Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Far-Red Fluorescerende Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for identifisering og anrikning av Senescent tumorceller ved flowcytometri

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

En protokoll for fluorescerende, flowcytometrisk kvantifisering av senescent kreftceller indusert av kjemoterapi narkotika i cellekultur eller i murine tumor modeller presenteres. Valgfrie prosedyrer inkluderer co-immunostaining, prøvefiksering for å lette stor batch- eller tidspunktanalyse, og anrikning av levedyktige senescentceller ved flowcytometrisk sortering.

Abstract

Cellulær senescens er en tilstand av proliferativ arrestasjon indusert av biologisk skade som normalt påløper over år i aldrende celler, men kan også dukke opp raskt i tumorceller som et svar på skade forårsaket av ulike kreftbehandlinger. Tumorcellesenescens anses generelt som uønsket, da senescentceller blir resistente mot død og blokkerer tumorremisjon mens de forverrer tumormalignitet og behandlingsresistens. Derfor er identifisering av senescent tumorceller av pågående interesse for kreftforskningsmiljøet. Ulike senescence analyser eksisterer, mange basert på aktiviteten til den velkjente senescence markøren, senescence-assosiert beta-galactosidase (SA-β-Gal).

Vanligvis utføres SA-β-Gal-analysen ved bruk av et kromogent substrat (X-Gal) på faste celler, med langsom og subjektiv oppregning av "blå" senescentceller ved lysmikroskopi. Forbedrede analyser ved bruk av cellepermeante, fluorescerende SA-β-Gal-substrater, inkludert C12-FDG (grønn) og DDAO-Galactoside (DDAOG; langt rød), har gjort det mulig å analysere levende celler og tillatt bruk av fluorescerende analyseplattformer med høy gjennomstrømning, inkludert flowcytometre. C12-FDG er en veldokumentert sonde for SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende utslipp overlapper med egen cellulær autofluorescens (AF) som oppstår under senescens på grunn av akkumulering av lipofuscinaggregater. Ved å bruke den langt røde SA-β-Gal-sonden DDAOG, kan grønn cellulær autofluorescens brukes som en sekundær parameter for å bekrefte senescence, noe som gir pålitelighet til analysen. De resterende fluorescenskanalene kan brukes til celle levedyktighet farging eller valgfri fluorescerende immunmerking.

Ved hjelp av flowcytometri demonstrerer vi bruken av DDAOG og lipofuscin autofluorescens som en dual-parameter analyse for identifisering av senescent tumorceller. Kvantifisering av prosentandelen av levedyktige senescentceller utføres. Om ønskelig kan et valgfritt immunmerkingstrinn inkluderes for å evaluere celleoverflateantigener av interesse. Identifiserte senescentceller kan også flyte cytometrisk sortert og samlet for nedstrøms analyse. Oppsamlede senescentceller kan umiddelbart lyses (f.eks. for immunoassays eller 'omics analyse) eller videre dyrket.

Introduction

Senescent celler akkumuleres normalt i organismer over år under normal biologisk aldring, men kan også utvikle seg raskt i tumorceller som et svar på skade forårsaket av ulike kreftbehandlinger, inkludert stråling og kjemoterapi. Selv om det ikke lenger sprer seg, kan terapiinduserte senescent (TIS) tumorceller bidra til behandlingsresistens og drive tilbakefall 1,2,3. Faktorer utskilt av TIS-celler kan forverre tumor malignitet ved å fremme immununnvikelse eller metastase 4,5. TIS-celler utvikler komplekse, kontekstspesifikke fenotyper, endrede metabolske profiler og unike immunresponser 6,7,8. Derfor er identifisering og karakterisering av TIS-tumorceller indusert av ulike kreftbehandlingsmetoder et tema av kontinuerlig interesse for kreftforskningsmiljøet.

For å oppdage TIS-tumorceller er konvensjonelle senescensanalyser mye brukt, hovedsakelig basert på å oppdage økt aktivitet av senescensmarkørenzymet, den lysosomale beta-galaktosidase GLB19. Deteksjon ved en nesten nøytral (snarere enn sur) lysosomal pH muliggjør spesifikk påvisning av senescensassosiert beta-galaktosidase (SA-β-Gal)10. En standard SA-β-Gal-analyse som har blitt brukt i flere tiår, bruker X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), et blått kromogent beta-galaktosidasesubstrat, for å oppdage SA-β-Gal i faste celler ved lysmikroskopi11. X-Gal-analysen tillater kvalitativ visuell bekreftelse av TIS ved bruk av allment tilgjengelige reagenser og laboratorieutstyr. Et grunnleggende overført lysmikroskop er den eneste instrumenteringen som kreves for å evaluere tilstedeværelsen av det blå kromogenet. Imidlertid kan X-Gal-fargeprosedyren mangle følsomhet, noen ganger krever mer enn 24 timer for at farge skal utvikle seg. Farging etterfølges av lav gjennomstrømning, subjektiv scoring av individuelle senescentceller basert på å telle cellene som viser et visst intensitetsnivå av det blå kromogenet under et lysmikroskop. Siden X-Gal er celle-ugjennomtrengelig, krever denne analysen løsemiddelfikserte celler, som ikke kan gjenopprettes for nedstrømsanalyse. Ved arbeid med begrensede prøver fra dyr eller pasienter kan dette være en stor ulempe.

Forbedrede SA-β-Gal-analyser ved bruk av cellepermeante, fluorescerende enzymsubstrater, inkludert C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, grønn) og DDAOG (9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en-7-yl) β-D-Galactopyranoside, langt rød) har tidligere dukket opp i litteraturen12,13,14,15. Den kjemiske sondestrukturen og optiske egenskapene til DDAOG er vist i tilleggsfigur S1. Disse celle-permeant sonder tillater analyse av levende (snarere enn faste) celler, og fluorescerende snarere enn kromogene prober lette bruken av raske high-throughput fluorescerende analyseplattformer, inkludert høyinnhold screening instrumenter og flow cytometre. Sortering av flowcytometre muliggjør gjenoppretting av berikede populasjoner av levende senescentceller fra cellekulturer eller svulster for nedstrøms analyse (f.eks. Western blotting, ELISA eller 'omics). Fluorescensanalyse gir også et kvantitativt signal, noe som muliggjør mer nøyaktig bestemmelse av prosentandelen av senescentceller i en gitt prøve. Ytterligere fluorescerende prober, inkludert levedyktighetssonder og fluoroformerkede antistoffer, kan lett legges til for multiplekset analyse av mål utover SA-β-Gal.

I likhet med DDAOG er C12-FDG en fluorescerende sonde for SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende utslipp overlapper med inneboende cellulær AF, som oppstår under aldring på grunn av akkumulering av lipofuscinaggregater i celler16. Ved å bruke den langt røde DDAOG-sonden, kan grønn cellulær AF brukes som en sekundær parameter for å bekrefte senescence17. Dette forbedrer analysepåliteligheten ved å bruke en annen markør i tillegg til SA-β-Gal, som ofte kan være upålitelig som en enkelt markør for senescence18. Siden deteksjon av endogen AF i senescentceller er en etikettfri tilnærming, er det en rask og enkel måte å utvide spesifisiteten til vår DDAOG-baserte analyse.

I denne protokollen demonstrerer vi bruken av DDAOG og AF som en rask, dual-parameter flowcytometrianalyse for identifisering av levedyktige TIS-tumorceller fra in vitro-kulturer eller isolert fra legemiddelbehandlede svulster etablert hos mus (figur 1). Protokollen bruker fluoroforer som er kompatible med et bredt spekter av standard kommersielle flowcytometrianalysatorer og sorteringsmaskiner (tabell 1). Kvantifisering av prosentandelen av levedyktige senescentceller ved bruk av standard flowcytometrianalyse er aktivert. Om ønskelig kan et valgfritt immunmerkingstrinn utføres for å evaluere celleoverflateantigener av interesse samtidig med senescens. Identifiserte senescentceller kan også berikes ved hjelp av standard fluorescensaktivert cellesortering (FACS) metodikk.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt. En skjematisk oppsummering av nøkkelpunkter i DDAOG-analysen. (A) Et TIS-induserende legemiddel tilsettes pattedyrdyrkede celler eller administreres til tumorbærende mus. Tid er da tillatt for utbruddet av TIS: for celler, 4 dager etter behandling; For mus, 22 dager totalt, med tre behandlinger hver 5. dag pluss 7 dager utvinning. Celler høstes eller svulster dissosieres til suspensjon. (B) Prøver behandles med Baf for å justere lysosomal pH for påvisning av SA-β-Gal i 30 minutter; deretter legges DDAOG-sonden til i 60 minutter for å oppdage SA-β-Gal. Prøver vaskes 2x i PBS, og en levedyktighetsflekk tilsettes kort (15 min). Eventuelt kan prøver farges med fluorescerende antistoffer i åpne fluorescenskanaler og / eller fikses for senere analyse. (C) Prøver analyseres ved hjelp av et standard flowcytometer. Levedyktige celler visualiseres i punktplott som viser rød DDAOG (indikerer SA-β-Gal) versus grønn autofluorescens (lipofuscin). En port for å bestemme prosentandelen av TIS-celler er etablert basert på ubehandlede kontrollprøver (ikke vist). Hvis et sorteringscytometer (FACS) brukes, kan TIS-celler samles og plasseres tilbake i kultur for videre in vitro-analyser eller lyses og behandles for molekylærbiologiske analyser. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = terapi-indusert senescence; FL-Ab = fluorofor-konjugert antistoff; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = senescence-assosiert beta-galaktosidase; PBS = fosfatbufret saltvann; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fluorophore Oppdager Eks/Em (nm) Cytometer laser (nm) Cytometer detektor / båndpassfilter (nm)
DDAOG SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
AF Lipofuscin < 600 488 525 / 50
CV450 Levedyktighet 408/450 405 450 / 50
PE Antistoff/overflatemarkør 565/578 561 582 / 15

Tabell 1: Fluoroforer og cytometer optiske spesifikasjoner. Cytometerspesifikasjoner som brukes i denne protokollen er oppført for et instrument med totalt 4 lasere og 15 utslippsdetektorer. DDAOG oppdaget ved 645/660 nm er formen av sonden spaltet av SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan vise lavt nivå fluorescens ved 460/610 nm, men fjernes ved vask trinn i protokollen. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescens; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = senescence-assosiert beta-galaktosidase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbeid som ble beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Chicago.

