम्य जांच जीवित (निश्चित के बजाय) कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देती है, और क्रोमोजेनिक जांच के बजाय फ्लोरोसेंट तेजी से उच्च-थ्रूपुट फ्लोरोसेंट विश्लेषण प्लेटफार्मों के उपयोग की सुविधा प्रदान करते हैं, जिसमें उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग उपकरण और प्रवाह साइटोमीटर शामिल हैं। सॉर्टिंग फ्लो साइटोमीटर डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, पश्चिमी सोख्ता, एलिसा, या 'ओमिक्स) के लिए सेल संस्कृतियों या ट्यूमर से जीवित सेनेसेंट कोशिकाओं की समृद्ध आबादी की वसूली को सक्षम करता है। प्रतिदीप्ति विश्लेषण एक मात्रात्मक संकेत भी प्रदान करता है, जिससे किसी दिए गए नमूने के भीतर सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत का अधिक सटीक निर्धारण हो सकता है। व्यवहार्यता जांच और फ्लोरोफोरे-लेबल एंटीबॉडी सहित अतिरिक्त फ्लोरोसेंट जांच, एसए-β-गैल से परे लक्ष्यों के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए आसानी से जोड़ा जा सकता है।

डीडीएओजी के समान, सी12-एफडीजी एसए-β-गैल के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच है, लेकिन इसका हरा फ्लोरोसेंट उत्सर्जन आंतरिक सेलुलर एएफ के साथ ओवरलैप होता है, जो कोशिकाओं16 में लिपोफसिन समुच्चय के संचय के कारण सेनेसेंस के दौरान उत्पन्न होता है। दूर-लाल डीडीएओजी जांच का उपयोग करके, हरे सेलुलर एएफ को सेनेसेंस17 की पुष्टि करने के लिए द्वितीयक पैरामीटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एसए-β-गैल के अलावा एक दूसरे मार्कर का उपयोग करके परख विश्वसनीयता में सुधार करता है, जो अक्सर सेनेसेंस18 के लिए एकल मार्कर के रूप में अविश्वसनीय हो सकता है। चूंकि सेनेसेंट कोशिकाओं में अंतर्जात एएफ का पता लगाना एक लेबल-मुक्त दृष्टिकोण है, इसलिए यह हमारे डीडीएओजी-आधारित परख की विशिष्टता का विस्तार करने का एक तेज़ और सरल तरीका है।

इस प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो संस्कृतियों से व्यवहार्य टीआईएस ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान के लिए एक तेजी से, दोहरे पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री परख के रूप में डीडीएओजी और एएफ के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं या चूहों में स्थापित दवा-उपचारित ट्यूमर से अलग होते हैं (चित्रा 1)। प्रोटोकॉल मानक वाणिज्यिक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषक और सॉर्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत फ्लोरोफोर का उपयोग करता है (तालिका 1)। मानक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा सक्षम है। यदि वांछित हो, तो सेनेसेंस के साथ समवर्ती रूप से रुचि के सेल सतह एंटीजन का मूल्यांकन करने के लिए एक वैकल्पिक इम्यूनोलेबलिंग चरण किया जा सकता है। पहचाने गए सेनेसेंट कोशिकाओं को मानक प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) पद्धति का उपयोग करके भी समृद्ध किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: प्रायोगिक वर्कफ़्लो. डीडीएओजी परख के प्रमुख बिंदुओं का एक योजनाबद्ध सारांश। (ए) एक टीआईएस-उत्प्रेरण दवा स्तनधारी सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ी जाती है या ट्यूमर-असर चूहों को प्रशासित की जाती है। टीआईएस की शुरुआत के लिए समय की अनुमति दी जाती है: कोशिकाओं के लिए, उपचार के 4 दिन बाद; चूहों के लिए, कुल 22 दिन, हर 5 दिनों में तीन उपचार और 7 दिन की वसूली के साथ। कोशिकाओं को काटा जाता है या ट्यूमर को निलंबन में अलग कर दिया जाता है। (बी) 30 मिनट के लिए एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए लाइसोसोमल पीएच को समायोजित करने के लिए बीएएफ के साथ नमूने का इलाज किया जाता है; फिर, एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए 60 मिनट के लिए डीडीएओजी जांच को जोड़ा जाता है। नमूने पीबीएस में 2x धोए जाते हैं, और एक व्यवहार्यता दाग संक्षेप में जोड़ा जाता है (15 मिनट)। वैकल्पिक रूप से, नमूने खुले प्रतिदीप्ति चैनलों में फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग दिए जा सकते हैं और / या बाद के विश्लेषण के लिए तय किए जा सकते हैं। (सी) नमूने एक मानक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। व्यवहार्य कोशिकाओं को लाल डीडीएओजी (एसए-β-गैल का संकेत) बनाम हरे ऑटोफ्लोरेसेंस (लिपोफसिन) को दिखाते हुए डॉट प्लॉट्स में देखा जाता है। टीआईएस कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एक गेट अनुपचारित नियंत्रण नमूनों (नहीं दिखाया गया) के आधार पर स्थापित किया गया है। यदि एक सॉर्टिंग साइटोमीटर (एफएसीएस) का उपयोग किया जाता है, तो टीआईएस कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है और आणविक जीव विज्ञान परख के लिए आगे इन विट्रो परख या लाइस और संसाधित करने के लिए संस्कृति में वापस रखा जा सकता है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; टीआईएस = चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंस; एफएल-एबी = फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी; बाफ = बाफिलोमाइसिन ए 1; एसए-β-गैल = सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फ्लोरोफोरे पाता एक्स/ईएम (एनएम) साइटोमीटर लेजर (एनएम) साइटोमीटर डिटेक्टर / बैंडपास फिल्टर (एनएम)
डीडीएओजी एसए-β-गैल 645/6601 640 670 / 30
वायुसेना लिपोफुसिन < 600 488 525 / 50
CV450 व्यावहारिकता 408/450 405 450 / 50
पीई एंटीबॉडी/ सतह मार्कर 565/578 561 582 / 15

तालिका 1: फ्लोरोफोरेस और साइटोमीटर ऑप्टिकल विनिर्देश। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले साइटोमीटर विनिर्देशों को कुल 4 लेजर और 15 उत्सर्जन डिटेक्टरों के साथ एक उपकरण के लिए सूचीबद्ध किया गया है। 645/660 एनएम पर पाया गया डीडीएओजी एसए-β-गैल1 द्वारा की गई जांच का रूप है। अशुद्ध डीडीएओजी 460/610 एनएम पर निम्न स्तर की प्रतिदीप्ति प्रदर्शित कर सकता है लेकिन प्रोटोकॉल में धोने के चरणों द्वारा हटा दिया जाता है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एसए-β-गैल = सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस।

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Protocol

वर्णित सभी पशु कार्य शिकागो विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. स्टॉक समाधान की तैयारी और भंडारण

नोट: यदि कोशिकाओं को प्रवाह-क्रमबद्ध किया जाएगा, तो सभी समाधान बाँझ तकनीकों का उपयोग करके तैयार किए जाने चाहिए और 0.22 μm फ़िल्टर डिवाइस के माध्यम से फ़िल्टर किए जाने चाहिए।

  1. डीएमएसओ में 5 मिलीग्राम / एमएल पर डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड का स्टॉक समाधान तैयार करें। 50 μL प्रति ट्यूब (या वांछित मात्रा) पर एलिकोट। 1 वर्ष तक अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. डीएमएसओ में 1 एमएम पर बाफिलोमाइसिन ए 1 का स्टॉक समाधान तैयार करें। 50 μL प्रति ट्यूब (या वांछित मात्रा) पर एलिकोट। 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. डीएमएसओ में 1 एमएम पर कैल्सीन वायलेट 450 एएम का स्टॉक समाधान तैयार करें। 50 μL प्रति ट्यूब (या वांछित मात्रा) पर एलिकोट। 1 वर्ष तक अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के उपचार के लिए, उपयुक्त विलायक में सेनेसेंस-उत्प्रेरण एजेंट (ओं) के 10 एमएम केंद्रित स्टॉक समाधान तैयार करें, और 0.2 μm सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके निष्फल करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या निर्माता द्वारा निर्देशित के रूप में।
    नोट: विवो (स्थापित ट्यूमर वाले चूहों ) में सेनेसेंस-उत्प्रेरण कीमोथेरेपी एजेंटों के वितरण के लिए, एजेंटों को यूएसपी ग्रेड होना चाहिए और इंजेक्शन से ठीक पहले केंद्रित स्टॉक से खारा में पतला किया जाना चाहिए।
  5. उपयोग की जा रही सेल लाइन (ओं) के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, डीएमईएम 1x + 10% FBS + 1x ग्लूटामाइन विकल्प + 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ B16-F10 या A549 कोशिकाओं के लिए माध्यम तैयार करें। मीडिया को बाँझ रखा जाना चाहिए। अन्य सेल लाइन-विशिष्ट मीडिया योगों का उपयोग किया जा सकता है। ग्लूटाथियोन जैसे कुछ घटक, कुछ मामलों में, सेनेसेंस की शुरुआत में हस्तक्षेप कर सकते हैं। विभिन्न मीडिया योगों का अनुभवजन्य परीक्षण आयोजित किया जाना चाहिए यदि सेनेसेंस की शुरुआत अपेक्षा से कम है या नियंत्रण कीमोथेरेपी एजेंटों के साथ नहीं देखी गई है।
  6. धुंधला और धोने के बफर तैयार करें।
    1. धुंधला प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए 1x PBS में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) तैयार करें। बीएसए के 2 ग्राम को 200 एमएल पीबीएस में घोलें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए या पूरी तरह से घुलने तक हिलाएं।
    2. वॉश बफर के रूप में 1x PBS में 0.5% बीएसए तैयार करें। चरण 1.6.1 में तैयार 1% बीएसए के 100 एमएल को 0.5% बीएसए के लिए 1x PBS के 100 mL में पतला करें।
    3. 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर स्टोर करें।
  7. 1x PBS में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड तैयार करें। सुविधा और स्थिरता के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सील किए गए पैराफॉर्मलडिहाइड एम्प्यूल्स (जैसे, 16% वी / वी) का उपयोग करें: 16% पीएफए का 2.5 एमएल + 1x पीबीएस का 7.5 एमएल (= 4% पीएफए का 10 एमएल)। प्रति प्रयोग आवश्यक कुल मात्रा के आधार पर तैयार मात्रा समायोजित करें।
    नोट: केवल सेल निर्धारण के लिए आवश्यकतानुसार तैयार करें; हर बार ताजा तैयार करें।
  8. एफएसीएस सॉर्टिंग बफर तैयार करें: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% बीएसए (पीएच 7.2)। 0.22 μm निस्पंदन डिवाइस के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर करें और 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: केवल एफएसीएस सॉर्टिंग के लिए आवश्यकतानुसार तैयार करें। प्रवाह-छंटाई बफर फॉर्मूलेशन एफएसीएस उपकरणों में भिन्न हो सकते हैं। उपरोक्त सूत्रीकरण इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपकरण के साथ संगत है ( सामग्री की तालिका देखें)। निर्माता के दिशानिर्देशों से परामर्श करें।
  9. ट्यूमर पृथक्करण समाधान तैयार करें: RPMI-1640 मीडिया (FBS या अन्य पूरक के बिना) में 20 μg / mL Liberase TL + 100 μg / mL DNAse I। स्टॉक समाधान लाइबेरेस टीएल (निर्माता द्वारा निर्देशित के रूप में तैयार और संग्रहीत) और डीएनएस आई (डबल-डिस्टिल्ड पानी [डीडीएच 2 ओ] में 100 मिलीग्राम / एमएल, -20डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के हाथ पर रखने के लिए उपयोगी हैं।
    नोट: केवल ट्यूमर का उपयोग करते समय आवश्यकतानुसार तैयारी करें; हर बार ताजा तैयार करें।

2. सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं में कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा सेनेसेंस का प्रेरण

नोट: इस खंड में सभी सेल हेरफेर चरणों को बाँझ प्रथाओं का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए। यह खंड अनुयायी सेल प्रकारों के लिए लिखा गया है। निलंबन कोशिकाओं का उपयोग उचित संशोधनों के साथ किया जा सकता है जैसा कि उल्लेख किया गया है।