1. Klargjøring og lagring av lagerløsninger

MERK: Hvis cellene skal flytsorteres, skal alle løsninger fremstilles ved hjelp av sterile teknikker og filtreres gjennom en 0,22 μm filteranordning.

  1. Klargjør en stamløsning av DDAO-Galactoside ved 5 mg/ml i DMSO. Aliquot ved 50 μL per rør (eller ønsket volum). Oppbevares ved -20 °C i mørke i opptil 1 år.
  2. Forbered en stamløsning av bafilomycin A1 ved 1 mM i DMSO. Aliquot ved 50 μL per rør (eller ønsket volum). Oppbevares ved −20 °C i opptil 6 måneder.
  3. Forbered en lagerløsning av Calcein Violet 450 AM ved 1 mM i DMSO. Aliquot ved 50 μL per rør (eller ønsket volum). Oppbevares ved -20 °C i mørke i opptil 1 år.
  4. For behandling av dyrkede celler in vitro, lag 10 mM konsentrerte stamløsninger av senescensinduserende middel(er) i egnet løsningsmiddel, og steriliser ved bruk av 0,2 μm sprøytefiltre. Oppbevares ved −20 °C eller som anvist av produsenten.
    MERK: For levering av senescence-induserende kjemoterapimidler in vivo (til mus med etablerte svulster), bør midlene være USP-klasse og fortynnes i saltvann fra konsentrert lager like før injeksjon.
  5. Forbered komplett kulturmedium for cellelinjen (e) som brukes.
    MERK: Forbered for eksempel medium for B16-F10- eller A549-celler med DMEM 1x + 10% FBS + 1x glutaminerstatning + 1x penicillin / streptomycin. Mediene må holdes sterile. Andre cellelinjespesifikke medieformuleringer kan brukes. Visse komponenter som glutation kan i noen tilfeller forstyrre utbruddet av senescens. Empirisk testing av ulike medieformuleringer bør utføres dersom utbruddet av senescence er lavere enn forventet eller ikke observert med kontrollkjemoterapimidler.
  6. Forbered farging og vask buffere.
    1. Forbered 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS til bruk i fargeprosedyrer. Løs opp 2 g BSA i 200 ml PBS og rør i 10 minutter, eller til den er helt oppløst, ved romtemperatur.
    2. Forbered 0.5% BSA i 1x PBS som en vaskebuffer. Fortynn 100 ml av 1 % BSA fremstilt i trinn 1,6,1 til 100 ml 1x PBS for 0,5 % BSA.
    3. Oppbevar buffere ved 4 °C i opptil 1 måned.
  7. Forbered 4% paraformaldehyd i 1x PBS. Bruk kommersielt tilgjengelige, forseglede paraformaldehydampuller (f.eks. 16 % v/v) for enkelhets skyld og stabilitet: 2,5 ml 16 % PFA + 7,5 ml 1x PBS (= 10 ml 4 % PFA). Juster det forberedte volumet avhengig av det totale volumet som trengs per eksperiment.
    MERK: Forbered deg bare etter behov for cellefiksering. Forbered deg frisk hver gang.
  8. Forbered FACS sorteringsbuffer: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Sterilt filter gjennom en 0,22 μm filtreringsenhet og oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
    MERK: Forbered deg bare etter behov for FACS-sortering. Flytsorteringsbufferformuleringer kan variere på tvers av FACS-instrumenter. Formuleringen ovenfor er kompatibel med instrumentet som ble brukt i denne studien (se Materialtabell). Se produsentens retningslinjer.
  9. Forbered tumordissosiasjonsløsning: 20 μg / ml Liberase TL + 100 μg / ml DNAse I i RPMI-1640 media (uten FBS eller andre kosttilskudd). Lagerløsninger er nyttige for hånden av Liberase TL (tilberedt og lagret som anvist av produsenten) og DNAse I (100 mg / ml i dobbeltdestillert vann [ddH2O], lagret ved -20 ° C).
    MERK: Forbered etter behov hvis du bare bruker svulster; Forbered deg frisk hver gang.

2. Induksjon av senescens ved kjemoterapi narkotika i dyrkede kreftceller

MERK: Alle cellemanipuleringstrinn i denne delen skal utføres i et biosikkerhetsskap ved bruk av steril praksis. Denne delen er skrevet for adherente celletyper. Suspensjonsceller kan brukes med passende modifikasjoner som nevnt.

  1. Dyrk kreftcellelinjen(e) i henhold til standardprotokollen fra leverandøren eller laboratoriet som leverte de(n) spesifikke cellelinjen(e) som ble brukt.
    MERK: Celler med lav passasje (p < 10) foretrekkes generelt, da det vil være lavere nivåer av replikativ senescens, dvs. lavere bakgrunn, i ubehandlede celleprøver.
  2. En dag før senescence induksjon av legemidler, høst celler med trypsin-EDTA 0,25% (eller som anbefalt). Nøytraliser trypsin ved å tilsette et likt volum av komplett kulturmedium, og overfør cellesuspensjonen til et sterilt konisk rør.
    MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig for suspensjonsceller.
  3. Tell cellene ved hjelp av standard hemacytometermetode og registrer celler / ml. Plateceller ved 1 × 10 3-10× 103 celler/cm2 i standard 6-brønns plastkulturskåler.
    MERK: Optimal pletteringstetthet er avhengig av cellens proliferasjonshastighet og bør bestemmes av brukeren. Celler bør være i loggfasevekst ved ca. 10% -20% sammenløp på behandlingstidspunktet (dvs. etter 18-24 timers inkubasjon etter plating). Starttettheten (celler/ml) av suspensjonsceller bør bestemmes av brukeren. Plater med seks brønner gir vanligvis nok senescentceller per brønn for en standard flowcytometrianalyseprøve. Ved strømningssortering bør et mye større overflateareal (f.eks. flere P150-plater) brukes for å muliggjøre gjenvinning av tilstrekkelig antall senescentceller for nedstrømsanalyser (≥1 × 106).
  4. Inkuber belagte celler over natten (18-24 timer) i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 og en fuktighetspann.
  5. Behandle de belagte cellene med senescence-induserende kjemoterapi narkotika (er). Inkluder minst én positiv kontroll, f.eks. etoposid (ETO) eller bleomycin (BLM). Forbered dupliserte brønner per legemiddel. Inkluder ett sett behandlet med bare kjøretøy som kontroll.
    MERK: En dosekurve for hvert eksperimentelt middel bør testes av brukeren for å bestemme den optimale konsentrasjonen for senescensinduksjon i cellelinjen (e) som brukes.
  6. Inkuber celler i 4 dager i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og en fuktighetspanne for å tillate utbruddet av senescens. Undersøk daglig for forventede morfologiendringer ved hjelp av et lysmikroskop.
    MERK: Inkubasjonstider fra 3-5 dager kan være akseptabelt avhengig av senescence-utbruddet. Media kan endres og agenten brukes på nytt (eller ikke), som ønsket, for å fremme sunne vekstforhold samtidig som man oppnår en akseptabel prosentandel av senescentceller.
  7. Etter utbruddet av senescens, høst cellene ved å tilsette trypsin-EDTA 0,25% i 5 minutter ved 37 ° C. Når celler dissosieres i suspensjon, nøytraliser trypsin med et like stort volum komplett medium.
    MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig for celler som vokser i suspensjon. Hvis overflatemarkørfarging vil bli utført, unngå bruk av trypsin-EDTA, da det midlertidig kan ødelegge overflateantigener på celler. I stedet dissosierer du monolaget forsiktig ved hjelp av en steril plastcelleskraper (eller et alternativt dissosiasjonsreagens designet for å bevare overflateantigener).
  8. Tell cellene i hver prøve ved hjelp av et hemacytometer. Beregn cellene/ml for hver prøve.
    MERK: Trypanblå kan legges til for å evaluere prosentandelen døde celler på dette tidspunktet (dvs. på grunn av narkotikabehandling), men celledød vil også bli bestemt med et fluorescerende levedyktighetsfargestoff under DDAOG-fargingsarbeidsflyt.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 celler per prøve i 1,7 ml mikrosentrifugerør.
    MERK: Antall celler per prøve skal standardiseres på tvers av alle prøver.
  10. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 1000 × g i en mikrosentrifuge ved 4 °C. Fjern supernatanten.
    MERK: Hvis en nedkjølt mikrosentrifuge ikke er tilgjengelig, kan det være akseptabelt å utføre sentrifugering ved omgivelsestemperatur for visse elastiske celletyper.
  11. Fortsett til DDAOG-farging i avsnitt 4.

3. Induksjon av senescens ved kjemoterapi narkotika i svulster etablert hos mus

MERK: Hvis tumorceller skal FACS-sorteres, må du sørge for sterilitet på hvert trinn ved å arbeide i et biosikkerhetsskap og arbeide med sterile instrumenter, prosedyrer og reagenser.

  1. Lag musetumormodeller ved å injisere kreftceller subkutant, i henhold til standardmetoder (f.eks. Appelbe et al.19).
    MERK: Antall kreftceller som skal injiseres, injeksjonsstedet og riktig musestamme bør optimaliseres for hver protokoll. Her ble B16-F10-celler injisert subkutant ved 1 × 106 celler i 0,1 ml saltvann (1 × 107 celler/ml).
    1. Kontroller at levedyktigheten til celler som bruker trypanblå er >90% før du utfører injeksjoner. Bedøv musene med isofluran.
    2. Bedøv 6-7 uker gamle kvinnelige C57 / BL6 mus med en blanding av 3% isofluran og luft og opprettholde under disse forholdene i et induksjonskammer plassert i et sterilt biosikkerhetsskap. Bekreft anestesi ved å forsiktig klemme musens fot. Påfør steril veterinærsalve på begge øynene for å forhindre tørking av hornhinnen under prosedyren. Under prosedyren, opprettholde musens kroppstemperatur ved hjelp av en varmelampe.
    3. Arbeid inne i et sterilt biosikkerhetsskap, fjern musen fra induksjonskammeret og plasser den i kontakt med en nesekegle som gir en 3% isoflurantilførsel. Barber flankeområdet på injeksjonsstedet med en ren elektrisk barberhøvel. Bland den tilberedte cellesuspensjonen kort ved å snu slangen manuelt like før injeksjonen, og injiser cellesuspensjonen subkutant inn i den barberte flanken(e) ved hjelp av en steril 0,5 ml sprøyte utstyrt med en steril 27 G nål. Fjern musen fra hetten og overfør den til gjenopprettingsburet.
    4. I gjenopprettingsburet overvåker du musenes vitale tegn kontinuerlig til de har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency, demonstrere rettingsrefleksen og er i stand til å bevege seg trygt rundt i buret. Ikke la mus være uten tilsyn eller returner dyr som har gjennomgått tumorcelleinokulasjon til selskap med andre dyr til de er fullstendig gjenopprettet. Overvåk alle inokulerte mus daglig for vekttap, redusert aktivitet / mobilitet og nevrologiske symptomer; Avlive mus som viser alvorlige symptomer i en hvilken som helst kategori. For mus som viser smertesymptomer etter inokulasjon, administrer buprenorfin (0,1-0,2 mg / kg) en gang subkutant.
      MERK: Mus som viser vedvarende smerte etter buprenorfin bør avlives.
  2. Start 5-7 dager etter kreftcelleinokulasjon, måle tumorvekst med kalipere hver 2-3 dager. Oppstart av prosenescerende behandling når svulsten har nådd 50 mm 3 ± 10 mm3 i volum.
    MERK: I dette arbeidet ble doser av USP-grad doksorubicinhydroklorid (DOX) eller PEGylert liposomalt doksorubicin (PLD) ved 10 mg/kg administrert i 0,9 % natriumkloridinjeksjon (USP). Legemidler ble injisert intraperitonealt 3x, en gang hver 5. dag, og startet når svulstene nådde 50 mm 3 ± 10 mm3. Mus gjenopprettet i 7 dager etter den endelige behandlingen for å tillate utbruddet av TIS i svulster. Senescence induksjonsdoser og betingelser for andre behandlinger og / eller tumormodeller bør optimaliseres.
  3. På 7 dager etter den endelige legemiddelbehandlingen, ofre musene ved CO2 overdose og cervikal dislokasjon eller andre godkjente metoder i samsvar med retningslinjer for laboratoriedyrarbeid. Excise svulstene og samle dem i sterile rør eller 6-brønnsplater fylt med sterilt RPMI vekstmedium (for å bevare levedyktigheten under behandlingen).
    MERK: Hvis du utfører en histologisk undersøkelse (f.eks. X-Gal eller immunhistokjemi), kan svulster krysses her, med en halv snap-frosset i O.C.T. innebyggingsmedium og kryoseksjonert ved hjelp av standardprosedyrer for frossen vevshistologi. Den gjenværende tumorhalvdelen skal gi rikelig materiale for dissosiasjon og DDAOG-farging.
  4. Overfør en svulst til en P100 plastskål som inneholder 5 ml RPMI medium. Hakk svulsten i stykker ved hjelp av en skalpell.
  5. Overfør 5 ml suspensjonen av tumorstykker som inneholder suspenderte celler og rusk i et 15 ml konisk rør. Bruk den bredere spissen av en 25 ml serologisk pipet for overføring av denne suspensjonen hvis det er stort rusk. Skyll parabolen med et ekstra volum steril RPMI for å samle materialer. Cap og legg det koniske røret på is.
  6. Gjenta trinn 3,45-3,5 for de resterende svulstene. Bruk en separat plate og skalpell for hver svulst for å unngå krysskontaminering, eller skyll godt med PBS mellom svulster. Bruk 5 ml friskt medium for hakking av hver svulst.
  7. Forbered tumordissosiasjonsløsningen: 20 μg / ml Liberase TL + 100 μg / ml DNAse I i RPMI-1640-medier (uten FBS).
    MERK: Mange effektive formuleringer for tumordissosiasjonsløsninger eksisterer og kan inkludere en rekke enzymer og andre komponenter fra forskjellige produsenter. Optimale konsentrasjoner av komponenter kan variere sterkt på tvers av tumortyper. Hvis røde blodlegemer er svært tilstede i svulsten, kan røde blodlegemer lyse i tillegg utføres; Hvis døde celler er et problem, kan et dødcellefjerningssett brukes. Det anbefales sterkt for brukeren å selvstendig bestemme optimale tumordissosiasjonsforhold som gir høy levedyktighet og lav tilstedeværelse av forurensende celler, bindemateriale og rusk.
  8. Sentrifuge alle tumorprøver i koniske rør i 5 minutter ved 1000 × g (4 °C). Fjern supernatanten.
  9. Tilsett 1-5 ml tumordissosiasjonsløsning til hver tumorprøve, avhengig av volumet av tumormateriale. Sørg for at det er 1-2 ml i overkant av tumormaterialet pellet i røret. Vortex med moderat hastighet å blande.
  10. Plasser prøvene i en 37 °C inkubator med rask rotasjon i 45 min. Vortex kort hvert 15. minutt.
  11. Filtrer hver prøve gjennom en 100 μm cellesil i et 50 ml konisk rør. Hvis prøvene er for viskøse til å passere gjennom filteret, tilsett 10 ml RPMI-1640 medium for å fortynne. Skyll filtrene med RPMI-medium for å samle restcellene.
  12. Bruk et hemacytometer for å telle cellene / ml for hver prøve.
  13. Aliquot to eller flere replikerer av 5 × 106 celler per tumorprøve.
  14. Sentrifuge i 5 minutter ved 1 000 × g (4 °C). Fjern supernatanten.
  15. (Valgfritt) Cryopreserve tumorprøvene for senere DDAOG-farging om ønskelig.
    1. Resuspend den dissosierte tumorcellepelleten i kryopreserveringsmedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, fremstilt under sterile forhold ved 5 × 106 celler / ml.
    2. Aliquot 1 ml cellesuspensjon i hver kryovial.
    3. Frys kryovialene i 24 timer i en isopropanolcellefrysebeholder ved −80 °C; Deretter overføres til flytende nitrogen cryostorage for langtidslagring (>1 uke).
    4. Når farging er ønskelig, tine kryoalene på is og fortsett til DDAOG-farging i seksjon 4.
      MERK: Noen svulster kan ikke forbli levedyktige gjennom cryopreservering, og motstandskraft mot denne prosessen bør evalueres av brukeren for tumormodellen av interesse.
  16. Fortsett til seksjon 4 for DDAOG-farging.