  1. आपूर्तिकर्ता या प्रयोगशाला से मानक प्रोटोकॉल के अनुसार कैंसर सेल लाइन (ओं) को विकसित करें जिसने उपयोग की जाने वाली विशिष्ट सेल लाइन (ओं) को प्रदान किया।
    नोट: कम मार्ग कोशिकाओं (पी < 10) को आम तौर पर पसंद किया जाता है क्योंकि अनुपचारित सेल नमूनों में प्रतिकृति सेनेसेंस के निम्न स्तर होंगे, यानी कम पृष्ठभूमि होगी।
  2. दवाओं द्वारा सेनेसेंस प्रेरण से एक दिन पहले, ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ कोशिकाओं की कटाई 0.25% (या सिफारिश के अनुसार)। पूर्ण संस्कृति माध्यम की एक समान मात्रा जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें, और सेल निलंबन को बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: निलंबन कक्षों के लिए इस चरण की आवश्यकता नहीं है।
  3. मानक हेमसाइटोमीटर विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और कोशिकाओं / एमएल को रिकॉर्ड करें। मानक 6-वेल प्लास्टिक कल्चर व्यंजनों में 1 × 103-10 × 103 कोशिकाओं / सेमी2 पर प्लेट कोशिकाएं।
    नोट: इष्टतम चढ़ाना घनत्व कोशिकाओं की प्रसार दर पर निर्भर है और उपयोगकर्ता-निर्धारित होना चाहिए। उपचार के समय कोशिकाओं को लगभग 10% -20% कंफ्लुएंसी पर लॉग चरण वृद्धि में होना चाहिए (यानी, चढ़ाना के बाद 18-24 घंटे इनक्यूबेशन बाद)। निलंबन कोशिकाओं के प्रारंभिक घनत्व (कोशिकाओं / एमएल) को उपयोगकर्ता-निर्धारित किया जाना चाहिए। छह-वेल प्लेटें आमतौर पर एक मानक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नमूने के लिए प्रति अच्छी तरह से पर्याप्त सेनेसेंट कोशिकाएं उत्पन्न करती हैं। यदि प्रवाह-छंटाई होती है, तो डाउनस्ट्रीम परख (≥1 × 106) के लिए पर्याप्त संख्या में सेनेसेंट कोशिकाओं की वसूली को सक्षम करने के लिए एक बहुत बड़े सतह क्षेत्र (जैसे, कई पी 150 प्लेट) का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. 5% सीओ 2 और आर्द्रता पैन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर (18-24 घंटे) प्लेटेड कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. सेनेसेंस-उत्प्रेरण कीमोथेरेपी दवा (ओं) के साथ प्लेटेड कोशिकाओं का इलाज करें। कम से कम एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें, उदाहरण के लिए, एटोपोसाइड (ईटीओ) या ब्लीमाइसिन (बीएलएम)। प्रति दवा डुप्लिकेट कुएं तैयार करें। नियंत्रण के रूप में केवल वाहन के साथ इलाज किए गए एक सेट को शामिल करें।
    नोट: उपयोग की जा रही सेल लाइन (ओं) में सेनेसेंस प्रेरण के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए उपयोगकर्ता द्वारा प्रत्येक प्रयोगात्मक एजेंट के लिए एक खुराक वक्र का परीक्षण किया जाना चाहिए।
  6. सेनेसेंस की शुरुआत की अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 और आर्द्रता पैन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अपेक्षित आकृति विज्ञान परिवर्तनों के लिए दैनिक जांच करें।
    नोट: सेनेसेंस की शुरुआत की दर के आधार पर 3-5 दिनों से इनक्यूबेशन बार स्वीकार्य हो सकता है। मीडिया को बदला जा सकता है और एजेंट को फिर से लागू किया जा सकता है (या नहीं), जैसा कि वांछित है, स्वस्थ विकास की स्थिति को बढ़ावा देने के लिए, सेनेसेंट कोशिकाओं के स्वीकार्य प्रतिशत को प्राप्त करने के लिए।
  7. सेनेसेंस की शुरुआत के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए 0.25% जोड़कर कोशिकाओं की कटाई करें। जब कोशिकाओं को निलंबन में अलग किया जाता है, तो ट्रिप्सिन को पूर्ण माध्यम की समान मात्रा के साथ बेअसर करें।
    नोट: निलंबन में बढ़ने वाली कोशिकाओं के लिए इस चरण की आवश्यकता नहीं है। यदि सतह मार्कर धुंधला किया जाएगा, तो ट्रिप्सिन-ईडीटीए के उपयोग से बचें क्योंकि यह अस्थायी रूप से कोशिकाओं पर सतह एंटीजन को नष्ट कर सकता है। इसके बजाय, एक बाँझ प्लास्टिक सेल स्क्रैपर (या सतह एंटीजन को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक वैकल्पिक पृथक्करण अभिकर्मक) का उपयोग करके मोनोलेयर को धीरे से अलग करें।
  8. हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में कोशिकाओं की गणना करें। प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं / एमएल की गणना करें।
    नोट: इस बिंदु पर मृत कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन करने के लिए ट्रिपैन ब्लू जोड़ा जा सकता है (यानी, दवा उपचार के कारण), लेकिन डीडीएओजी धुंधला वर्कफ़्लो के दौरान फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता डाई के साथ सेल मृत्यु भी निर्धारित की जाएगी।
  9. एलिकोट ≥0.5 × प्रति नमूना 106 कोशिकाओं को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बदल दिया।
    नोट: प्रति नमूना कोशिकाओं की संख्या सभी नमूनों में मानकीकृत की जानी चाहिए।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 1,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    नोट: यदि एक प्रशीतित माइक्रोसेंट्रीफ्यूज अनुपलब्ध है, तो कुछ लचीला सेल प्रकारों के लिए परिवेश के तापमान पर सेंट्रीफ्यूजेशन करना स्वीकार्य हो सकता है।
  11. धारा 4 में डीडीएओजी धुंधला होने पर आगे बढ़ें।

3. चूहों में स्थापित ट्यूमर में कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा सेनेसेंस का प्रेरण

नोट: यदि ट्यूमर कोशिकाओं को एफएसीएस-क्रमबद्ध किया जाएगा, तो जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करके और बाँझ उपकरणों, प्रक्रियाओं और अभिकर्मकों के साथ काम करके प्रत्येक चरण में बाँझपन सुनिश्चित करें।

  1. मानक विधियों (जैसे, अप्पेल्बे एट अल.19) के अनुसार, कैंसर कोशिकाओं को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करके माउस ट्यूमर मॉडल बनाएं।
    नोट: इंजेक्शन के लिए कैंसर कोशिकाओं की संख्या, इंजेक्शन साइट और उपयुक्त माउस तनाव को प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यहां, बी 16-एफ 10 कोशिकाओं को 0.1 एमएल खारा (1 × 10 7 कोशिकाओं / एमएल) में 1 × 106 कोशिकाओं पर चमड़े के नीचे इंजेक्ट कियागया था।
    1. सत्यापित करें कि इंजेक्शन करने से पहले ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करने वाली कोशिकाओं की व्यवहार्यता >90% है। आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    2. 6-7 सप्ताह की मादा सी 57 / बीएल 6 चूहों को 3% आइसोफ्लुरेन और हवा के मिश्रण के साथ एनेस्थेटाइज करें और इन स्थितियों के तहत एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर रखे गए प्रेरण कक्ष में बनाए रखें। माउस के पैर को धीरे से दबाकर संज्ञाहरण की पुष्टि करें। प्रक्रिया के दौरान कॉर्नियल सुखाने से रोकने के लिए दोनों आंखों पर बाँझ पशु चिकित्सा मरहम लागू करें। प्रक्रिया के दौरान, हीटिंग लैंप का उपयोग करके माउस शरीर के तापमान को बनाए रखें।
    3. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर काम करते हुए, माउस को प्रेरण कक्ष से हटा दें और इसे 3% आइसोफ्लुरेन आपूर्ति प्रदान करने वाले नाक शंकु के संपर्क में रखें। एक साफ इलेक्ट्रिक रेजर का उपयोग करके इंजेक्शन साइट पर फ्लैंक क्षेत्र को शेव करें। इंजेक्शन से ठीक पहले ट्यूब को मैन्युअल रूप से मोड़कर तैयार सेल सस्पेंशन को संक्षेप में मिलाएं, और बाँझ 27 जी सुई के साथ फिट किए गए बाँझ 0.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके सेल निलंबन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें। माउस को हुड से निकालें और इसे रिकवरी पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    4. रिकवरी पिंजरे में, चूहों के महत्वपूर्ण संकेतों की लगातार निगरानी करें जब तक कि वे उरोस्थि पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना हासिल नहीं कर लेते हैं, राइटिंग रिफ्लेक्स का प्रदर्शन करते हैं, और पिंजरे में सुरक्षित रूप से घूमने में सक्षम होते हैं। चूहों को लावारिस न छोड़ें या उन जानवरों को वापस न करें जो ट्यूमर सेल टीकाकरण से गुजर चुके हैं, जब तक कि पूरी तरह से ठीक न हो जाएं। वजन घटाने, कम गतिविधि / गतिशीलता और न्यूरोलॉजिकल लक्षणों के लिए दैनिक सभी टीकाकृत चूहों की निगरानी करें; किसी भी श्रेणी में गंभीर लक्षण प्रदर्शित करने वाले चूहों को इच्छामृत्यु। टीकाकरण के बाद दर्द के लक्षणों का प्रदर्शन करने वाले चूहों के लिए, एक बार चमड़े के नीचे ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1-0.2 मिलीग्राम / किग्रा) का उपयोग करें।
      नोट: ब्यूप्रेनोर्फिन के बाद लगातार दर्द का प्रदर्शन करने वाले चूहों को इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए।
  2. कैंसर सेल टीकाकरण के 5-7 दिनों के बाद, हर 2-3 दिनों में कैलिपर्स के साथ ट्यूमर के विकास को मापें। जब ट्यूमर मात्रा में 50 मिमी3 ± 10 मिमी3 तक पहुंच गया हो तो प्रोसेनसेंट उपचार शुरू करें।
    नोट: इस काम में, यूएसपी ग्रेड डॉक्सोर्यूबिसिन हाइड्रोक्लोराइड (डीओएक्स) या पीईजीलेटेड लिपोसोमल डॉक्सोर्यूबिसिन (पीएलडी) की खुराक 10 मिलीग्राम / किग्रा पर 0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन (यूएसपी) में प्रशासित की गई थी। दवाओं को इंट्रापरिटोनियल 3x, हर 5 दिनों में एक बार इंजेक्ट किया गया था, जब ट्यूमर 50 मिमी3 ± 10 मिमी3 तक पहुंच गया था। ट्यूमर में टीआईएस की शुरुआत की अनुमति देने के लिए अंतिम उपचार के बाद चूहे 7 दिनों के लिए ठीक हो गए। अन्य उपचारों और / या ट्यूमर मॉडल के लिए सेनेसेंस प्रेरण खुराक और स्थितियों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  3. अंतिम दवा उपचार के 7 दिनों के बाद, प्रयोगशाला पशु कार्य दिशानिर्देशों के अनुपालन में सीओ2 ओवरडोज और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या अन्य अनुमोदित तरीकों से चूहों का बलिदान करें। ट्यूमर का उत्पादन करें और उन्हें बाँझ आरपीएमआई विकास माध्यम से भरे बाँझ ट्यूबों या 6-वेल प्लेटों में इकट्ठा करें (प्रसंस्करण के दौरान व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए)।
    नोट: यदि एक हिस्टोलॉजिकल परीक्षा (जैसे, एक्स-गैल या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री) का प्रदर्शन किया जाता है, तो ट्यूमर को यहां विभाजित किया जा सकता है, जिसमें ओसीटी में एक आधा स्नैप-जमे हुए माध्यम को एम्बेड किया जाता है और जमे हुए ऊतक हिस्टोलॉजी के लिए मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके क्रायोसेक्शन किया जाता है। शेष ट्यूमर आधे को पृथक्करण और डीडीएओजी धुंधला करने के लिए प्रचुर मात्रा में सामग्री प्राप्त करनी चाहिए।
  4. एक ट्यूमर को पी 100 प्लास्टिक डिश में स्थानांतरित करें जिसमें आरपीएमआई माध्यम के 5 एमएल होते हैं। स्केलपेल का उपयोग करके ट्यूमर को टुकड़ों में काट लें।
  5. निलंबित कोशिकाओं और मलबे वाले ट्यूमर के टुकड़ों के निलंबन के 5 एमएल को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि बड़ा मलबा मौजूद है तो इस निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए 25 एमएल सीरोलॉजिकल पाइपेट की व्यापक नोक का उपयोग करें। सामग्री एकत्र करने के लिए बाँझ आरपीएमआई की अतिरिक्त मात्रा के साथ पकवान को कुल्ला करें। शंक्वाकार ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  6. शेष ट्यूमर के लिए चरण 3.45-3.5 दोहराएं। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक ट्यूमर के लिए एक अलग प्लेट और स्केलपेल का उपयोग करें, या ट्यूमर के बीच पीबीएस के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें। प्रत्येक ट्यूमर को काटने के लिए 5 एमएल ताजा माध्यम का उपयोग करें।
  7. ट्यूमर पृथक्करण समाधान तैयार करें: RPMI-1640 मीडिया (FBS के बिना) में 20 μg / mL Liberase TL + 100 μg / mL DNAse I।
    नोट: ट्यूमर पृथक्करण समाधान के लिए कई प्रभावी फॉर्मूलेशन मौजूद हैं और इसमें विभिन्न निर्माताओं से विभिन्न प्रकार के एंजाइम और अन्य घटक शामिल हो सकते हैं। घटकों की इष्टतम सांद्रता ट्यूमर प्रकारों में बहुत भिन्न हो सकती है। यदि ट्यूमर में लाल रक्त कोशिकाएं अत्यधिक मौजूद हैं, तो लाल रक्त कोशिका लाइसिस भी आयोजित किया जा सकता है; यदि मृत कोशिकाएं एक समस्या हैं, तो एक मृत कोशिका हटाने वाली किट का उपयोग किया जा सकता है। उपयोगकर्ता के लिए स्वतंत्र रूप से इष्टतम ट्यूमर पृथक्करण स्थितियों को निर्धारित करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है जो दूषित कोशिकाओं, संयोजी सामग्री और मलबे की उच्च व्यवहार्यता और कम उपस्थिति प्रदान करते हैं।
  8. शंक्वाकार ट्यूबों में सभी ट्यूमर के नमूनों को 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  9. ट्यूमर सामग्री की मात्रा के आधार पर, प्रत्येक ट्यूमर नमूने में ट्यूमर पृथक्करण समाधान के 1-5 एमएल जोड़ें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब में ट्यूमर सामग्री गोली से 1-2 एमएल अधिक है। मिश्रण करने के लिए मध्यम गति पर भंवर।
  10. नमूनों को 45 मिनट के लिए तेजी से रोटेशन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। वोर्टेक्स हर 15 मिनट में संक्षेप में।
  11. प्रत्येक नमूने को 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें। यदि नमूने फ़िल्टर से गुजरने के लिए बहुत चिपचिपे हैं, तो पतला करने के लिए 10 एमएल आरपीएमआई -1640 माध्यम जोड़ें। अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए आरपीएमआई माध्यम के साथ फिल्टर को कुल्ला करें।
  12. प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं / एमएल की गणना करने के लिए एक हेमसाइटोमीटर का उपयोग करें।
  13. एलिकोट प्रति ट्यूमर नमूने में 5 × 106 कोशिकाओं की दो या अधिक प्रतिकृतियां।
  14. 1,000 × ग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  15. (वैकल्पिक) यदि वांछित हो तो बाद में डीडीएओजी धुंधला होने के लिए क्रायोपप्रिजर्वेशन ट्यूमर के नमूने।
    1. क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में अलग ट्यूमर सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें: 50% एफबीएस, 40% आरपीएमआई -1640, 10% डीएमएसओ, 5 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर बाँझ परिस्थितियों में तैयार कियागया ।
    2. प्रत्येक क्रायोवियल में सेल निलंबन के एलिकोट 1 एमएल।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक आइसोप्रोपेनोल सेल फ्रीजिंग कंटेनर में 24 घंटे के लिए क्रायोवियल्स फ्रीज करें; फिर, दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन क्रायोस्टोरेज में स्थानांतरण (>1 सप्ताह)।
    4. जब धुंधला होना वांछित हो, तो बर्फ पर क्रायोवियल्स को पिघलाएं और धारा 4 में डीडीएओजी धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: कुछ ट्यूमर क्रायोप्रिजर्वेशन के माध्यम से व्यवहार्य नहीं रह सकते हैं, और इस प्रक्रिया के लिए लचीलापन का मूल्यांकन उपयोगकर्ता द्वारा रुचि के ट्यूमर मॉडल के लिए किया जाना चाहिए।
  16. डीडीएओजी धुंधला करने के लिए धारा 4 पर आगे बढ़ें।

4. सेल या ट्यूमर के नमूनों में एसए-β-गैल का डीडीएओजी धुंधला होना

  1. 1 μM की अंतिम सांद्रता के लिए 1: 1,000x पर 1 mM Bafilomycin A1 स्टॉक को DMEM माध्यम (FBS के बिना) में पतला करें।
  2. 1 से 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए सेल पेलेट नमूने (चरण 2.11 या चरण 3.16 से) में तैयार बीएएफ-डीएमईएम समाधान जोड़ें ×।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि प्रति नमूना 0.5 × 106 कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो Baf-DMEM के 0.5 mL जोड़ें। ट्यूमर के लिए, 5 × 106 कोशिकाओं को 5 एमएल बीएएफ-डीएमईएम में दाग दिया जा सकता है।
  3. धीमी गति से एक घूर्णन/शेकर सेट पर 37 डिग्री सेल्सियस (सीओ2 के बिना) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: धुंधला प्रक्रिया के लिए सीओ2 इनक्यूबेटरों से बचें, जो समाधान को अम्लीय कर सकते हैं और इस तरह बीएएफ और डीडीएओजी धुंधला होने में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  4. धोने के बिना, प्रत्येक नमूने में 1:500x (10 μg / mL अंतिम) पर DDAOG स्टॉक समाधान (5 mg / mL) जोड़ें। पिपेट को मिक्स करना है। 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (सीओ2 के बिना) पर एक घूर्णन / शेकर पर प्रतिस्थापित करें। सीधे प्रकाश से बचाएं।
  5. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  6. 1 एमएल बर्फ से ठंडा 0.5% बीएसए प्रति ट्यूब और मिश्रण करने के लिए पिपेट से धोएं। ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोने के लिए इस चरण को 2x दोहराएं। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और आगे बढ़ें।
    नोट: अशुद्ध डीडीएओजी को हटाने के लिए चरण 4.6 में धोने के चरणों को करना महत्वपूर्ण है, जो अवांछित प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (460/610 एनएम) प्रदर्शित कर सकता है।
    नोट: यदि सेल सतह मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग है, तो नीचे अनुभाग 5 पर आगे बढ़ें।
  7. (वैकल्पिक) बाद के विश्लेषण के लिए डीडीएओजी दाग वाली कोशिकाओं का निर्धारण और भंडारण
    1. प्रत्येक धोए गए नमूने में 0.5 एमएल बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड ड्रॉपवाइज जोड़ें। पिपेट को मिक्स करना है।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिकाओं को 2x को 1 एमएल पीबीएस के साथ धोएं।
    4. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण से पहले नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक स्टोर करें।
      नोट: निश्चित नमूने के लिए, चरण 4.8 छोड़ दें।
  8. कैल्सीन वायलेट 450 एएम स्टॉक (1 एमएम) को 1: 1,000 एक्स पर 1% बीएसए-पीबीएस (1 एसएम फाइनल) में पतला करें। चरण 4.6 से धोए गए सेल छर्रों में 300 μL (सुसंस्कृत सेल नमूनों के लिए) या 1,000 μL (ट्यूमर के नमूनों के लिए) जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. प्रवाह साइटोमेट्री सेटअप (अनुभाग 6) के लिए आगे बढ़ें।

5. (वैकल्पिक) डीडीएओजी के साथ संयोजन में सेल सतह मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग

नोट: किसी भी फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग के साथ, केवल डीडीएओजी और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ एकल-दाग वाले नियंत्रण नमूने प्रतिदीप्ति चैनलों में क्रॉसस्टॉक (यदि कोई हो) निर्धारित करने के लिए तैयार किए जाने चाहिए। यदि क्रॉसस्टॉक देखा जाता है, तो मानक प्रवाह साइटोमेट्री मुआवजा20 किया जाना चाहिए।

  1. चरण 4.6 में प्राप्त सेल छर्रों को 100 μL धुंधला बफर (1x PBS में 1% बीएसए) में पुन: निलंबित किया गया।
  2. निर्माता-अनुशंसित अनुमापन पर सेल प्रजातियों (माउस या मानव) के लिए उपयुक्त एफसी रिसेप्टर ब्लॉकिंग अभिकर्मक जोड़ें। 24 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. निर्माता द्वारा अनुशंसित अनुमापन (या उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित) पर फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें। बर्फ पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
  4. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  5. मिश्रण करने के लिए प्रति ट्यूब और पिपेट के 1 एमएल आइस-कोल्ड वॉश बफर (0.5% बीएसए-पीबीएस) से धोएं। ट्यूबों को 1,000 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोने के लिए इस चरण को 2x दोहराएं।
  6. 1% बीएसए-पीबीएस में 1: 1,000 x पर 1 mM Calcein वायलेट 450 AM पतला करें। चरण 5.5 से धुले हुए सेल छर्रों में 300 μL जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (अनुभाग 6-7) के लिए आगे बढ़ें।

6. फ्लो साइटोमीटर सेटअप और डेटा अधिग्रहण

  1. सेल नमूने को फ्लो साइटोमेट्री उपकरण के साथ संगत ट्यूबों में स्थानांतरित करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    नोट: यदि सेल सस्पेंशन में समुच्चय देखे जाते हैं, तो विश्लेषण से पहले निलंबन को 70-100 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से पास करें। 40 μm छन्नी का उपयोग न करें क्योंकि वे कुछ बड़ी सेनेसेंट कोशिकाओं को बाहर कर सकते हैं।
  2. संदर्भित सॉफ्टवेयर में ( सामग्री की तालिका देखें), निम्नलिखित भूखंड खोलें: 1) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए डॉट प्लॉट, 2) वायलेट चैनल हिस्टोग्राम, 3) दूर-लाल चैनल (जैसे, एपीसी-ए) बनाम ग्रीन चैनल (जैसे, एफआईटीसी-ए) डॉट प्लॉट।
    नोट: डबल बहिष्करण भूखंडों और एकल-चैनल हिस्टोग्राम का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन सख्ती से आवश्यक नहीं हैं।
  3. साइटोमीटर डेटा अधिग्रहण शुरू करें।
    1. इंटेक पोर्ट पर डीडीएओजी के साथ सना हुआ वाहन-केवल नियंत्रण नमूना रखें। कम सेवन की गति पर, नमूना डेटा प्राप्त करना शुरू करें।
    2. एफएससी और एसएससी वोल्टेज को समायोजित करें ताकि >90% घटनाएं साजिश के भीतर निहित हों। यदि कोशिकाएं प्लॉट पर अच्छी तरह से फिट नहीं होती हैं, तो क्षेत्र स्केलिंग सेटिंग को 0.33-0.5 इकाइयों तक कम करें।
    3. डेटा रिकॉर्ड किए बिना वाहन-केवल नमूना निकालें।
    4. (वैकल्पिक) 1 एमएल पीबीएस के साथ साइटोमीटर ट्यूब में इंद्रधनुष अंशांकन माइक्रोसेफर्स की एक बूंद जोड़ें। ट्यूब को साइटोमीटर सेवन पोर्ट पर रखें। नमूना डेटा प्राप्त करना शुरू करें।
    5. बैंगनी, हरे और दूर-लाल चैनल वोल्टेज को समायोजित करें ताकि इंद्रधनुष माइक्रोसेफर्स का शीर्ष शिखर प्रत्येक चैनल में सापेक्ष प्रतिदीप्ति की 104-10 5 इकाइयों की सीमा में हो और सभी चोटियां प्रत्येक चैनल में अच्छी तरह से अलग हों। रिकॉर्ड 10,000 घटनाएं। ट्यूब को हटा दें।
  4. सेवन पोर्ट पर डीडीएओजी के साथ सना सकारात्मक नियंत्रण नमूना (जैसे, बीएलएम, ईटीओ) रखें। कम गति पर, नमूना डेटा प्राप्त करें। एफएससी, एसएससी, वायलेट, हरे और दूर-लाल चैनलों में घटनाओं का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि 90% से अधिक घटनाएं सभी भूखंडों के भीतर निहित हैं। एएफ और डीडीएओजी सिग्नल बनाम वाहन-केवल नियंत्रण में वृद्धि की तलाश करें।
  5. सॉर्टिंग साइटोमीटर का उपयोग करते समय, इस चरण में सॉर्टिंग शुरू करें।
    1. रिकॉर्ड रखने के प्रयोजनों के लिए, नियंत्रण नमूने और प्रत्येक क्रमबद्ध नमूने के लिए 10,000 कक्ष रिकॉर्ड करें।
    2. कोशिकाओं की वांछित मात्रा (≥1 × 106 आमतौर पर उपयुक्त है) को 3-5 एमएल संस्कृति माध्यम के साथ एक उपकरण-उपयुक्त संग्रह ट्यूब में क्रमबद्ध करें।
    3. छंटाई के बाद, डाउनस्ट्रीम संस्कृति या विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें।
    4. क्रमबद्ध नमूनों के नियमित विश्लेषण के लिए अनुभाग 7 पर जाएं।
  6. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, अनुभाग 5 में तैयार किए गए बिना दाग वाले, एकल-दाग वाले और डबल-दाग वाले नमूनों का उपयोग करके यहां चैनल वोल्टेज को अनुकूलित करें।
    नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले कैलिब्रेटेड फ्लो साइटोमीटर के लिए, इष्टतम चैनल वोल्टेज आमतौर पर 250 और 600 (मध्य-श्रेणी) के बीच गिर गए, लेकिन इष्टतम वोल्टेज और चैनल वोल्टेज रेंज उपकरणों में भिन्न होंगे। बहुत कम या उच्च रेंज पर वोल्टेज का उपयोग करने से बचें, जो सिग्नल को दबा सकता है या शोर को बढ़ा सकता है।
  7. चरण 6.1-6.5 को पूरा करने और साइटोमीटर सेटिंग्स में समायोजन करने के बाद, सभी नमूनों के लिए डेटा रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स सभी नमूना रिकॉर्डिंग के लिए समान रहें। प्रति सुसंस्कृत सेल नमूने में ≥10,000 घटनाओं या प्रति ट्यूमर सेल नमूने ≥100,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
    नोट: यद्यपि गेटिंग और विश्लेषण डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (जैसे, FACSDiva) का उपयोग करके किया जा सकता है, अलग विश्लेषण सॉफ्टवेयर (FlowJo) का उपयोग करके अधिग्रहण के बाद आयोजित किया जाने वाला एक पूर्ण गेटिंग और विश्लेषण वर्कफ़्लो नीचे अनुभाग 7 में वर्णित है। साइटोमीटर वर्कस्टेशन पर समय को कम करने और समर्पित विश्लेषण सॉफ्टवेयर में शामिल अतिरिक्त उपकरणों का लाभ उठाने के लिए अधिग्रहण के बाद विश्लेषण को प्राथमिकता दी जाती है।
  8. नमूना डेटा .fcs फ़ाइल स्वरूप में सहेजें. फ़ाइलों को फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, फ्लोजो) से लैस वर्कस्टेशन कंप्यूटर पर निर्यात करें। धारा 7 पर आगे बढ़ें।