4. DDAOG-farging av SA-β-Gal i celle- eller tumorprøver

  1. Fortynn 1 mM Bafilomycin A1 lager ved 1: 1,000x i DMEM medium (uten FBS) for en endelig konsentrasjon på 1 μM.
  2. Tilsett tilberedt Baf-DMEM-løsning i cellepelletsprøvene (fra trinn 2.11 eller trinn 3.16) for en konsentrasjon på 1 × 106 celler/ml.
    Hvis du for eksempel bruker 0,5 × 106 celler per prøve, legger du til 0,5 ml Baf-DMEM. For svulster kan 5 × 106 celler farges i 5 ml Baf-DMEM.
  3. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C (uten CO2) på en rotator/shaker satt med lav hastighet.
    MERK: Unngå CO 2-inkubatorer for fargeprosessen, som kan forsure løsninger og dermed forstyrre Baf- og DDAOG-farging.
  4. Uten vask tilsettes DDAOG-stamløsningen (5 mg/ml) ved 1:500x (10 μg/ml endelig) til hver prøve. Pipette å blande. Skift på rotator/shaker ved 37 °C (uten CO2) i 60 min. Beskytt mot direkte lys.
  5. Sentrifuge rørene i 5 min ved 1000 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten.
  6. Vask med 1 ml iskald 0,5% BSA per rør og pipette for å blande. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 1000 x g ved 4 °C og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet 2x for å vaske cellene grundig. Fjern supernatanten og fortsett.
    MERK: Det er viktig å utføre vasketrinnene i trinn 4.6 for å fjerne uønsket DDAOG, som kan utvise uønsket fluorescensutslipp (460/610 nm).
    MERK: Hvis immunstaining for celleoverflatemarkører, fortsett til avsnitt 5 nedenfor.
  7. (Valgfritt) Fiksering og lagring av DDAOG-fargede celler for senere analyse
    1. Tilsett 0,5 ml iskald 4% paraformaldehyd dråpevis til hver vasket prøve. Pipette å blande.
    2. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
    3. Vask cellene 2x med 1 ml PBS.
    4. Oppbevar prøvene i opptil 1 uke ved 4 °C før flowcytometrianalyse.
      MERK: For faste prøver, hopp over trinn 4.8.
  8. Fortynn Calcein Violet 450 AM lager (1 mM) ved 1: 1,000x til 1% BSA-PBS (1 μM finale). Tilsett 300 μL (for dyrkede celleprøver) eller 1000 μL (for tumorprøver) til de vaskede cellepellets fra trinn 4.6. Inkuber i 15 minutter på is i mørket.
  9. Fortsett til oppsett av flowcytometri (avsnitt 6).

5. (Valgfritt) Immunostaining for celleoverflatemarkører i kombinasjon med DDAOG

MERK: Som med ethvert flowcytometrieksperiment, bør enkeltfargede kontrollprøver med kun DDAOG og fluorescerende antistoff bare være forberedt på å bestemme crosstalk (hvis noen) på tvers av fluorescenskanaler. Hvis crosstalk observeres, bør standard flowcytometrikompensasjon utføres20.

  1. Resuspend cellepellets oppnådd i trinn 4.6 i 100 μL fargebuffer (1% BSA i 1x PBS).
  2. Tilsett Fc-reseptorblokkerende reagens som er egnet for celleartene (mus eller menneske) ved produsentens anbefalte titrering. Rug i 10 minutter ved 24 °C.
  3. Legg til fluoroforkonjugerte antistoffer ved titrering anbefalt av produsenten (eller bestemt av brukeren). Inkuber i 20 minutter på is, beskyttet mot lys.
  4. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 1000 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten.
  5. Vask med 1 ml iskald vaskebuffer (0,5% BSA-PBS) per rør og pipette for å blande. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 1000 × g ved 4 °C og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet 2x for å vaske cellene grundig.
  6. Fortynn 1 mM Calcein Violet 450 AM ved 1: 1,000x til 1% BSA-PBS. Tilsett 300 μL til de vasket cellepellets fra trinn 5.5. Inkuber i 15 minutter på is i mørket.
  7. Fortsett til flowcytometrianalyse (avsnitt 6-7).

6. Oppsett av flowcytometer og datainnsamling

  1. Overfør celleprøvene til rør som er kompatible med flowcytometriinstrumentet. Legg rørene på is og hold dem beskyttet mot lys.
    MERK: Hvis aggregater observeres i cellesuspensjonene, pass suspensjonen gjennom 70-100 μm cellesiler før analyse. Ikke bruk 40 μm siler fordi de kan utelukke noen av de større senescent cellene.
  2. I den refererte programvaren (se materialtabellen) åpner du følgende plott: 1) FSC-A vs SSC-A prikkplott, 2) fiolett kanalhistogram, 3) langt rød kanal (f.eks. APC-A) versus grønn kanal (f.eks. FITC-A) punktplott.
    MERK: Doblettekskluderingsplott og enkeltkanals histogrammer kan også brukes, men er ikke strengt nødvendig.
  3. Initiere cytometerdatainnsamling.
    1. Plasser kontrollprøven som kun er farget med DDAOG på inntaksporten. Ved lav inntakshastighet begynner du å skaffe prøvedata.
    2. Juster FSC- og SSC-spenninger slik at >90% av hendelsene er inneholdt i tomten. Hvis cellene ikke passer godt på tomten, senker du arealskaleringsinnstillingen til 0,33-0,5 enheter.
    3. Fjern bare kjøretøyprøven uten å registrere data.
    4. (Valgfritt) Tilsett en dråpe regnbuekalibreringsmikrosfærer til et cytometerrør med 1 ml PBS. Plasser røret på cytometerinntaksporten. Begynn å hente eksempeldata.
    5. Juster fiolette, grønne og langt røde kanalspenninger slik at den øverste toppen av regnbuemikrosfæren ligger i området 104-10 5 enheter relativ fluorescens i hver kanal, og alle toppene er godt skilt i hver kanal. Ta opp 10.000 arrangementer. Fjern røret.
  4. Plasser den positive kontrollprøven (f.eks. BLM, ETO) farget med DDAOG på inntaksporten. Skaff prøvedata med lav hastighet. Observer hendelsene i FSC, SSC, fiolette, grønne og fjernrøde kanaler for å sikre at over 90% av hendelsene finnes i alle tomter. Se etter en økning i AF- og DDAOG-signal kontra kjøretøykontroll.
  5. Hvis du bruker et sorteringscytometer, start sorteringen på dette trinnet.
    1. For arkiveringsformål registrerer du 10 000 celler for kontrolleksemplet og hver sorterte prøve.
    2. Sorter ønsket mengde celler (≥1 × 106 er vanligvis egnet) i et instrumenttilpasset oppsamlingsrør med 3-5 ml kulturmedium.
    3. Etter sortering, fortsett til nedstrøms kultur eller analyse.
    4. Gå til seksjon 7 for rutinemessig analyse av sorterte prøver.
  6. Hvis du bruker fluorescerende antistoffer, optimaliser kanalspenningene her ved å bruke de ufargede, enkeltfargede og dobbeltfargede prøvene fremstilt i avsnitt 5.
    MERK: For det kalibrerte flowcytometeret som brukes her, falt optimale kanalspenninger vanligvis mellom 250 og 600 (mellomtone), men de optimale spenningene og kanalspenningsområdene vil variere mellom instrumenter. Unngå å bruke spenninger på svært lave eller høye områder, noe som kan undertrykke signalet eller forsterke støy.
  7. Etter å ha fullført trinn 6.1-6.5 og gjort justeringer av cytometerinnstillingene etter behov, registrer data for alle prøvene. Sørg for at innstillingene forblir ensartede for alle prøveopptak. Ta opp ≥ 10 000 hendelser per dyrkede celleprøve eller ≥ 100 000 hendelser per tumorcelleprøve.
    MERK: Selv om gating og analyse kan utføres ved hjelp av datainnsamlingsprogramvare (f.eks. FACSDiva), er en komplett gating- og analysearbeidsflyt som skal utføres etter anskaffelse ved hjelp av separat analyseprogramvare (FlowJo) beskrevet i avsnitt 7 nedenfor. Analyse etter anskaffelse foretrekkes for å redusere tiden på cytometerarbeidsstasjonen og dra nytte av tilleggsverktøy som er inkludert i den dedikerte analyseprogramvaren.
  8. Lagre eksempeldata i .fcs-filformat. Eksporter filene til en arbeidsstasjonsdatamaskin utstyrt med programvare for flowcytometrianalyse (f.eks. Gå videre til § 7.

7. Analyse av flowcytometridata

MERK: Arbeidsflyten som presenteres bruker FlowJo programvare. Alternativ programvare for analyse av flowcytometridata kan brukes hvis de viktigste trinnene beskrevet i dette avsnittet følges på samme måte.

  1. Bruk FlowJo-programvaren til å åpne .fcs-datafiler fra trinn 6.7.
  2. Åpne oppsettvinduet.
  3. Dra og slipp alle prøvene i layoutvinduet.
  4. Gate levedyktige celler.
    1. Dobbeltklikk først på eksempeldataene for kjøretøykontrollen for å åpne datavinduet.
    2. Visualiser dataene som et histogram for fiolett kanal. Identifiser de levedyktige cellene farget av CV450 basert på deres lysere fluorescens enn de døde cellene.
    3. Tegn en port ved hjelp av histogramverktøyet med én port for å inkludere bare levedyktige celler. Navngi porten levedyktig.
    4. Deretter, fra eksempeloppsettvinduet, drar du den levedyktige porten til de andre celleprøvene for å bruke porten jevnt.
    5. I layoutvinduet visualiserer du alle eksemplene som histogrammer for fiolette kanaler (levedyktighet). Kontroller at levedyktig cellegating er hensiktsmessig på tvers av prøver før du fortsetter; Hvis ikke, gjør justeringer etter behov.
      MERK: Levedyktighet farging kan vise variasjoner på tvers av behandlinger eller svulster.
  5. Gate senescent celler.
    1. Dobbeltklikk på de inngjerdede levedyktige celledataene for kjøretøyets eneste kontroll for å åpne datavinduet.
    2. Visualiser dataene som et punktdiagram for langt rød kanal (DDAOG) kontra grønn kanal (AF).
    3. Tegn en port ved hjelp av rektangelgatingverktøyet for å inkludere <5 % av cellene som er DDAOG+ og AF+ (kvadrant øverst til høyre). Gi porten navnet senescent.
    4. Deretter, fra eksempeloppsettvinduet, drar du senescentporten til de levedyktige delmengdene av de andre celleprøvene for å bruke porten jevnt.
    5. Inn i layoutvinduet drar og slipper du alle levedyktige celleundergrupper inngjerdet i seksjon 7.4. Visualiser alle levedyktige prøver som langt røde (f.eks. APC-A) versus grønne kanalplott (f.eks. FITC-A).
    6. Sørg for at senescentporten som er tegnet i trinn 7.5.3 er synlig på alle tomter, og at porten for kjøretøyets eneste kontroll viser ≤5% -10% senescentceller.
  6. Når prosentandelen av senescentceller er bestemt ved hjelp av trinnene ovenfor, presenterer du de resulterende dataene ved hjelp av FlowJo-plottene, oppsummert i en datatabell og / eller statistisk analysert ved hjelp av standard programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere eksperimenter ble utført for å demonstrere sammenlignbarheten av DDAOG til X-Gal og C12-FDG for påvisning av senescens av SA-β-Gal. Først ble X-Gal brukt til å farge senescent B16-F10 melanomceller indusert av ETO (figur 2A). En intens blå farge utviklet seg i en delmengde av ETO-behandlede celler, mens andre celler viste mindre intens blå farging. Morfologi ble forstørret i de fleste ETO-behandlede celler. Farging av ETO-behandlede celler med fluorescerende SA-β-Gal-substrat C12-FDG (grønn) eller DDAOG (langt rød) viste sammenlignbare fargemønstre og intensitetsvariasjoner med X-Gal (figur 2B). Imidlertid overlappet grønn C 12-FDG-utslipp med cellulær AF (figur 2C), som er kjent for å akkumulere i senescentceller17. I motsetning til dette var AF ubetydelig i det langt røde utslippsområdet for DDAOG.

I stedet for å bruke et fluorescensmikroskop for å score og telle senescentceller, var det mer hensiktsmessig å dra nytte av de høye gjennomstrømningsegenskapene til et flowcytometer for å skaffe data for tusenvis av celler per prøve på kort tid (<5 min per prøve). Først ble en rekke standard oppsettparametere for flowcytometri implementert for å sikre optimal datainnsamling (figur 3). Etter en typisk tilnærming ble lysspredningsparametere satt for å visualisere volumet (fremoverspredning, FSC) og granulariteten (sidespredning, SSC) av celler (figur 3A). Her noterte vi trenden med økt volum av ETO-behandlede celler, som var enige med den forstørrede morfologien som vanligvis observeres for senescentceller ved hjelp av mikroskopi. En reduksjon i standard innstillinger for skalering av områder (til 0,33-0,50 enheter avhengig av celletype og behandling) var nødvendig for å visualisere flere av de større cellene på plottet. For noen cellelinjer/behandlinger var økt granularitet (SSC) også tydelig (data ikke vist). Samlet sett ble spredningsevaluering brukt som et kvalitetskontrolltrinn for å verifisere at cellespredningsdata dukket opp som forventet, overdreven celleavfall var ikke til stede, og celler ble behandlet gjennom cytometeret ved passende strømningshastigheter (~ 100-1000 celler / s). Som et kvalitetskontrolltrinn som bare brukes til instrumentoppsett, ble det ikke utført gating eller analyse her.

Et annet (valgfritt) trinn i flowcytometrioppsettet var å kort analysere en prøve av kommersielt tilgjengelige "regnbue" kalibreringspartikler for å sikre at de fluorescerende deteksjonsspenningene ble satt i akseptable områder (figur 3B). Den lyseste toppen ble satt mellom 1 × 104 enheter og 1 × 105 enheter relativ fluorescerende intensitet i hver kanal, med klart definerte topper med lavere intensitet, tilstrekkelig skille mellom hver topp og ingen overlapping av nabotopper. En kontrollprøve på 10 000 mikrosfærer ble registrert ved hjelp av disse spenningsinnstillingene. Mikrosfærene ble deretter brukt på denne måten i hver cytometriøkt for å forbedre ensartetheten av datainnsamling i løpet av protokollen.

Deretter ble prøver av kjøretøy-bare eller ETO-behandlede celler visualisert i hver fluorescerende kanal, og portene ble satt. Cellens levedyktighetsporter ble satt basert på signalet om CV450 levedyktighetsflekk i den fiolette kanalen (figur 3C). Kun kjøretøybehandlede celler viste 88% levedyktighet, og ETO-behandlede celler viste 75% levedyktighet (i den endelige celleprøven ble ytterligere døde celler sannsynligvis først fjernet i kasserte kulturmedier og mekanisk oppløst under fargeprosessen). Deretter ble levedyktige inngjerdede celler visualisert i de grønne (figur 3D) og langt røde (figur 3E) utslippskanalene. Porter for grønn AF HI og langt rød DDAOGHI ble satt til <5% av kjøretøy-bare celler, og disse portene ble deretter brukt på ETO-behandlede celler. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble det fastslått at 46% av ETO-behandlede celler var AF HI og 33% var DDAOGHI; Disse verdiene var i det forventede området basert på litteratur og fra resultater fra mange replikasjonseksperimenter i vårt laboratorium. Når cytometeroppsettet var fullført, ble alle celleprøver i forsøket kjørt ved hjelp av identiske datainnsamlingsinnstillinger. Data for 10 000 hendelser per prøve ble innhentet.

Representative analysedata er vist i figur 4. B16-F10 murine melanomceller eller A549 humane lungeadenokarsinomceller ble brukt som kreftcellelinjemodeller. Hver cellelinje ble behandlet med et kjemoterapimiddel kjent for å indusere senescens (ETO eller BLM) i 4 dager for å indusere senescens eller kun kjøretøy. Videre ble det kjente senolytiske middelet ABT-26321 tilsatt induserte senescentceller i 2 dager for å demonstrere spesifisiteten til DDAOG-sonden. ABT-263 bare prøver ble utarbeidet som tilleggskontroller. Her visualiseres data som 2D-punktplott med DDAOG (670 nm utslipp) versus AF (525 nm). Arbeidsflyten fra figur 3 ble brukt til cytometeroppsett, og en TIS-port ble satt slik at <5% av kjøretøycellene scoret som TIS. Resultater ved bruk av B16-F10-celler (figur 4A) viste at ETO induserte TIS i 35% av levedyktige B16-F10-celler (lik de sammenlignbare dataene vist i figur 2D, E) og det senolytiske middelet eliminerte nesten helt TIS-celler (<2%). I A549-celler (figur 4B) induserte BLM TIS i 66% av levedyktige celler, og ABT-263 reduserte prosentandelen til 15%. ABT-263 alene var ikke giftig for ubehandlede, prolifererende celler.

Vi hadde videre som mål å demonstrere at fluorescerende antistofffarging var kompatibel med DDAOG senescence assay for å lette screeningen av TIS-assosierte eller nye overflatemarkører. Her ble B16-F10 mus melanomceller igjen behandlet med TIS-induserende ETO (eller kjøretøy) i 4 dager. Deretter ble celler både farget med DDAOG for å evaluere TIS og med et fluorescerende antistoff for å oppdage den TIS-assosierte overflatemarkøren DPP422 (figur 5). Det ble brukt anti-DPP4 konjugert til R-phycoerythrin (PE), og vi bekreftet ubetydelig overlapp av LE med DDAOG og AF på flowcytometeret som ble brukt (supplerende figur S2). Et histogram av PE-kanaldata (figur 5A) for >5000 levedyktige celler viste at 42% av ETO-behandlede celler var DPP4 + (ved bruk av kjøretøyprøven for å sette positivitetsporten). Visualisering av 2D-punktplott for de samme prøvene (figur 5B, C) indikerte at 44% av ETO-behandlede celler var dobbeltpositive for DDAOG (dvs. senescent) og DPP4 mot 4% av kjøretøy-bare celler. Disse dataene viser at levende cellefarging med overflatemarkørantistoffer er mulig i kombinasjon med DDAOG-senescensanalysen.

Potensielle bekymringer med enhver levende cellefargingsmetode inkluderer celledød som oppstår under lange analyseøkter (>1 time) og hvordan man mest effektivt kan flekke og analysere prøver på tvers av mange forskjellige tidspunkter (opptil dager fra hverandre). Løsemiddelbasert fiksering av fargede celler adresserer begge disse bekymringene, da prøver kan fikses så snart de er farget og deretter lagret i kjøleskapet til analyse i en temperaturstabil batch. Dermed testet vi om levende celler farget med DDAOG kunne fikses med 100% metanol eller 4% paraformaldehyd (PFA) og lagres i opptil 1 uke ved 4 ° C. Uønsket reduserte metanolfiksering DDAOG-signalet og reduserte AF betydelig (data ikke vist); Derfor bør bruk av metanol som fikseringsmiddel unngås. Fiksering med PFA var imidlertid mye mer vellykket, som vist i figur 6 for celler festet i 4% PFA i 10 minutter etter farging med DDAOG. Sammenlignet med ufikserte kontrollprøver (figur 6A; ubehandlet, 5% og BLM, 67% DDAOGHI AF HI), viste faste prøver (figur 6B) litt høyere bakgrunn i ubehandlede celler (9%) og også en høyere prosentandel av celler som scoret som senescent i BLM-behandlede celler (80%). Denne effekten ble også sett i faste prøver lagret over natten (figur 6C; ubehandlet, 12% og BLM, 72%) og lagret i 1 uke ved 4 ° C (figur 6D; 14% og 70%). Til tross for den svake økningen i fluorescens forårsaket av PFA-fiksering, var induksjonen av senescens ved BLM fortsatt tydelig i alle faste prøver versus den matchede ubehandlede prøven. Videre forble cellene intakte i lagring med bare liten forverring innen dag 7, og ingen problematisk aggregering ble observert. Vi konkluderer med at bekvemmeligheten av å kunne fikse og lagre celleprøver for senere batched analyse vil rettferdiggjøre å tolerere den litt høyere bakgrunnen forårsaket av PFA-fiksering, spesielt i eksperimenter med mange prøver eller tidspunkter.