7. फ्लो साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण

नोट: प्रस्तुत वर्कफ़्लो FlowJo सॉफ़्टवेयर का उपयोग करता है। वैकल्पिक प्रवाह साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है यदि इस खंड में वर्णित प्रमुख चरणों का समान रूप से पालन किया जाता है।

  1. FlowJo सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, चरण 6.7 से .fcs डेटा फ़ाइलें खोलें।
  2. लेआउट विंडो खोलें।
  3. लेआउट विंडो में सभी नमूने खींचें और छोड़ दें।
  4. गेट व्यवहार्य कोशिकाएं।
    1. पहले अपनी डेटा विंडो खोलने के लिए वाहन-केवल नियंत्रण के लिए नमूना डेटा पर डबल-क्लिक करें।
    2. डेटा को वायलेट चैनल हिस्टोग्राम के रूप में विज़ुअलाइज़ करें। मृत कोशिकाओं की तुलना में उनके उज्जवल प्रतिदीप्ति के आधार पर सीवी 450 द्वारा दागदार व्यवहार्य कोशिकाओं की पहचान करें।
    3. केवल व्यवहार्य कोशिकाओं को शामिल करने के लिए एकल-गेट हिस्टोग्राम उपकरण का उपयोग करके एक गेट खींचें। गेट को व्यवहार्य नाम दें।
    4. फिर, नमूना लेआउट विंडो से, गेट को समान रूप से लागू करने के लिए अन्य सेल नमूनों पर व्यवहार्य गेट खींचें।
    5. लेआउट विंडो में, सभी नमूनों को वायलेट चैनल (व्यवहार्यता) हिस्टोग्राम के रूप में विज़ुअलाइज़ करें। सत्यापित करें कि आगे बढ़ने से पहले नमूनों में व्यवहार्य सेल गेटिंग उपयुक्त है; यदि नहीं, तो आवश्यकतानुसार समायोजन करें।
      नोट: व्यवहार्यता धुंधला पन उपचार या ट्यूमर में भिन्नता प्रदर्शित कर सकता है।
  5. गेट सेनेसेंट कोशिकाएं।
    1. अपनी डेटा विंडो खोलने के लिए वाहन-केवल नियंत्रण के लिए गेटेड व्यवहार्य सेल डेटा पर डबल-क्लिक करें।
    2. डेटा को दूर-लाल चैनल (डीडीएओजी) बनाम ग्रीन चैनल (एएफ) के लिए डॉट प्लॉट के रूप में विज़ुअलाइज़ करें।
    3. <5% कोशिकाओं को शामिल करने के लिए आयत गेटिंग टूल का उपयोग करके एक गेट खींचें जो डीडीएओजी + और एएफ + (ऊपरी दाएं चतुर्थांश) हैं। गेट का नाम बताइए।
    4. फिर, नमूना लेआउट विंडो से, गेट को समान रूप से लागू करने के लिए अन्य सेल नमूनों के व्यवहार्य उपसमुच्चय पर सेनेसेंट गेट खींचें।
    5. लेआउट विंडो में, अनुभाग 7.4 में गेट किए गए सभी व्यवहार्य सेल उपसमुच्चय को खींचें और छोड़ दें। सभी व्यवहार्य नमूनों को दूर-लाल (जैसे, एपीसी-ए) बनाम हरे चैनल (जैसे, एफआईटीसी-ए) डॉट प्लॉट के रूप में कल्पना करें।
    6. सुनिश्चित करें कि चरण 7.5.3 में खींचा गया संवेदी गेट सभी भूखंडों पर दिखाई दे रहा है और वाहन-केवल नियंत्रण के लिए गेट ≤5% -10% सेनेसेंट कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है।
  6. एक बार जब ऊपर दिए गए चरणों का उपयोग करके सेनेसेंट कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित किया जाता है, तो फ्लोजो प्लॉट्स का उपयोग करके परिणामी डेटा प्रस्तुत करें, जिसे डेटा तालिका में संक्षेप ति किया गया है और / या मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया गया है।

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Representative Results

एसए-β-गैल द्वारा सेनेसेंस का पता लगाने के लिए डीडीएओजी की एक्स-गैल और सी12-एफडीजी की तुलना प्रदर्शित करने के लिए कई प्रयोग किए गए थे। सबसे पहले, एक्स-गैल का उपयोग ईटीओ (चित्रा 2 ए) द्वारा प्रेरित सेनेसेंट बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं को दागने के लिए किया गया था। ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं के एक उप-समूह में एक तीव्र नीला रंग विकसित हुआ, जबकि अन्य कोशिकाओं ने कम तीव्र नीले धब्बे का प्रदर्शन किया। अधिकांश ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं में आकृति विज्ञान बढ़ा हुआ था। फ्लोरोसेंट एसए-β-गैल सब्सट्रेट सी12-एफडीजी (हरा) या डीडीएओजी (दूर-लाल) के साथ धुंधला ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं ने एक्स-गैल (चित्रा 2 बी) के लिए तुलनीय धुंधला पैटर्न और तीव्रता भिन्नताओं का प्रदर्शन किया। हालांकि, ग्रीन सी12-एफडीजी उत्सर्जन सेलुलर एएफ (चित्रा 2 सी) के साथ अतिव्यापी है, जिसे सेनेसेंट कोशिकाओं17 में जमा करने के लिए जाना जाता है। इसके विपरीत, डीडीएओजी के दूर-लाल उत्सर्जन रेंज में एएफ नगण्य था।

सेनेसेंट कोशिकाओं को स्कोर करने और गिनने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के बजाय, कम समय में प्रति नमूना हजारों कोशिकाओं के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए प्रवाह साइटोमीटर की उच्च-थ्रूपुट क्षमताओं का लाभ उठाना अधिक समीचीन था (<5 मिनट प्रति नमूना)। सबसे पहले, इष्टतम डेटा अधिग्रहण (चित्रा 3) सुनिश्चित करने के लिए मानक प्रवाह साइटोमेट्री सेटअप मापदंडों की एक श्रृंखला लागू की गई थी। एक विशिष्ट दृष्टिकोण के बाद, प्रकाश स्कैटर पैरामीटर कोशिकाओं की मात्रा (फॉरवर्ड स्कैटर, एफएससी) और ग्रैन्यूलैरिटी (साइड स्कैटर, एसएससी) की कल्पना करने के लिए सेट किए गए थे (चित्रा 3 ए)। यहां, हमने ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं की बढ़ी हुई मात्रा की प्रवृत्ति का उल्लेख किया, जो आमतौर पर माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेनेसेंट कोशिकाओं के लिए देखे गए बढ़े हुए आकृति विज्ञान से सहमत थे। प्लॉट पर बड़ी कोशिकाओं की अधिक कल्पना करने के लिए डिफ़ॉल्ट क्षेत्र स्केलिंग सेटिंग्स (सेल प्रकार और उपचार के आधार पर 0.33-0.50 इकाइयों तक) में कमी आवश्यक थी। कुछ सेल लाइनों / उपचारों के लिए, बढ़ी हुई ग्रैन्यूलैरिटी (एसएससी) भी स्पष्ट थी (डेटा नहीं दिखाया गया)। कुल मिलाकर, स्कैटर मूल्यांकन का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण चरण के रूप में किया गया था कि सेल स्कैटर डेटा अपेक्षित रूप से दिखाई दिया, अत्यधिक सेल मलबे मौजूद नहीं थे, और कोशिकाओं को उचित प्रवाह दर (~ 100-1000 कोशिकाओं / एस) पर साइटोमीटर के माध्यम से संसाधित किया जा रहा था। केवल उपकरण सेटअप के लिए उपयोग किए जाने वाले गुणवत्ता नियंत्रण चरण के रूप में, यहां कोई गेटिंग या विश्लेषण नहीं किया गया था।

फ्लो साइटोमेट्री सेटअप में एक दूसरा (वैकल्पिक) कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "इंद्रधनुष" अंशांकन कणों के एक नमूने का संक्षेप में विश्लेषण करना था ताकि फ्लोरोसेंट डिटेक्शन वोल्टेज स्वीकार्य सीमाओं (चित्रा 3 बी) में सेट किया जा सके। सबसे चमकीली चोटी को प्रत्येक चैनल में सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता की 1 × 104 इकाइयों और 1 × 105 इकाइयों के बीच सेट किया गया था, जिसमें स्पष्ट रूप से परिभाषित कम तीव्रता वाली चोटियां, प्रत्येक चोटी के बीच पर्याप्त पृथक्करण और पड़ोसी चोटियों का कोई ओवरलैप नहीं था। इन वोल्टेज सेटिंग्स का उपयोग करके 10,000 माइक्रोसेफर्स का एक नियंत्रण नमूना दर्ज किया गया था। प्रोटोकॉल के दौरान डेटा अधिग्रहण की एकरूपता में सुधार के लिए प्रत्येक साइटोमेट्री सत्र में माइक्रोसेफर्स का उपयोग इस तरह से किया गया था।

इसके बाद, वाहन-केवल या ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं के नमूने प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल में देखे गए थे, और गेट सेट किए गए थे। वायलेट चैनल (चित्रा 3 सी) में सीवी 450 व्यवहार्यता दाग के संकेत के आधार पर सेल व्यवहार्यता द्वार सेट किए गए थे। वाहन-केवल उपचारित कोशिकाओं ने 88% व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, और ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं ने 75% व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया (अंतिम सेल नमूने में; अतिरिक्त मृत कोशिकाओं को शुरू में छोड़ दिए गए संस्कृति मीडिया में हटा दिया गया था और धुंधला होने की प्रक्रिया के दौरान यांत्रिक रूप से विघटित हो गया था)। इसके बाद, व्यवहार्य गेटेड कोशिकाओं को हरे (चित्रा 3 डी) और दूर-लाल (चित्रा 3 ई) उत्सर्जन चैनलों में देखा गया था। हरे एएफएचआई और दूर-लाल डीडीएओजीएचआई के लिए गेट वाहन-केवल कोशिकाओं के <5% पर सेट किए गए थे, और इन गेटों को तब ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं पर लागू किया गया था। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, यह निर्धारित किया गया था कि ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं में से 46% एएफएचआई थे और 33% डीडीएओजीएचआई थे; ये मूल्य साहित्य के आधार पर अपेक्षित सीमा में थे और हमारी प्रयोगशाला में कई प्रतिकृति प्रयोगों के परिणामों से थे। एक बार साइटोमीटर सेटअप पूरा हो जाने के बाद, प्रयोग में सभी सेल नमूने समान डेटा अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके चलाए गए थे। प्रति नमूना 10,000 घटनाओं के लिए डेटा प्राप्त किया गया था।

प्रतिनिधि परख डेटा चित्रा 4 में दिखाया गया है। बी 16-एफ 10 मुराइन मेलेनोमा कोशिकाओं या ए 54 9 मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग कैंसर सेल लाइन मॉडल के रूप में किया गया था। प्रत्येक सेल लाइन को एक कीमोथेरेपी एजेंट के साथ इलाज किया गया था जो 4 दिनों के लिए सेनेसेंस (ईटीओ या बीएलएम) को प्रेरित करने के लिए जाना जाता था ताकि सेनेसेंस या वाहन-केवल प्रेरित किया जा सके। इसके अलावा, ज्ञात सेनोलिटिक एजेंट एबीटी -26321 को डीडीएओजी जांच की विशिष्टता का प्रदर्शन करने के लिए 2 दिनों के लिए प्रेरित सेनेसेंट कोशिकाओं में जोड़ा गया था। एबीटी -263 केवल अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में नमूने तैयार किए गए थे। यहां, डेटा को डीडीएओजी (670 एनएम उत्सर्जन) बनाम एएफ (525 एनएम) के साथ 2 डी डॉट प्लॉट के रूप में देखा जाता है। चित्रा 3 से वर्कफ़्लो का उपयोग साइटोमीटर सेटअप के लिए किया गया था, और एक टीआईएस गेट इस तरह सेट किया गया था कि <5% वाहन-केवल कोशिकाओं को टीआईएस के रूप में स्कोर किया गया था। बी 16-एफ 10 कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) का उपयोग करने वाले परिणामों से पता चला है कि ईटीओ ने व्यवहार्य बी 16-एफ 10 कोशिकाओं के 35% में टीआईएस को प्रेरित किया ( चित्रा 2 डी, ई में दिखाए गए तुलनीय डेटा के समान) और सेनोलिटिक एजेंट ने टीआईएस कोशिकाओं (<2%) को लगभग पूरी तरह से समाप्त कर दिया। ए 549 कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) में, बीएलएम ने 66% व्यवहार्य कोशिकाओं में टीआईएस को प्रेरित किया, और एबीटी -263 ने प्रतिशत को 15% तक कम कर दिया। अकेले एबीटी -263 अनुपचारित, प्रसार कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं था।

हमने आगे यह प्रदर्शित करने का लक्ष्य रखा कि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी सह-धुंधला टीआईएस से जुड़े या नए सतह मार्करों की स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए डीडीएओजी सेनेसेंस परख के साथ संगत था। यहां, बी 16-एफ 10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं को फिर से 4 दिनों के लिए टीआईएस-उत्प्रेरण ईटीओ (या वाहन) के साथ इलाज किया गया था। फिर, टीआईएस का मूल्यांकन करने के लिए और टीआईएस से जुड़े सतह मार्कर डीपीपी 422 (चित्रा 5) का पता लगाने के लिए एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को डीडीएओजी के साथ दाग दिया गया था। आर-फाइकोएरिथ्रिन (पीई) के संयुग्मित एंटी-डीपीपी 4 का उपयोग किया गया था, और हमने उपयोग किए गए प्रवाह साइटोमीटर (पूरक चित्रा एस 2) पर डीडीएओजी और एएफ के साथ पीई के नगण्य ओवरलैप की पुष्टि की। >5,000 व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए पीई चैनल डेटा (चित्रा 5 ए) के हिस्टोग्राम से पता चला है कि ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं का 42% डीपीपी 4 + (सकारात्मकता गेट सेट करने के लिए वाहन-केवल नमूने का उपयोग करके) था। एक ही नमूने के लिए 2 डी डॉट प्लॉट (चित्रा 5 बी, सी) की कल्पना करने से संकेत मिलता है कि ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं का 44% डीडीएओजी (यानी, सेनेसेंट) और डीपीपी 4 बनाम 4% वाहन-केवल कोशिकाओं के लिए डबल-पॉजिटिव था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि सतह मार्कर एंटीबॉडी के साथ लाइव-सेल धुंधला होना डीडीएओजी सेनेसेंस परख के साथ संयोजन में संभव है।

किसी भी लाइव सेल स्टेनिंग विधि के साथ संभावित चिंताओं में लंबे विश्लेषण सत्रों (>1 घंटे) के दौरान होने वाली कोशिका मृत्यु शामिल है और कई अलग-अलग समय बिंदुओं (दिनों तक) में नमूनों को सबसे कुशलता से दाग और विश्लेषण कैसे किया जाए। दाग वाली कोशिकाओं का विलायक-आधारित निर्धारण इन दोनों चिंताओं को संबोधित करता है, क्योंकि नमूने दाग लगते ही ठीक किए जा सकते हैं और फिर एक तापमान-स्थिर बैच में विश्लेषण तक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किए जा सकते हैं। इस प्रकार, हमने परीक्षण किया कि क्या डीडीएओजी से सना जीवित कोशिकाओं को 100% मेथनॉल या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। अवांछित रूप से, मेथनॉल निर्धारण ने डीडीएओजी सिग्नल को कम कर दिया और एएफ को काफी कम कर दिया (डेटा नहीं दिखाया गया); इसलिए, निर्धारण विलायक के रूप में मेथनॉल के उपयोग से बचा जाना चाहिए। हालांकि, पीएफए के साथ निर्धारण बहुत अधिक सफल था, जैसा कि डीडीएओजी के साथ धुंधला होने के बाद 10 मिनट के लिए 4% पीएफए में तय कोशिकाओं के लिए चित्रा 6 में देखा गया है। अनिर्धारित नियंत्रण नमूनों (चित्रा 6 ए; अनुपचारित, 5% और बीएलएम, 67% डीडीएओजीएचआई एएफएचआई) की तुलना में, निश्चित नमूने (चित्रा 6 बी) ने अनुपचारित कोशिकाओं (9%) में थोड़ी अधिक पृष्ठभूमि प्रदर्शित की और बीएलएम-उपचारित कोशिकाओं (80%) में सेनेसेंट के रूप में स्कोर करने वाली कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत भी प्रदर्शित किया। यह प्रभाव रात भर संग्रहीत निश्चित नमूनों में भी देखा गया था (चित्रा 6 सी; अनुपचारित, 12% और बीएलएम, 72%) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया गया था (चित्रा 6 डी; 14% और 70%)। पीएफए निर्धारण के कारण प्रतिदीप्ति में मामूली वृद्धि के बावजूद, बीएलएम द्वारा शिथिलता का प्रेरण अभी भी सभी निश्चित नमूनों बनाम मिलान अनुपचारित नमूने में स्पष्ट था। इसके अलावा, कोशिकाएं 7 वें दिन तक केवल मामूली गिरावट के साथ भंडारण में बरकरार रहीं, और कोई समस्याग्रस्त एकत्रीकरण नहीं देखा गया। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि बाद में बैच किए गए विश्लेषण के लिए सेल नमूनों को ठीक करने और संग्रहीत करने में सक्षम होने की सुविधा पीएफए निर्धारण के कारण थोड़ी अधिक पृष्ठभूमि को सहन करने का औचित्य साबित करेगी, खासकर कई नमूनों या समय बिंदुओं के साथ प्रयोगों में।

सेल-आधारित सेनेसेंस अनुसंधान में एक आम चुनौती सेल आबादी में सेनेसेंस की विषम शुरुआत है। यहां, हम दिखाते हैं कि डीडीएओजी का उपयोग व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं के एफएसीएस के लिए किया जा सकता है और एकत्रित कोशिकाएं डाउनस्ट्रीम इन विट्रो परख (चित्रा 7) के लिए संस्कृति में जीवित रहती हैं। एफएसीएस द्वारा कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने के लिए, कोशिकाओं का इलाज किया जाता है और दाग दिया जाता है, जैसा कि वर्णित है, और यहां दिखाए गए डीडीएओजी बनाम एएफ गेटिंग रणनीति का उपयोग करके एफएसीएस-सक्षम प्रवाह साइटोमीटर द्वारा क्रमबद्ध किया जाता है (चित्रा 7 ए)। चूंकि दीर्घकालिक विषाक्तता चिंताओं के कारण यहां व्यवहार्यता जांच का उपयोग नहीं किया जाता है, इसलिए हम एकत्रित कोशिकाओं से झूठे-सकारात्मक मलबे को खत्म करने के लिए अंतिम सेनेसेंट सेल गेटिंग (पूरक चित्रा एस 3) से पहले कड़े स्कैटर गेटिंग करने की सलाह देते हैं। ये मानक एफएसीएस गेटिंग प्रक्रियाएं हैं जो मामूली अनुभवी उपयोगकर्ता से परिचित होनी चाहिए और उपकरण (<10 मिनट) पर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तेजी से स्थापित की जा सकती हैं।

बीएलएम-उपचारित ए 549 कोशिकाओं के एक नमूने को छांटने के बाद, हमने कोशिकाओं को 10 ×10 3 कोशिकाओं / सेमी2 पर 5 दिनों (एन = 6 प्रतिकृति) के लिए मानक मल्टीवेल व्यंजनों में संस्कृति में वापस कर दिया। मिश्रित नियंत्रणों को एक ही घनत्व पर चढ़ाया गया था, साथ में उगाया गया था, और अनुपचारित और बीएलएम-उपचारित कोशिकाओं को शामिल किया गया था। कोशिकाओं को दैनिक रूप से देखा गया; क्रमबद्ध कोशिकाओं के लिए, कोई महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु या प्रसार में वापसी नहीं देखी गई थी। संस्कृति में 5 दिनों के दौरान क्रमबद्ध कोशिकाएं विरल (यानी, प्रसार नहीं) बनी रहीं, जबकि अनुपचारित और बीएलएम-उपचारित कोशिकाएं दिखाए गए अनुसार कंफ्लुएंट हो गईं। दिन 5 पर, कोशिकाओं को पीएफए में तय किया गया था और आकृति विज्ञान और प्रसार मार्करों (चित्रा 7 बी) के लिए दाग दिया गया था। क्रमबद्ध कोशिकाओं की विशिष्ट बढ़ी हुई आकृति विज्ञान को फिलामेंटस एक्टिन के फ्लोरोसेंट फेलोइडिन धुंधला होने से पता चला था, जिसमें बढ़े हुए नाभिक को दिखाने के लिए डीएपीआई धुंधला था। क्रमबद्ध कोशिकाएं व्यास में बहुत बड़ी थीं (>10 μm) एक विशिष्ट गोल उपस्थिति के साथ। जैसा कि अपेक्षित था, Ki67 एंटीबॉडी धुंधला होने से क्रमबद्ध नमूने में प्रसार मार्कर का पूर्ण नुकसान हुआ बनाम मिश्रित बीएलएम-उपचारित नमूने में आंशिक नुकसान हुआ, और अनुपचारित-मिश्रित नमूने में कई कोशिकाओं में Ki67 के सामान्य स्तर देखे गए। नमूनों में समान इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से कम से कम तीन चित्र लिए गए थे। प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं (चित्रा 7 बी)।

अंत में, हमने मूल्यांकन किया कि क्या कीमोथेरेपी दवाओं के साथ इलाज किए गए चूहों में स्थापित ट्यूमर में उत्पन्न होने वाली सेनेसेंट कोशिकाओं को डीडीएओजी का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। बी 16-एफ 10 मेलेनोमा ट्यूमर को सी 57 / बीएल 6 चूहों के फ्लैंक में प्रेरित किया गया था, जिन्हें तब केवल खारा (चित्रा 8 ए), डीओएक्स (चित्रा 8 बी), या पीएलडी (चित्रा 8 सी) के साथ तीन बार (यानी, हर 5 दिनों में) इलाज किया गया था। तीसरे उपचार के बाद, चूहों को सेनेसेंस की शुरुआत की अनुमति देने के लिए 7 दिनों के लिए ठीक किया गया और फिर बलिदान किया गया और ट्यूमर का उत्पादन किया गया। ट्यूमर को आधा कर दिया गया था, जिसमें आधे का उपयोग एक्स-गैल स्टेनिंग (चित्रा 8) के लिए जमे हुए ऊतक स्लाइड तैयार करने के लिए किया गया था और आधे को एकल-सेल निलंबन में अलग किया गया था और डीडीएओजी (चित्रा 8 और पूरक चित्रा एस 4) के साथ दाग दिया गया था। लंबी धुंधला अवधि (72 घंटे) के बावजूद ऊतकों में एक्स-गैल धुंधलापन कमजोर था, लेकिन करीबी निरीक्षण पर डीओएक्स और पीएलडी ट्यूमर में नीला धुंधलापन स्पष्ट था, विशेष रूप से ट्यूमर में जो डीडीएओजी प्रवाह परख (चित्रा 8 बी, सी) द्वारा शिथिलता के लिए सकारात्मक स्कोर करते थे। प्रति ऊतक स्लाइड कम से कम तीन छवियां ली गईं और प्रतिनिधि छवियां दिखाई गईं।