En vanlig utfordring i cellebasert senescensforskning er den heterogene utbruddet av senescens i cellepopulasjoner. Her viser vi at DDAOG kan brukes til FACS av levedyktige senescentceller og at innsamlede celler overlever i kultur for nedstrøms in vitro-analyser (figur 7). For å sortere celler etter FACS blir celler behandlet og farget, som beskrevet, og sortert etter et FACS-kompatibelt flowcytometer ved hjelp av DDAOG versus AF-gatingstrategien vist her (figur 7A). Siden en levedyktighetssonde ikke brukes her på grunn av langsiktige toksisitetsproblemer, anbefaler vi strenge spredningsgating som skal utføres før den endelige senescentcellegatingen (supplerende figur S3) for å eliminere falskt positivt rusk fra de innsamlede cellene. Dette er standard FACS gating prosedyrer som bør være kjent for en moderat erfaren bruker og kan raskt etableres ved hjelp av programvare på instrumentet (<10 min).

Etter å ha sortert en prøve av BLM-behandlede A549-celler, returnerte vi cellene til dyrking i standard multiwell-retter i 5 dager (n = 6 replikasjoner) ved 10 × 103 celler / cm2. Usorterte kontroller ble belagt med samme tetthet, vokst ved siden av, og ubehandlede og BLM-behandlede celler ble inkludert. Celler ble observert daglig; For sorterte celler ble det ikke observert signifikant celledød eller tilbakevending til proliferasjon. Sorterte celler forble sparsomme (dvs. ikke prolifererte) i løpet av 5 dager i kultur, mens ubehandlede og BLM-behandlede celler ble sammenflytende som vist. På dag 5 ble cellene fikset i PFA og farget for morfologi og proliferasjonsmarkører (figur 7B). Den karakteristiske forstørrede morfologien til sorterte celler ble avslørt ved fluorescerende Phalloidin-farging av filamentøst aktin, med DAPI-farging for å vise forstørrede kjerner. Sorterte celler var svært store i diameter (>10 μm) med et karakteristisk avrundet utseende. Som forventet viste Ki67 antistofffarging et fullstendig tap av proliferasjonsmarkøren i den sorterte prøven versus et delvis tap i den usorterte BLM-behandlede prøven, og normale nivåer av Ki67 ble sett i mange celler i den ubehandlede usorterte prøven. Minst tre bilder ble tatt per brønn ved hjelp av ensartede bildeinnstillinger på tvers av prøver. Representative bilder er vist (figur 7B).

Til slutt vurderte vi om senescentceller som oppstår i svulster etablert hos mus behandlet med kjemoterapeutiske legemidler, kunne identifiseres ved hjelp av DDAOG. B16-F10 melanomtumorer ble indusert i flanken av C57/BL6 mus, som deretter ble behandlet tre ganger (dvs. hver 5. dag) med kun saltvann (figur 8A), DOX (figur 8B) eller PLD (figur 8C). Etter den tredje behandlingen gjenopprettet musene i 7 dager for å tillate utbruddet av senescens og ble deretter ofret og svulster skåret ut. Svulstene ble halvert, halvparten ble brukt til å klargjøre frosne vevsglass for X-Gal-farging (figur 8) og halvparten dissosiert i encellede suspensjoner og farget med DDAOG (figur 8 og supplerende figur S4). X-Gal-farging i vev var ganske svak til tross for lang fargingsvarighet (72 timer), men blå farging var tydelig i DOX- og PLD-svulster ved nøye inspeksjon, spesielt i svulster som også scoret positivt for aldring ved DDAOG-strømningsanalyse (figur 8B, C). Minst tre bilder ble tatt per vevslysbilde og representative bilder vises.

Sammenlignet med X-Gal var DDAOG en mer sensitiv og nøyaktig måte å kvantifisere senescens i svulster på (figur 8). For DDAOG-tumoranalyse ble den saltvannsbehandlede svulsten med høyest fluorescensbakgrunn brukt til å sette senescensporten til <5%, slik at de andre saltvannsbehandlede svulstene ikke scoret over 5% senescence. Denne senescensporten ble deretter batch-anvendt på inngjerdede levedyktige celler fra alle svulster. Begge kjemoterapi agenter indusert senescence i noen svulster (to av fem svulster for DOX, tre av fem for PLD), med prosentandeler av senescent tumorceller varierende fra 3% til 36% per tumor. Cytometridataplott for alle 15 svulster er vist i supplerende figur S4, og et sammendrag av tumorcytometridata er vist i figur 8D (n = 5; (*) p < 0,05 vs. saltvannskontrollgruppe ved F-varianstesten). Vi konkluderer med at DDAOG versus AF flowcytometri er en akseptabel metode for screening av svulster og kjemoterapimidler for induksjon av senescens in vivo.