एक्स-गैल की तुलना में, डीडीएओजी ट्यूमर में शिथिलता को मापने का एक अधिक संवेदनशील और सटीक तरीका था (चित्रा 8)। डीडीएओजी ट्यूमर विश्लेषण के लिए, उच्चतम प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि वाले खारा-उपचारित ट्यूमर का उपयोग <5% पर सेनेसेंस गेट सेट करने के लिए किया गया था, जैसे कि अन्य खारा-उपचारित ट्यूमर 5% से अधिक सेनेसेंस स्कोर नहीं करते थे। इस सेनेसेंस गेट को तब सभी ट्यूमर से गेटेड व्यवहार्य कोशिकाओं पर बैच-लागू किया गया था। दोनों कीमोथेरेपी एजेंटों ने कुछ ट्यूमर (डीओएक्स के लिए पांच ट्यूमर में से दो, पीएलडी के लिए पांच में से तीन) में सेनेसेंस को प्रेरित किया, जिसमें सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिशत प्रति ट्यूमर 3% से 36% तक भिन्न होता है। सभी 15 ट्यूमर के लिए साइटोमेट्री डेटा प्लॉट पूरक चित्रा एस 4 में दिखाए गए हैं, और ट्यूमर साइटोमेट्री डेटा का सारांश चित्रा 8 डी (एन = 5) में दिखाया गया है। (*) पी < 0.05 बनाम खारा-केवल नियंत्रण समूह विचरण के एफ परीक्षण द्वारा)। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि डीडीएओजी बनाम एएफ फ्लो साइटोमेट्री विवो में सेनेसेंस के प्रेरण के लिए ट्यूमर और कीमोथेरेपी एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए एक स्वीकार्य तरीका है।

Figure 2
(ए) एसए-β β-गैल के लिए पारंपरिक धुंधलापन एक्स-गैल का उपयोग करके अनुपचारित (बाएं) या ईटीओ-उपचारित (दाएं) बी 16-एफ 10 मुराइन मेलेनोमा कोशिकाओं को दर्शाता है। ईटीओ द्वारा प्रेरित शिथिलता: कोशिकाएं बढ़े हुए आकारिकी और नीले धब्बे का प्रदर्शन करती हैं जो उच्च एसए-β-गैल द्वारा एक्स-गैल की दरार के कारण होती हैं। स्केल बार = 10 μm. (B) या तो C12-FDG (515 nm उत्सर्जन, हरा) या DDAOG (660 nm, लाल) का उपयोग करके ETO-उपचारित कोशिकाओं में SA-β-Gal के लिए फ्लोरोसेंट धुंधलापन। धुंधला वितरण दोनों जांचों के लिए समान है, यह दर्शाता है कि डीडीएओजी सी12-एफडीजी के समान तरीके से एसए-β-गैल का पता लगाता है। (सी) हरे (525 एनएम उत्सर्जन, बाएं) या दूर-लाल (660 एनएम, दाएं) उत्सर्जन चैनल में बिना दाग वाले, ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं में एएफ का मूल्यांकन। लिपोफससिन से एएफ हरे उत्सर्जन चैनल में उच्च है और दूर-लाल चैनल में नगण्य है। एक्सपोजर समय = प्रत्येक छवि के लिए 2,000 एमएस। स्केल सलाखों = 10 μm. यह आंकड़ा फ्लोर और क्रोन23 से पुनर्मुद्रित है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; एक्स-गैल = 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड; यूएनटी = अनुपचारित; ईटीओ = एटोपोसाइड; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस; सी12-एफडीजी = 5-डोडेकैनोइलामिनोफ्लोरेसिन डी-β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड; एसए-β-गैल = सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: फ्लो साइटोमीटर डेटा अधिग्रहण सेटअप. (A) कोशिकाओं का प्रतिनिधि स्कैटर प्लॉट वितरण. एफएससी-ए सेल वॉल्यूम का रीडआउट है, और एसएससी-ए सेलुलर ग्रैन्यूलैरिटी को इंगित करता है। बाएं पैनल, ए 549 कोशिकाओं का वाहन-केवल उपचार। सेनेसेंस को प्रेरित करने के लिए राइट पैनल, ईटीओ उपचार। माइक्रोस्कोपी से स्पष्ट बढ़ी हुई आकृति विज्ञान के साथ सहमति में, ईटीओ-उपचारित कोशिकाओं की बढ़ी हुई सेल मात्रा की ओर प्रवृत्ति पर ध्यान दें। (बी) साइटोमीटर के डिटेक्टर वोल्टेज सेट करने के लिए 5-पीक वाणिज्यिक "इंद्रधनुष" फ्लोरोसेंट अंशांकन माइक्रोसेफर्स का वैकल्पिक उपयोग। उपयोग किए गए प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में, नमूने चलने के दौरान साइटोमीटर डिटेक्टर वोल्टेज को समायोजित करके अधिकतम शिखरको ≤1 x 10 5 सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों में सेट किया जाना चाहिए। बाएं पैनल, बीवी 421 (बैंगनी) चैनल; केंद्र, एफआईटीसी (ग्रीन) चैनल; दाएं, एपीसी (लाल) चैनल। पांच फ्लोरोसेंट चोटियों को दिखाए गए अनुसार अलग-अलग रिक्ति प्रदर्शित करनी चाहिए। (C-E) वायलेट सीवी 450 डाई का उपयोग करके (सी) व्यवहार्यता धुंधला करने के लिए प्रतिनिधि एकल-चैनल प्रतिदीप्ति डेटा; (डी) कोशिकाओं का हरा ऑटोफ्लोरेसेंस; (ङ) एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए डीडीएओजी से दूर-लाल संकेत। गहरे रंग हिस्टोग्राम, वाहन-केवल उपचार; हल्का रंग हिस्टोग्राम, ईटीओ उपचार। प्रत्येक भूखंड के ऊपर मूल द्वार इंगित किए गए हैं। संक्षिप्तरूप: एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; ईटीओ = एटोपोसाइड; बीवी 421-ए = ब्रिलियंट वायलेट 421 चैनल पीक एरिया; एफआईटीसी-ए = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट चैनल पीक क्षेत्र; एपीसी-ए = एलोफिकोसायनिन चैनल पीक क्षेत्र; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस; डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; वीईएच = वाहन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: फ्लो साइटोमेट्री सेनेसेंस परख के लिए प्रतिनिधि डेटा। (ए) बी 16-एफ 10 मुराइन मेलेनोमा कोशिकाओं को केवल (ऊपरी बाएं) वाहन, (ऊपरी दाएं) ईटीओ, (निचले बाएं) एबीटी -263 (1 μM) या (निचले दाएं) ईटीओ प्लस एबीटी -263 के साथ इलाज किया जाता है। (बी) ए 549 मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं को केवल (ऊपरी बाएं) वाहन, (ऊपरी दाएं) बीएलएम, (निचले बाएं) एबीटी -263, या (निचले दाएं) बीएलएम प्लस एबीटी -263 के साथ इलाज किया जाता है। (ए, बी) सभी भूखंडों के ऊपरी दाएं चतुर्थांश में आयताकार द्वार सेनेसेंट कोशिकाओं (डीडीएओजीएचआई एएफएचआई) को परिभाषित करते हैं। प्रत्येक भूखंड पर सेनेसेंट कोशिकाओं (प्रति नमूने कुल व्यवहार्य कोशिकाओं का) का प्रतिशत इंगित किया जाता है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; ईटीओ = एटोपोसाइड; बीएलएम = ब्लीमाइसिन; वीईएच = वाहन; टीआईएस = चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सेनेसेंस परख के साथ एक उदाहरण सेल सतह मार्कर का सह-धुंधलापन। (ए) व्यवहार्य बी 16-एफ 10 सुसंस्कृत कोशिकाओं की सतह पर सेनेसेंस मार्कर डीपीपी 4 का इम्यूनोडिटेक्शन; गहरे नारंगी, केवल वाहन; हल्का नारंगी, ईटीओ। (बी, सी) केंद्र और दाएं पैनल: डीडीएओजी और एंटी-डीपीपी 4: पीई के साथ सह-दाग वाली कोशिकाएं। डीडीएओजीएचआई डीपीपी 4एचआई कोशिकाएं भूखंडों पर दिखाए गए आयताकार द्वारों के भीतर निहित हैं, और प्रति नमूना डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत इंगित किया गया है। दिखाया गया: व्यवहार्य-गेटेड कोशिकाएं। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; ईटीओ = एटोपोसाइड; वीईएच = वाहन; डीपीपी 4 = डिपेप्टिडिल पेप्टिडेस 4. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: बाद के विश्लेषण के लिए डीडीएओजी-दाग वाले सेल नमूनों का पोस्टस्टेनिंग निर्धारण और भंडारण। (ए) नियंत्रण, जीवित ए 549 कोशिकाओं के अनिर्धारित नमूने या तो अनुपचारित (बाएं) या बीएलएम (दाएं) के साथ इलाज किया जाता है ताकि शिथिलता को प्रेरित किया जा सके, और फिर डीडीएओजी प्रोटोकॉल (निर्धारण के बिना, दिन 0) का उपयोग करके दाग और तुरंत विश्लेषण किया जाता है। (बी) नमूने (ए) के रूप में तैयार किए गए और फिर तुरंत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किए गए और विश्लेषण किया गया (दिन 0)। (सी) नमूने (ए) के रूप में तैयार किए गए, तुरंत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किए गए, और विश्लेषण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहीत किए गए। (डी) नमूने (ए) के रूप में तैयार किए गए, तुरंत ठीक किए गए, और विश्लेषण से पहले 7 दिनों के लिए संग्रहीत किए गए। सभी भूखंडों के ऊपरी दाएं चतुर्थांश में आयताकार द्वार सेनेसेंट कोशिकाओं (डीडीएओजीएचआई एएफएचआई) को परिभाषित करते हैं। प्रत्येक भूखंड पर सेनेसेंट कोशिकाओं का प्रतिशत इंगित किया जाता है। संक्षेप: टीआईएस = चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंस; डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; बीएलएम = ब्लीमाइसिन; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग और समृद्ध सेनेसेंट सेल आबादी का सत्यापन। (ए) फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग डेटा दिखाता है (बाएं) अनुपचारित, डीडीएओजी-दाग वाले नियंत्रण का उपयोग सेनेसेंट सेल सॉर्टिंग (< गेटेड क्षेत्र में 5% सेनेसेंट कोशिकाओं) और (दाएं) बीएलएम-उपचारित, डीडीएओजी-दाग वाले नमूने के लिए गेट सेट करने के लिए किया जाता है, जैसा कि दिखाया गया है। (बी) एफ-एक्टिन और डीएपीआई (नीले) का पता लगाने के लिए फेलोइडिन-एलेक्सा फ्लोर 647 (नारंगी स्यूडोकलर) से सनी (बाएं कॉलम) कोशिकाओं के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां, सेनेसेंट कोशिकाओं की बढ़ी हुई आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती हैं, या (दाएं कॉलम) सेनेसेंट कोशिकाओं में प्रसार के नुकसान का पता लगाने के लिए खरगोश कि 67 एंटीबॉडी और एंटी-खरगोश एलेक्सा फ्लोर 594 से दागदार कोशिकाएं। शीर्ष पंक्ति, अनुपचारित और मिश्रित कोशिकाएं। केंद्र पंक्ति, बीएलएम-उपचारित और मिश्रित कोशिकाएं। निचली पंक्ति, बीएलएम-उपचारित और क्रमबद्ध कोशिकाएं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: टीआईएस = चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंस; डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; बीएलएम = ब्लीमाइसिन; यूएनटी = अनुपचारित; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: कीमोथेरेपी दवाओं के साथ इलाज किए गए चूहों से ट्यूमर में सेनेसेंस का परिमाणीकरण। बी 16-एफ 10 मेलेनोमा ट्यूमर सी 67बीएल / 6 चूहों के फ्लैंक में स्थापित किए गए थे, जिन्हें तब (ए) खारा, (बी) डीओएक्स, या (सी) पीएलडी की तीन खुराक के साथ हर 5 दिन और 1 सप्ताह में इलाज किया गया था ताकि शिथिलता की शुरुआत की अनुमति मिल सके। ट्यूमर को आधा कर दिया गया था; जमे हुए ऊतक स्लाइड एक्स-गैल स्टेनिंग (शीर्ष पंक्ति) के लिए एक आधे से तैयार किए गए थे, और दूसरे आधे को डीडीएओजी धुंधला (निचली पंक्ति) के लिए अलग किया गया था। एक्स-गैल-दाग वाली छवियों में, नीली कोशिकाएं एसए-β-गैल एचआई सेनेसेंट कोशिकाएं हैं, जबकि भूरे रंग के क्षेत्र ट्यूमर में मेलेनिन के कारण होते हैं। प्रतिनिधि परिणाम प्रति समूह दो ट्यूमर से डीओएक्स और पीएलडी के लिए दिखाए जाते हैं जो शिथिलता का प्रदर्शन करते हैं। सभी खारा-केवल ट्यूमर ने नगण्य सेनेसेंस का प्रदर्शन किया। (डी) चूहों से दवा-उपचारित ट्यूमर में शिथिलता का परिमाणीकरण। (*) पी < 0.05 विचरण के एफ परीक्षण द्वारा, एन = 5 चूहे प्रति समूह। ± संक्षेप: डीडीएओ = 9एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; डॉक्स = डॉक्सोर्यूबिसिन; पीएलडी = पीईजीलेटेड लिपोसोमल डॉक्सोर्यूबिसिन; एक्स-गैल = 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: डीडीएओजी जांच की रासायनिक संरचना। डीडीएओजी 7-हाइड्रॉक्सी-9एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलएक्रिडिन-2-वन) और बीटा गैलेक्टोसाइड का संयुग्म है। जब बीटा-गैलेक्टोसिडेस द्वारा छोड़ दिया जाता है, तो हाइड्रोलाइज्ड क्लीवेज उत्पाद 50 एनएम दूर-लाल फ्लोरेसेंस इम्सियन शिफ्ट प्रदर्शित करता है, जिससे 600 एनएम से ऊपर उत्तेजना के साथ इसकी विशिष्ट पहचान हो सकती है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: प्रवाह साइटोमीटर के अन्य फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ डीडीएओजी क्रॉसस्टॉक का वर्णक्रमीय स्कैन। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपलब्ध चैनलों की पहचान करने के लिए, बीएलएम के साथ इलाज किए गए ए 549 कोशिकाओं का उपयोग करके 4-लेजर, 15-चैनल फ्लो साइटोमीटर पर एक वर्णक्रमीय स्कैन किया गया था और डीडीएओजी (लाल) या बिना दाग वाले (काले) के साथ दाग दिया गया था। प्रवाह साइटोमीटर के हर चैनल में डेटा 10,000 कोशिकाओं के लिए प्राप्त किया गया था। (ए) 405 एनएम लेजर के उत्सर्जन चैनल: बाएं से दाएं, बीवी 421, बीवी 510, बीवी 605, बीवी 660, और बीवी 711। बीवी 605, बीवी 660 और बीवी 711 चैनलों में देखा गया क्रॉसस्टॉक उन्हें मुआवजे के बिना डीडीएओजी के साथ सह-धुंधला करने के लिए अनुपयुक्त बनाता है। बीवी 421 और बीवी 510 सह-धुंधलापन के लिए उपयुक्त हैं (ध्यान दें कि बीवी 421 आमतौर पर व्यवहार्यता धुंधला करने के लिए उपयोग किया जाता है)। (बी) 488 एनएम लेजर के उत्सर्जन चैनल: एफआईटीसी और पेरसीपी-साइ 5। PerCP-Cy5 चैनल के लिए उच्च क्रॉसस्टॉक देखा गया था। एफआईटीसी सह-धुंधला होने के लिए उपयुक्त है; हालांकि, ध्यान दें कि एफआईटीसी चैनल का उपयोग आमतौर पर हरे उत्सर्जन एएफ के मूल्यांकन के लिए डीडीएओजी परख में किया जाता है। (सी) 561 एनएम लेजर के उत्सर्जन चैनल: पीई, पीई-डैजल 594, पीई-साइ 5, पीई-साइ 5.5, और पीई-साइ 7। पीई और पीई-डैजल 594 चैनल इन फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं (इस अध्ययन में डीपीपी 4 का पता लगाने के लिए पीई का प्रदर्शन किया गया है)। (डी) 640 एनएम लेजर के उत्सर्जन चैनल: एपीसी, एपीसी-एच 700, और एपीसी-साइ 7। सेनेसेंट कोशिकाओं का डीडीएओजी सिग्नल एपीसी चैनल (47.8% सेनेसेंट) में दिखाई देता है। सिग्नल एपीसी-एच 700 और एपीसी-साइ 7 चैनलों में ओवरलैप होता है, जिससे वे महत्वपूर्ण वर्णक्रमीय मुआवजे के बिना सह-धुंधला होने के लिए अनुपयुक्त हो जाते हैं। संक्षेप: बीएलएम = ब्लीमाइसिन; बीवी = ब्रिलियंट वायलेट; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; PERCP = पेरिडिनिन-क्लोरोफिल प्रोटीन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; DZ594 = चकाचौंध 594; एपीसी = एलोफियोसाइनिन; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस; डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: सेनेसेंट कोशिकाओं की एफएसीएस छंटाई के लिए सेल गेटिंग रणनीति। एक संवेदनशील एफएसीएस साइटोमीटर के माध्यम से कोशिकाओं के निलंबन को पारित करने के लिए छंटाई की शुद्धता और इष्टतम उपकरण कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त गेटिंग की आवश्यकता हो सकती है। एक उदाहरण रणनीति यहां दिखाया गया है। उपयोग किए जा रहे एफएसीएस साइटोमीटर के लिए निर्माता की सिफारिशों के आधार पर अन्य रणनीतियां संभव हैं। बाएं कॉलम, वाहन-केवल उपचारित सेल नियंत्रण। दाहिना स्तंभ, ए 549 कोशिकाओं को बीएलएम के साथ इलाज किया जाता है ताकि शिथिलता को क्रमबद्ध किया जा सके। (ए) एफएससी-ए (सेल वॉल्यूम) बनाम एसएससी-ए (सेल ग्रैन्यूलैरिटी) बरकरार कोशिकाओं की गेटिंग। बरकरार द्वार क्रमबद्ध नमूने से सेल मलबे को समाप्त करता है। (बी) एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच शुद्धता गेटिंग; डबल्स और मलबे को हटाता है। (सी) एसएससी-ए बनाम एसएससी-एच शुद्धता गेटिंग; डबल्स और मलबे को हटाता है। (डी) एपीसी-ए चैनल (637 एनएम उत्तेजना, 670 एनएम ± 30 एनएम उत्सर्जन, डीडीएओजी के लिए उपयोग किया जाता है) बनाम एफआईटीसी-ए चैनल (488 एनएम उत्तेजना, 530 एनएम ± 30 एनएम उत्सर्जन, एएफ के लिए उपयोग किया जाता है) का उपयोग करके रुचि की आबादी के लिए गेटिंग; संभावित धुंधला कलाकृतियों को हटा देता है। (ई) अंतिम छंटाई के लिए सेनेसेंट सेल गेटिंग। संक्षेप: एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; बीएलएम = ब्लीमाइसिन; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एसएससी-एच = साइड स्कैटर-पीक ऊंचाई। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: ट्यूमर के डीडीएओजी सेनेसेंस फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होना। ≥50,000 व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री डेटा। सेनेसेंट सेल गेट, प्रत्येक प्लॉट का ऊपरी दाहिना चतुर्थांश। सेनेसेंट (व्यवहार्य) ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिशत गेट के भीतर दिखाया गया है। ट्यूमर उपचार में (ए) खारा-केवल शामिल हैं; (बी) डीओएक्स; और (सी) पीएलडी। चूहों को तीन बार इलाज किया गया, हर 5 दिनों में एक बार, वसूली के लिए 7 दिनों के साथ बलिदान से पहले शिथिलता की शुरुआत की अनुमति देने के लिए। प्रति स्थिति पांच ट्यूमर का विश्लेषण किया गया था। संक्षेप: एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस; डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; डॉक्स = डॉक्सोर्यूबिसिन; पीएलडी = पीईजीलेटेड लिपोसोमल डॉक्सोर्यूबिसिन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पिछले एक दशक में, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी की उभरती लोकप्रियता, कम लागत वाले प्रवाह साइटोमीटर के विकास और शैक्षणिक संस्थानों में साझा इंस्ट्रूमेंटेशन सुविधाओं में सुधार के कारण फ्लो साइटोमेट्री कैंसर अनुसंधान में एक अधिक सामान्य परख मंच बन गया है। मल्टीकलर परख अब मानक हैं, क्योंकि अधिकांश नए उपकरण बैंगनी, नीले-हरे और लाल से दूर-लाल ऑप्टिकल सरणियों से लैस हैं। इस प्रकार, यह डीडीएओजी प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमीटर की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत होने की संभावना है। बेशक, किसी भी प्रवाह साइटोमीटर का उपयोगकर्ता-मूल्यांकन किया जाना चाहिए। डीडीएओजी परख में अतिरिक्त फ्लोरोफोर (जैसे, फ्लोरोसेंट, संयुग्मित एंटीबॉडी) जोड़ते समय विशेष देखभाल की जानी चाहिए। चैनलों के बीच फ्लोरोफोर क्रॉसस्टॉक का मूल्यांकन अन्य सभी प्रासंगिक चैनलों में देखे गए एकल-दाग वाले नियंत्रणों का उपयोग करके आयोजित किया जाना चाहिए। यदि ओवरलैप देखा जाता है, तो विशिष्टतरीकों का पालन करते हुए सुधार के लिए वर्णक्रमीय मुआवजा किया जा सकता है।

यहां दिखाए गए निष्कर्ष मुख्य रूप से यह प्रदर्शित करने के लिए हैं कि डीडीएओजी फ्लो साइटोमेट्री परख कोशिकाओं या ट्यूमर में कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा प्रेरित टीआईएस के लिए तेजी से, मात्रात्मक, आसानी से व्याख्या करने वाले परिणाम उत्पन्न कर सकती है। ईटीओ23,24, डीओएक्स 7,25 और बीएलएम 26,27 सहित यहां उपयोग किए जाने वाले एजेंटों को विभिन्न कैंसर सेल लाइनों 24 में टीआईएस को प्रेरित करने के लिए प्रलेखित किया गया है। डीडीएओजी जांच की विशिष्टता का प्रदर्शन करने के लिए, ज्ञात सेनोलिटिक एजेंट एबीटी -26321 को संस्कृति में चुनिंदा कोशिकाओं को खत्म करने के लिए प्रदर्शित किया गया था। यह पेपर एक मुराइन (बी 16-एफ 10) और एक मानव (ए 54 9) सुसंस्कृत कैंसर सेल लाइन के उपयोग को दर्शाता है, साथ ही चूहों में स्थापित बी 16-एफ 10 ट्यूमर। हालांकि, कोई भी कोशिका जो β-गैल को व्यक्त करती है और मानक प्रवाह साइटोमेट्री नमूना तैयारी के माध्यम से व्यवहार्यता बनाए रखती है, का उपयोग किया जा सकता है। कुछ सेल प्रकार टीआईएस के लिए अधिक नाजुक या कम प्रवण हो सकते हैं, और इसका मूल्यांकन बड़ी स्क्रीन या अध्ययन शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। यदि कोशिकाएं तैयारी में विघटित हो जाती हैं, व्यवहार्यता खराब होती है, या टीआईएस सकारात्मक एजेंट नियंत्रण का उपयोग करके अपेक्षा से बहुत कम होता है, तो सेल प्रकार सेनेसेंस के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल नहीं हो सकता है। यहां दिखाए गए एजेंटों और सेल लाइनों का उपयोग अन्य समूहों द्वारा संभावित टीआईएस-उत्प्रेरण एजेंटों या उपन्यास सेनोलिटिक्स की आगे की स्क्रीनिंग में नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है, जो क्षेत्र में एक सक्रिय लक्ष्य बना हुआ है।

कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा प्रेरित विषाक्तता सेल प्रकारों में भिन्न हो सकती है और परख परिणामों को प्रभावित कर सकती है। यदि एजेंट और / या एकाग्रता का प्राथमिक देखा गया प्रभाव तीव्र कोशिका मृत्यु है, तो समग्र शिथिलता न्यूनतम हो सकती है। विवो में, एजेंट खुराक को कम करके जानवरों में उच्च ट्यूमर नेक्रोसिस या प्रणालीगत विषाक्तता से बचा जाना चाहिए। परख की सफलता की कुंजी एजेंट सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण है, व्यवहार्यता परख डेटा के सावधानीपूर्वक निरीक्षण के साथ (उदाहरण के लिए, डीडीएओजी परख के भीतर सीवी 450 द्वारा प्रदान किया गया है)। इन विट्रो में, यदि कई मृत कोशिकाएं उपचार के दौरान प्लेट से अलग हो जाती हैं, जिसमें विश्लेषण किए गए नमूने में संस्कृति माध्यम भी शामिल है, तो कुल मिलाकर कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। सीवी 450 एकमात्र व्यवहार्यता दाग नहीं है जो इस परख के साथ संगत है; अन्य बैंगनी / नीले उत्सर्जक फ्लोरोफोरे का उपयोग किया जा सकता है। फिक्सेबल व्यवहार्यता जांच का भी उपयोग किया जा सकता है यदि उपयोगकर्ता पीएफए के साथ दाग वाले नमूनों को ठीक करने की योजना बनाता है, बशर्ते कि जांच प्रतिदीप्ति डीडीएओजी या एएफ के साथ महत्वपूर्ण रूप से ओवरलैप न हो (या उपयोगकर्ता ओवरलैप के लिए सही करने के लिए वर्णक्रमीय मुआवजा आयोजित करता है)। कुछ मामलों में जहां एजेंट विषाक्तता कम होती है और कोशिकाएं मजबूत होती हैं, प्रकाश स्कैटर (एफएससी बनाम एसएससी) द्वारा बरकरार कोशिकाओं को गेट करना विश्लेषण के लिए "व्यवहार्य" कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त हो सकता है।

इस इन विट्रो प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम तेजी से प्रारंभिक प्रसार की अनुमति देने के लिए लॉग विकास घनत्व (आमतौर पर 2 × 103-5 × 103 कोशिकाओं / सेमी2) की निचली सीमा में कोशिकाओं को प्लेट करना है, जो अधिकांश कोशिकाओं द्वारा कीमोथेरेपी दवा के उत्थान की सुविधा प्रदान करता है। एक बार इलाज करने के बाद, टीआईएस की शुरुआत के लिए समय की अनुमति देना भी महत्वपूर्ण है: इन विट्रो, दवा की उपस्थिति में 4 दिन ± 1 दिन; विवो में, अंतिम कीमोथेरेपी उपचार के बाद वसूली के 7 दिन। जैसा कि वर्णित डीडीएओजी के साथ धुंधला होने के बाद, साइटोमेट्रिक डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण दिखाया जाना चाहिए, यानी, प्रत्येक नमूने में डीडीएओजी बनाम एएफ कोशिकाओं को गेटिंग करना ताकि सेनेसेंट कोशिकाओं (कुल व्यवहार्य) के प्रतिशत को निर्धारित किया जा सके। वैकल्पिक चरणों में फ्लो साइटोमेट्री को मानकीकृत करने के लिए फ्लोरोसेंट "इंद्रधनुष" अंशांकन माइक्रोसेफर्स का उपयोग, दाग वाले नमूनों का पीएफए निर्धारण, सतह मार्करों के लिए सह-इम्यूनोस्टेनिंग, और डाउनस्ट्रीम परख के लिए सेनेसेंट कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए प्रवाह छंटाई शामिल है। हालांकि, इनमें से प्रत्येक वैकल्पिक चरण कुछ अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। अंशांकन माइक्रोसेफर्स कई सत्रों में साइटोमेट्री सेटअप को मानकीकृत करते हैं और उपयोगकर्ता को शुरू में सेनेसेंस और व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए एक उपयोगी सीमा में वोल्टेज सेट करने की अनुमति देते हैं, उसके बाद न्यूनतम समायोजन के साथ। नमूनों का पीएफए निर्धारण कोशिकाओं को स्थिर करता है और बाद के समय में कोशिकाओं के बड़े सेटों के बैच विश्लेषण की अनुमति देता है। सतह मार्करों के लिए सह-इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग नए सेनेसेंस से संबंधित प्रोटीन और प्रतिरक्षा इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। भविष्य के अध्ययनों में, हम डीडीएओजी के साथ इंट्रासेल्युलर सेनेसेंस मार्करों के सह-धुंधलापन को मान्य करने की योजना बना रहे हैं।

एफएसीएस द्वारा टीआईएस कोशिकाओं को छांटने से विषम आबादी से व्यवहार्य टीआईएस कोशिकाओं के संवर्धन की अनुमति मिलती है, जो पश्चिमी सोख्ता, प्रोटिओमिक्स या ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स जैसे डाउनस्ट्रीम परखों के लिए रीडआउट को भ्रमित कर सकता है। छंटाई के बाद, टीआईएस कोशिकाओं में डीडीएओजी की कोई महत्वपूर्ण विषाक्तता नहीं देखी गई, जिसे 5 दिनों तक संस्कृति में वापस रखा गया था। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि क्रमबद्ध कोशिकाओं को बीएएफ, आंतरिक डीडीएओजी (जिसे एसए-β-गैल द्वारा डीडीएओ, एक एक्रिडिन डाई में विभाजित किया जाता है) के साथ इलाज किया गया है, और एफएसीएस उपकरण से गुजरने वाले यांत्रिक तनाव के अधीन किया गया है। इसलिए, कुछ जैविक परिवर्तन जो सेनेसेंस से संबंधित नहीं हैं, क्रमबद्ध कोशिकाओं में मौजूद हो सकते हैं। हालांकि, इस अध्ययन में, क्रमबद्ध कोशिकाओं ने सेनेसेंस की मजबूत विशेषताओं को बनाए रखा और मिश्रित नियंत्रणों की तुलना में विशिष्ट प्रोटिओमिक्स और ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स परिणाम28 प्रदान किए। ट्यूमर से सेनेसेंट कोशिकाओं को इकट्ठा करने और विश्लेषण करने के लिए एफएसीएस का उपयोग करने की कुछ हद तक स्पष्ट उपयोगिता के बावजूद, इस प्रक्रिया का उपयोग साहित्य में शायद ही कभी किया गया है। कुछ समूहों ने माउस ऊतकों में सेनेसेंट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पी 16 इंक4 ए लूसिफेरस या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग किया है, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स ने कुछ अध्ययनों में एफएसीएस सॉर्टिंग को सक्षम किया है। निष्कर्ष आम तौर पर इस बात से सहमत हैं कि, प्रेरण एजेंट या ट्यूमर प्रकार की परवाह किए बिना, ट्यूमर में टीआईएस एक आंशिक से दुर्लभ घटना है, शायद ही कभी ट्यूमर कोशिकाओं के 100% तकपहुंचता है। डीडीएओजी विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की एफएसीएस छंटाई ट्रांसजेनिक संरचनाओं को व्यक्त करने की आवश्यकता के बिना ट्यूमर से दुर्लभ टीआईएस कोशिकाओं के संग्रह की आसानी से अनुमति देती है।

वर्तमान में, माउस मॉडल में अधिकांश सेनेसेंस अनुसंधान एक्स-गैल और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री मार्कर32,33 के संयोजन का उपयोग करके विवो में आयोजित किया जाता है। फिर भी, ट्यूमर ऊतकों का उपयोग करके टीआईएस एक्स विवो का आकलन करना एक लंबी प्रक्रिया हो सकती है, खासकर जब एक्स-गैल का उपयोग किया जाता है। इस प्रक्रिया के लिए ट्यूमर क्रायोप्रिजर्वेशन, स्लाइड पर क्रायोसेक्शनिंग, एक्स-गैल स्टेनिंग, कवर ग्लास माउंटिंग, सुखाने, इमेजिंग और स्कोरिंग "ब्लू" कोशिकाओं की आवश्यकता होती है- कम से कम एक बहु-दिवसीय दृष्टिकोण। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री बहुत तेज या आसान नहीं है, और प्रत्येक ट्यूमर में प्रत्येक मार्कर प्लस एक्स-गैल के लिए विभिन्न ऊतक वर्गों का उपयोग और स्कोर किया जाना चाहिए, जब तक कि मल्टीप्लेक्स विश्लेषण को अनुकूलित नहीं किया जाता है, प्रक्रिया के सामने के अंत में अधिक समय जोड़ता है। ऊतक अनुभाग ट्यूमर के केवल एक पतले क्रॉस-सेक्शन का नमूना लेते हैं, जबकि सेनेसेंट कोशिकाओं (कई सेल प्रकारों की तरह) को ट्यूमर29 में 3 डी स्पेस में असमान रूप से वितरित किया जा सकता है। ट्यूमर के लिए अधिक तेज़ और आसानी से मात्रात्मक सेनेसेंस परख की ओर धीमी, पुरानी हिस्टोलॉजी विधियों से दूर जाने के लिए क्षेत्र में तत्काल आवश्यकता है। डीडीएओजी फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके, ट्यूमर की फसल के बाद 1 दिन से भी कम समय में निर्णायक, मात्रात्मक सेनेसेंस डेटा प्राप्त करने के लिए 15 ट्यूमर के एक सेट को अलग और दाग दिया जा सकता है। ट्यूमर का आधा हिस्सा प्रत्येक नमूने के लिए संसाधित किया गया था, जिससे प्रति ट्यूमर 3 डी स्पेस के नमूने में सुधार हुआ। यह डीडीएओजी फ्लो साइटोमेट्री दृष्टिकोण ट्यूमर में टीआईएस के मूल्यांकन के लिए ऊतक स्लाइड-आधारित विधियों की तुलना में काफी तेज और अधिक विश्वसनीय है।

एक्स-गैल और अन्य तरीकों पर इसके कई फायदों के साथ, हम डीडीएओजी प्रोटोकॉल को नए सोने के मानक सेनेसेंस परख बनने की वकालत करते हैं। यह पारंपरिक रूप से स्वीकृत सेनेसेंस मार्कर, एसए-β-गैल, और उम्र से जुड़े एएफ का लेबल-मुक्त पता लगाने दोनों को दूसरे मार्कर के रूप में उपयोग करता है। ये फ्लोरोफोरे अधिकांश मानक प्रवाह साइटोमीटर के साथ संगत हैं। परख में दवा-उपचारित सुसंस्कृत सेल लाइनों या ट्यूमर से आसानी से प्राप्त नमूनों का उपयोग करके मृत कोशिकाओं और मलबे को बाहर करने के लिए एक व्यवहार्यता दाग शामिल है। लाइव सेल नमूने वैकल्पिक रूप से बड़े अध्ययनों के बैच विश्लेषण की सुविधा के लिए विलायक-फिक्स्ड या क्रायोसंरक्षित हो सकते हैं, उदाहरण के लिए, कई एजेंटों का उपयोग करके समय के साथ टीआईएस की शुरुआत का मूल्यांकन करने के लिए समय बिंदुओं का उपयोग करना धुंधला प्रक्रिया को पूरा करने में प्रयोगशाला के काम के आधे दिन से भी कम समय लगता है, और डेटा अधिग्रहण आमतौर पर प्रति नमूना <5 मिनट होता है। डेटा विश्लेषण इसी तरह तेज और सीधा है, जो थकाऊ सेल स्कोरिंग और गिनती के बिना प्रति नमूना टीआईएस कोशिकाओं के प्रतिशत पर मात्रात्मक डेटा का उत्पादन करता है। टीआईएस कोशिकाओं की समृद्ध आबादी को पुनर्प्राप्त करने के लिए नमूने एफएसीएस-क्रमबद्ध किए जा सकते हैं, जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में सेलुलर विषमता से शोर को कम करता है। हमारा मानना है कि डीडीएओजी परख, कई मामलों में, एक्स-गैल को प्रतिस्थापित कर सकती है, जिससे विट्रो और विवो में टीआईएस-उत्प्रेरण एजेंटों और सेनोलिटिक्स की स्क्रीनिंग की सुविधा मिलती है, जिससे सेनेसेंस अनुसंधान के क्षेत्र में तेजी से और अधिक विश्वसनीय खोजें हो सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास इस अध्ययन के लिए घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम फ्लो साइटोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन पर समर्थन के लिए शिकागो विश्वविद्यालय में साइटोमेट्री और एंटीबॉडी कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। शिकागो विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान केंद्र ने पशु आवास प्रदान किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

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References

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फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन के लिए फार-रेड फ्लोरोसेंट सेनेसेंस-संबद्ध β-गैलेक्टोसिडेस जांच
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Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

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