Figure 2
Figur 2: DDAOG er en sensitiv og spesifikk flekk for SA-β-Gal. (A) Konvensjonell farging for SA-β-Gal ved bruk av X-Gal som viser ubehandlede (venstre) eller ETO-behandlede (høyre) B16-F10 murine melanomceller. Senescence indusert av ETO: celler utviser forstørret morfologi og blå farging på grunn av spaltning av X-Gal ved forhøyet SA-β-Gal. Skalastenger = 10 μm. (B) Fluorescerende farging for SA-β-Gal i ETO-behandlede celler ved bruk av enten C12-FDG (515 nm utslipp, grønn) eller DDAOG (660 nm, rød). Fargingsfordelingen er lik for begge sondene, noe som indikerer at DDAOG oppdager SA-β-Gal på samme måte som C12-FDG. (C) Evaluering av AF i ufargede, ETO-behandlede celler i enten den grønne (525 nm utslipp, venstre) eller langt røde (660 nm, høyre) utslippskanalen. AF fra lipofuscin er høy i den grønne utslippskanalen og ubetydelig i den røde kanalen. Eksponeringstid = 2 000 ms for hvert bilde. Skala barer = 10 μm. Denne figuren er gjengitt fra Flor og Kron23. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; X-Gal = 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid; UNT = ubehandlet; ETO = etoposid; AF = autofluorescens; C12-FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside; SA-β-Gal = senescence-assosiert beta-galaktosidase. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oppsett av datainnsamling for flowcytometer. (A) Representativ spredningsplottfordeling av celler. FSC-A er en avlesning av cellevolum, og SSC-A indikerer cellulær granularitet. Venstre panel, kun kjøretøybehandling av A549-celler. Høyre panel, ETO behandling for å indusere senescence. Legg merke til trenden mot forstørret cellevolum av ETO-behandlede celler, i samsvar med den forstørrede morfologien som fremgår av mikroskopi. (B) Valgfri bruk av 5-topp kommersielle "rainbow" fluorescerende kalibreringsmikrosfærer for å stille inn detektorspenninger til cytometeret. I hver fluorescenskanal som brukes, bør den maksimale toppen settes ≤1 x 105 relative fluorescerende enheter ved å justere cytometerdetektorspenningen mens prøvene kjører. Venstre panel, BV421 (fiolett) kanal; senter, FITC (grønn) kanal; høyre, APC (rød) kanal. De fem fluorescerende toppene skal vise tydelig avstand som vist. (CE) Representative enkanals fluorescensdata for (C) levedyktighetsfarging ved bruk av fiolett CV450 fargestoff; (D) grønn autofluorescens av celler; (E) langt rødt signal fra DDAOG, som oppdager SA-β-Gal. Mørkere fargehistogram, kun kjøretøybehandling; lysere fargehistogram, ETO-behandling. Foreldreporter er angitt over hver tomt. Forkortelser: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = side scatter-peak område; ETO = etoposid; BV421-A = Strålende fiolett 421 kanaltoppområde; FITC-A = fluorescein isotiocyanat kanal toppområde; APC-A = allophycocyanin kanal toppområde; AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; VEH = kjøretøy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative data for senescensanalyse av flowcytometri . (A) B16-F10 murine melanomceller behandlet med (øverst til venstre) kjøretøy, (øverst til høyre) ETO, (nederst til venstre) ABT-263 (1 μM) bare, eller (nederst til høyre) ETO pluss ABT-263. (B) A549 humane lungeadenokarsinomceller behandlet med (øverst til venstre) kjøretøy, (øverst til høyre) BLM, (nederst til venstre) ABT-263 bare, eller (nederst til høyre) BLM pluss ABT-263. (A,B) Rektangulære porter i øvre høyre kvadranter av alle tomter definerer senescentceller (DDAOGHI AF HI). Prosentandelen av senescentceller (av totalt levedyktige celler per prøve) er angitt på hver tomt. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposid; BLM = bleomycin; VEH = kjøretøy; TIS = terapi-indusert senescence. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Samfarging av en eksempelcelleoverflatemarkør med senescensanalyse. (A) Immundeteksjon av senescensmarkør DPP4 på overflaten av levedyktige B16-F10 dyrkede celler; mørk oransje, bare kjøretøy; lys oransje, ETO. (B,C) Senter og høyre paneler: celler co-farget med DDAOG og anti-DPP4: PE. DDAOGHI DPP4HI-celler er inneholdt i rektangulære porter vist på tomtene, og prosentandelen av dobbeltpositive celler per prøve er indikert. Vist: levedyktige inngjerdede celler. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposid; VEH = kjøretøy; DPP4 = dipeptidylpeptidase 4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Poststainingfiksering og lagring av DDAOG-fargede celleprøver for senere analyse. (A) Kontroll, ufikserte prøver av levende A549-celler enten ubehandlet (venstre) eller behandlet med BLM (høyre) for å indusere aldring, og deretter farget og umiddelbart analysert ved hjelp av DDAOG-protokollen (uten fiksering, dag 0). (B) Prøver fremstilt som i (A) og deretter umiddelbart festet i 4% paraformaldehyd og analysert (dag 0). (C) Prøver tilberedt som i (A), umiddelbart festet i 4% paraformaldehyd, og lagret over natten ved 4 ° C før analyse. (D) Prøver tilberedt som i (A), umiddelbart fikset og lagret i 7 dager før analysen. Rektangulære porter i øvre høyre kvadranter av alle tomter definerer senescentceller (DDAOGHI AF HI). Prosentandelen av senescentceller er angitt på hver tomt. Forkortelser: TIS = terapi-indusert senescence; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomycin; AF = autofluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Flowcytometrisk sortering og validering av berikede senescentcellepopulasjoner . (A) Flowcytometriske sorteringsdata som viser (venstre) den ubehandlede, DDAOG-fargede kontrollen som ble brukt til å sette porten for senescentcellesortering (<5% senescentceller i inngjerdet region) og (høyre) den BLM-behandlede, DDAOG-fargede prøven som ble sortert ved hjelp av sortersporten som vist. (B) Fluorescensmikroskopibilder for (venstre kolonne) celler farget med Phalloidin-Alexa Fluor 647 (oransje pseudocolor) for å oppdage F-aktin og DAPI (blå) for å motvirke kjerner, demonstrere forstørret morfologi av senescentceller, eller (høyre kolonne) celler farget med kanin Ki67 antistoff og anti-kanin Alexa Fluor 594 for å oppdage tap av spredning i senescentceller. Øverste rad, ubehandlede og usorterte celler. Midterste rad, BLM-behandlede og usorterte celler. Nedre rad, BLM-behandlede og sorterte celler. Skala barer = 10 μm. Forkortelser: TIS = terapi-indusert senescence; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomycin; UNT = ubehandlet; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Kvantifisering av senescens i svulster fra mus behandlet med cellegift. B16-F10 melanomtumorer ble etablert i flankene til C67BL / 6 mus, som deretter ble behandlet med tre doser (A) saltvann, (B) DOX eller (C) PLD hver 5. dag pluss 1 uke for å tillate utbruddet av senescens. Svulster ble skåret ut og halvert; frosne vevsskred ble klargjort fra den ene halvdelen for X-Gal-farging (øverste rad), og den andre halvparten ble dissosiert for DDAOG-farging (nedre rad). I X-Gal-fargede bilder er blå celler SA-β-Gal HI senescentceller, mens brune regioner skyldes melanin i svulster. Representative resultater er vist for DOX og PLD fra to svulster per gruppe som viste senescence. Alle saltvannssvulster viste ubetydelig senescence. (D) Kvantifisering av senescens i legemiddelbehandlede svulster fra mus. (*) p < 0,05 ved F varianstest, n = 5 mus per gruppe. Feilfelt, gjennomsnitt ± SEM. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doksorubicin; PLD = PEGylated liposomal doxorubicin; X-Gal = 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid; AF = autofluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Kjemisk struktur av DDAOG-sonden. DDAOG er et konjugat av 7-hydroksy-9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en) og beta-galaktosid. Når spaltet av beta-galaktosidase, viser det hydrolyserte spaltningsproduktet en 50 nm langt rød fluorescensforskyvning, noe som muliggjør spesifikk deteksjon med eksitasjon over 600 nm. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Spektral skanning av DDAOG crosstalk med andre fluorescerende kanaler i flowcytometeret. For å identifisere tilgjengelige kanaler for påvisning av fluorescerende antistoffer, ble en spektral skanning utført på et 4-laser, 15-kanals flowcytometer ved bruk av A549-celler behandlet med BLM og farget med DDAOG (rød) eller ufarget (svart). Data i hver kanal i flowcytometeret ble samlet inn for 10 000 celler. (A) Utslippskanaler for 405 nm laser: fra venstre til høyre, BV421, BV510, BV605, BV660 og BV711. Crosstalk observert i kanalene BV605, BV660 og BV711 gjør dem uegnet til samfarging med DDAOG uten kompensasjon. BV421 og BV510 er egnet for samfarging (merk at BV421 vanligvis brukes til farging av levedyktighet). (B) Utslippskanaler for 488 nm laser: FITC og PerCP-Cy5. Høy crosstalk ble observert for PerCP-Cy5-kanalen. FITC er egnet for co-farging; Vær imidlertid oppmerksom på at FITC-kanalen vanligvis brukes i DDAOG-analysen for evaluering av grønn utslipps-AF. (C) Utslippskanaler for 561 nm laser: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 og PE-Cy7. PE- og PE-Dazzle 594-kanalene er egnet for påvisning av antistoffer merket med disse fluoroforene (PE er demonstrert for påvisning av DPP4 i denne studien). (D) Utslippskanaler for 640 nm laser: APC, APC-H700 og APC-Cy7. DDAOG-signalet til senescentcellene er synlig i APC-kanalen (47,8% senescent). Signalet overlapper hverandre i APC-H700- og APC-Cy7-kanalene, noe som gjør dem uegnet for farging uten betydelig spektralkompensasjon. Forkortelser: BLM = bleomycin; BV = Strålende fiolett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PerCP = peridinin-klorofyllprotein; PE = phycoerythrin; DZ594 = Blend 594; APC = allophyocyanin; AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Cell gating strategi for FACS sortering av senescent celler. Å sende en suspensjon av celler gjennom et følsomt FACS-cytometer kan kreve ekstra gating for å sikre renheten av sortering og optimal instrumentfunksjonalitet. Et eksempel strategi er vist her. Andre strategier er mulige avhengig av produsentens anbefalinger for FACS-cytometeret som brukes. Venstre kolonne, kjøretøy-bare behandlet cellekontroll. Høyre kolonne, A549-celler behandlet med BLM for å indusere senescens som skal sorteres. (A) FSC-A (cellevolum) versus SSC-A (cellegranularitet) gating av intakte celler. Den intakte porten eliminerer celleavfall fra den sorterte prøven. (B) FSC-A versus FSC-H renhet gating; fjerner dubletter og rusk. (C) SSC-A versus SSC-H renhet gating; fjerner dubletter og rusk. (D) Gating for befolkningen av interesse ved bruk av APC-A-kanalen (637 nm eksitasjon, 670 nm ± 30 nm utslipp, brukt til DDAOG) versus FITC-A-kanal (488 nm eksitasjon, 530 nm ± 30 nm utslipp, brukt til AF); fjerner mulige fargeartefakter. (E) Senescent celle gating for endelig sortering. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; BLM = bleomycin; FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; SSC-H = side scatter-peak høyde. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: DDAOG senescence flow cytometry farging av svulster. Flowcytometridata for ≥50 000 levedyktige tumorceller. Senescent celleport, øvre høyre kvadrant av hvert plott. Prosentandelen av senescent (av levedyktige) tumorceller er vist innenfor porten. Tumorbehandlinger inkluderte (A) bare saltvann; (B) DOX; og (C) PLD. Mus ble behandlet tre ganger, en gang hver 5. dag, med 7 dager for utvinning for å tillate utbruddet av senescens før offer. Fem svulster per tilstand ble analysert. Forkortelser: AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doksorubicin; PLD = PEGylated liposomal doksorubicin. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I løpet av det siste tiåret eller så har flowcytometri blitt en mer vanlig analyseplattform i kreftforskning på grunn av den fremvoksende populariteten til tumorimmunologi, utvikling av billigere flowcytometre og forbedring av delte instrumenteringsfasiliteter ved akademiske institusjoner. Flerfargede analyser er nå standard, da de fleste nyere instrumenter er utstyrt med fiolette, blågrønne og røde til langt røde optiske arrays. Dermed vil denne DDAOG-protokollen sannsynligvis være kompatibel med et bredt spekter av flowcytometre. Selvfølgelig bør ethvert flowcytometer evalueres av brukeren. Spesiell forsiktighet bør utvises når ytterligere fluoroforer (f.eks. fluorescerende, konjugerte antistoffer) tilføres DDAOG-analysen. En evaluering av fluorofor krysstale mellom kanaler bør utføres ved hjelp av enkeltfargede kontroller visualisert i alle andre relevante kanaler. Hvis overlapping observeres, kan spektral kompensasjon utføres20 for korreksjon etter typiske metoder.

Funnene som vises her, er først og fremst ment å demonstrere at DDAOG flowcytometrianalysen kan gi raske, kvantitative, letttolkede resultater for TIS indusert av kjemoterapimedisiner i celler eller svulster. Midlene som brukes her, inkludert ETO 23,24, DOX 7,25 og BLM 26,27, er dokumentert å indusere TIS i forskjellige kreftcellelinjer 24. For å demonstrere spesifisiteten til DDAOG-sonden ble det kjente senolytiske middelet ABT-26321 vist å selektivt eliminere senescentceller i kultur. Dette papiret demonstrerer bruken av en murine (B16-F10) og en human (A549) dyrket kreftcellelinje, samt B16-F10-svulster etablert hos mus. Imidlertid kan alle celler som uttrykker β-Gal og beholder levedyktighet gjennom en standard flowcytometriprøvepreparering, brukes. Visse celletyper kan være mer skjøre eller mindre utsatt for TIS, og dette bør evalueres før du begynner på en stor skjerm eller studie. Hvis celler oppløses i forberedelse, levedyktigheten er dårlig, eller TIS er mye lavere enn forventet ved bruk av positive agentkontroller, kan celletypen ikke være en ideell modell for studier av senescens. Midlene og cellelinjene vist her kan brukes av andre grupper som kontroller i videre screening av potensielle TIS-induserende midler eller nye senolytika, som fortsatt er et aktivt mål i feltet.

Toksisitet indusert av kjemoterapi narkotika kan variere på tvers av celletyper og påvirke analysen resultater. Hvis den primære observerte effekten av midlet og/eller konsentrasjonen som brukes er akutt celledød, kan den generelle senescence være minimal. In vivo skal høy tumornekrose eller systemisk toksisitet hos dyr unngås ved å senke agentdosen. Nøkkelen til analysesuksess er testing av en rekke agentkonsentrasjoner, med nøye inspeksjon av levedyktighetsanalysedata (f.eks. som angitt av CV450 i DDAOG-analysen). In vitro, hvis mange døde celler løsner fra platen under behandlingen, inkludert kulturmediet i den analyserte prøven, er det viktig å evaluere celledød totalt. CV450 er ikke den eneste levedyktighetsflekken som er kompatibel med denne analysen; Andre fiolette/blå emitterende fluoroforer kan benyttes. Fikserbare levedyktighetssonder kan også brukes hvis brukeren planlegger å fikse de fargede prøvene med PFA, forutsatt at sondefluorescensen ikke overlapper signifikant med DDAOG eller AF (eller brukeren utfører spektral kompensasjon for å korrigere for overlapping). I noen tilfeller der agenttoksisiteten er lav og cellene er robuste, kan gating intakte celler ved lysspredning (FSC vs. SSC) være tilstrekkelig til å isolere "levedyktige" celler for analyse.

Et viktig trinn i denne in vitro-protokollen er å plate celler i det nedre området av log vekst tetthet (typisk 2 × 10 3-5 × 103 celler / cm 2) for å tillate rask innledende spredning, noe som letter opptaket av kjemoterapi stoffet av de fleste celler. Når det er behandlet, er det også viktig å gi tid til utbruddet av TIS: in vitro, 4 dager ± 1 dag i nærvær av legemidlet; in vivo, 7 dager med restitusjon etter siste kjemoterapibehandling. Etter farging med DDAOG som beskrevet, bør kvantitativ analyse av cytometriske data utføres som vist, dvs. gating DDAOG versus AF-celler i hver prøve for å bestemme prosentandelen av senescentceller (av totalt levedyktig). Valgfrie trinn inkluderer bruk av fluorescerende "regnbue" kalibreringsmikrosfærer for å standardisere flowcytometri, PFA-fiksering av fargede prøver, co-immunostaining for overflatemarkører og strømningssortering for å berike senescentceller for nedstrøms analyser. Hvert av disse valgfrie trinnene gir imidlertid viktige fordeler i visse applikasjoner. Kalibreringsmikrosfærene standardiserer cytometrioppsettet over flere økter og lar brukeren i utgangspunktet stille spenninger i et nyttig område for aldring og levedyktighetsdeteksjon, med minimale justeringer deretter. PFA-fiksering av prøver stabiliserer cellene og tillater batchanalyse av store sett med celler på et senere tidspunkt. Co-immunostaining for overflatemarkører kan brukes til å skjerme for nye senescence-relaterte proteiner og immuninteraksjoner. I fremtidige studier planlegger vi å validere co-farging av intracellulære senescensmarkører med DDAOG.

Sortering av TIS-celler etter FACS muliggjør anrikning av levedyktige TIS-celler fra heterogene populasjoner, noe som kan forvirre avlesninger for nedstrømsanalyser som vestlig blotting, proteomikk eller transkriptomikk. Etter sortering ble det ikke observert noen signifikant toksisitet av DDAOG i TIS-celler plassert tilbake i kultur i opptil 5 dager. Det bør imidlertid tas i betraktning at sorterte celler har blitt behandlet med Baf, internalisert DDAOG (som spaltes av SA-β-Gal til DDAO, et akridinfargestoff), og blitt utsatt for mekanisk stress som passerer gjennom FACS-instrumentet. Derfor kan visse biologiske endringer som ikke er relatert til senescens, være tilstede i de sorterte cellene. I denne studien beholdt imidlertid de sorterte cellene sterke trekk ved senescens og ga karakteristiske proteomikk- og transkriptomikkresultater28 sammenlignet med usorterte kontroller. Til tross for den noe åpenbare nytten av å bruke FACS til å samle inn og analysere senescentceller fra svulster, har denne prosedyren sjelden blitt brukt i litteraturen. Noen grupper har brukt p16Ink4a luciferase eller fluorescerende reportere for å identifisere senescentceller i musevev, med fluorescerende reportere som muliggjør FACS-sortering i noen studier29,30. Funnene er generelt enige om at, uavhengig av induksjonsmiddel eller tumortype, er TIS i svulster en delvis til sjelden forekomst, og når sjelden 100% av tumorceller31. FACS-sortering av celler ved hjelp av DDAOG-metoden tillater lett innsamling av sjeldne TIS-celler fra svulster, uten behov for å uttrykke transgene konstruksjoner.

For tiden utføres mest senescensforskning i musemodeller ex vivo ved hjelp av en kombinasjon av X-Gal og immunhistokjemi markører32,33. Likevel kan vurdering av TIS ex vivo ved hjelp av tumorvev være en langvarig prosess, spesielt når X-Gal brukes. Denne prosedyren krever tumor cryopreservering, cryosectioning på lysbilder, X-Gal farging, dekke glass montering, tørking, bildebehandling, og scoring "blå" celler-en multi-dagers tilnærming på minimum. Immunhistokjemi er ikke mye raskere eller enklere, og forskjellige vevsseksjoner må brukes og scores for hver markør pluss X-Gal i hver svulst, med mindre multipleksanalysen er optimalisert, og legger til mer tid på forsiden av prosessen. Vevsseksjoner prøver bare ett tynt tverrsnitt av svulsten, mens senescentceller (som mange celletyper) kan fordeles ujevnt i 3D-rom gjennom svulster29. Det er presserende behov i feltet for å bevege seg bort fra langsomme, utdaterte histologimetoder mot en raskere og lett kvantifiserbar senescence analyse for svulster. Ved bruk av DDAOG-flowcytometri kan et sett med 15 svulster dissosieres og farges for å oppnå avgjørende, kvantitative senescencedata på mindre enn 1 dags praktisk tid etter tumorhøsting. Den ene halvdelen av svulsten ble behandlet for hver prøve, noe som forbedret prøvetakingen av 3D-plass per svulst. Denne DDAOG flowcytometritilnærmingen er betydelig raskere og mer pålitelig enn vevsglidebaserte metoder for evaluering av TIS i svulster.

Med sine mange fordeler i forhold til X-Gal og andre metoder, tar vi til orde for at DDAOG-protokollen skal bli den nye gullstandardanalysen. Den bruker både den konvensjonelt aksepterte senescensmarkøren, SA-β-Gal, og etikettfri deteksjon av aldersassosiert AF som en andre markør. Disse fluoroforene er kompatible med de fleste standard flowcytometre. Analysen inkluderer en levedyktighetsflekk for å utelukke døde celler og rusk ved hjelp av prøver som lett oppnås fra legemiddelbehandlede dyrkede cellelinjer eller svulster. Levende celleprøver kan eventuelt fikses eller kryopreserveres for å lette batchanalysen av store studier, for eksempel ved å bruke tidspunkter for å evaluere utbruddet av TIS over tid ved hjelp av flere midler Fargeprosessen tar mindre enn en halv dag med laboratoriearbeid å fullføre, og datainnsamlingen er vanligvis < 5 minutter per prøve. Dataanalyse er tilsvarende rask og grei, og produserer kvantitative data om prosentandelen av TIS-celler per prøve uten kjedelig cellescoring og telling. Prøver kan FACS-sorteres for å gjenopprette berikede populasjoner av TIS-celler, noe som reduserer støy fra cellulær heterogenitet i nedstrømsanalyser. Vi tror at DDAOG-analysen i mange tilfeller kan erstatte X-Gal, noe som letter screeningen av TIS-induserende midler og senolytika in vitro og in vivo, noe som fører til raskere og mer pålitelige funn innen senescensforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi for denne studien.

Acknowledgments

Vi takker kjernefasiliteten for cytometri og antistoffer ved University of Chicago for støtte til instrumentering av flowcytometri. Animal Research Center ved University of Chicago ga dyreboliger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Tags

Kreftforskning utgave 187 Senescence kreft kjemoterapi flowcytometri fluorescerende sonde multipleks
Far-Red Fluorescerende Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for identifisering og anrikning av Senescent tumorceller ved flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter