Summary
Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.
Abstract
Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis, ist eine hochinvasive und anpassungsfähige Schädlingsart, die Zitrusfrüchte und über 150 andere Obstkulturen weltweit schädigt. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und Weibchen ihre Eier unter die Schalen von Früchten legen, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld normalerweise schlecht ab. Mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie versuchen viele Wissenschaftler, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien zu entwickeln. Dazu gehören RNAi- oder Gen-Editing-basierte Pestizide, die Gene (molekulare Ziele), wie olfaktorische Gene, die am Suchverhalten beteiligt sind, in verschiedenen Insektenschädlingen herunterregulieren oder zum Schweigen bringen. Um diese Strategien für die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich. Gene mit kritischen Funktionen beim Überleben und der Fortpflanzung von B. dorsalis dienen als gute molekulare Ziele für Gen-Knockdown und/oder Silencing. Das CRISPR/Cas9-System ist eine zuverlässige Technik zur Genbearbeitung, insbesondere bei Insekten. Dieser Artikel stellt eine systematische Methode für die CRISPR/Cas9-Mutagenese von B. dorsalis vor, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Entnahme von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Diese Protokolle dienen als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für Forscher, die an funktionellen Genstudien in B. dorsalis interessiert sind.
Introduction
Die orientalische Fruchtfliege, Bactrocera dorsalis , ist eine kosmopolitische Insektenschädlingsart, die Schäden an über 150 Arten von Obstkulturen verursacht, darunter Guave, Mango, Eugenia spp., Surinam-Kirsche, Zitrusfrüchte, Mispel und Papaya1. Der Schaden allein in der Provinz Guangdong (China) wird auf über 200 Millionen Yuan geschätzt. Erwachsene Weibchen legen ihre Eier unter die Haut reifender oder gereifter Früchte, was zu Verfall und Zerfall der Frucht führt, was die Fruchtqualität und den Gesamtertrag der Ernte verringert2. Da erwachsene Fruchtfliegen eine große Flugkapazität haben und sich ihre Larven in die Fruchthaut bohren, schneiden Insektizide, die direkten Kontakt mit dem Schädling erfordern, auf dem Feld schlecht ab. Darüber hinaus hat der umfangreiche Einsatz von Insektiziden die Resistenz von B. dorsalis gegen verschiedene landwirtschaftliche Chemikalien erhöht, was die Bekämpfung dieser schädlichen Schädlinge noch schwieriger macht3. Daher ist die Entwicklung effektiver und umweltfreundlicher Schädlingsbekämpfungsstrategien dringend erforderlich.
In jüngster Zeit versuchen Wissenschaftler mit der Entwicklung molekularbiologischer Werkzeuge und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien, umweltfreundliche Schädlingsbekämpfungsstrategien wie RNAi zu entwickeln, die auf die Funktionalität wichtiger Gene (molekulare Ziele) verschiedener Schadinsekten abzielen. Gene, die für das Überleben und die Vermehrung des Schädlings entscheidend sind, können durch funktionelle Genstudien identifiziert werden und dienen weiterhin als potenzielle molekulare Ziele für die Verbesserung spezifischer und umweltfreundlicher Schädlingsbekämpfungsinstrumente4. Um solche Strategien an die Bekämpfung orientalischer Fruchtfliegen anzupassen, sind effektive Methoden zur funktionellen Genforschung erforderlich.
Das CRISPR/Cas-Endonuklease-System (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziiert) wurde zunächst in Bakterien und Archaeen entdeckt und erwies sich als adaptiver Mechanismus, der an der Erkennung und dem Abbau von intrazellulärer Fremd-DNA beteiligt ist, wie sie durch die Infektion von Bakteriophagen eingeführt wird5. Im Typ-II-CRISPR-System wird die Cas9-Endonuklease von kleinen assoziierten RNAs (crRNA und tracrRNA) geleitet, um die eindringende DNA 6,7,8 zu spalten und ist zu einem der am häufigsten verwendeten Werkzeuge für die Gen-Editierung geworden 9,10,11,12. Da das CRISPR/Cas9-System mehrere Vorteile hat, wie z.B. eine hohe Effizienz der Gen-Silencing und niedrige Kosten, wurde es bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt, darunter Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 und Bombyx mori16. Bei B. dorsalis wurden Gene, die mit Körperfarbe, Flügeldimorphismus und Geschlechtsbestimmung zusammenhängen, erfolgreich mit CRISPR/Cas917,18,19 ausgeschaltet. Die detaillierten Verfahren zur Anwendung von CRISPR/Cas9 bei diesem Insekt sind jedoch noch unvollständig. Darüber hinaus sind einige Schritte, die von Forschern für die Genbearbeitung von B. dorsalis bereitgestellt wurden, ebenfalls vielfältig und bedürfen einer Standardisierung. Zum Beispiel waren die Formen von Cas9 in den veröffentlichten Referenzen17,18,19 unterschiedlich.
Dieser Artikel bietet eine systematische Methode für die Mutagenese von B. dorsalis unter Verwendung des CRISPR / Cas9-Systems, einschließlich des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Sammlung von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Dieses Protokoll wird Forschern, die an den funktionellen Genstudien an B. dorsalis interessiert sind, als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen dienen.
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Protocol
1. Target-Design und in vitro Synthese von sgRNA
- Vorhersage der Struktur von Zielgenen von Interesse und Bestimmung der Grenzen zwischen Exons und Introns durch bioinformatische Analyse des B. dorsalis-Genoms (hier verwendete Softwareanwendungen sind in der Materialtabelle aufgeführt).
HINWEIS: BLAT20 wurde verwendet, um potenzielle Genorte im Genom zu suchen. Die hochwertigen RNA-seq-Lesevorgänge (Transkriptom) wurden mit Hisat221 an die erworbenen Genloci angepasst. Samtools22 wurde verwendet, um die sortierten BAM-Dateien zu generieren. Die sortierten BAM-Dateien wurden in Stringtie223 eingegeben, um die Assemblierungstranskripte bereitzustellen. Die zusammengesetzten Transkripte und Genloci Informationen wurden von Transdecoder24 kombiniert. Die mit Transdecoder gewonnenen Ergebnisse wurden in IGV-Werkzeugen25 visualisiert und die Grenzen zwischen Exons und Introns konnten bestimmt werden. - Identifizieren Sie die geeigneten Zielregionen innerhalb der Zielgenstelle des Kandidaten. Die Gesamtlänge muss für eine bequemere Sequenzierung weniger als 750 bp betragen (Abbildung 1B). Design spezifischer Primer zur Amplifikation des Zielgebiets aus Wildtyp-genomischer DNA mittels PCR (Abbildung 1B) (Primer: F-Primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-Primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Klonen Sie die PCR-Produkte in einen stumpfen Endvektor 26 und wählen Sie20 einzelne Bakterienkolonien für die Sequenzierung aus, um zu bestimmen, wie konserviert die Zielregion in den Laborinsektenpopulationen ist.
- Eine typische Zielstelle enthält ein Drei-Nukleotid-Sequenzmotiv (NGG oder CCN) und eine 20-bp-Sequenz neben den NGG- oder CCN-Motiven (20 bp-NGG oder CCN-20 bp). Sprengen Sie die Kandidatenzielstellen gegen das B. dorsalis-Genom und stellen Sie sicher, dass die vorhergesagte Effizienz hoch genug und die Off-Targeting-Rate niedrig ist; Mehrere Open-Source-Softwareprogramme können dies automatisch vorhersagen. In diesem Protokoll wird sgRNAcas9-AI27 verwendet, um die optimalen Ziele auszuwählen und zu bewerten. Details zur Verwendung finden Sie im Handbuch für diese Software.
HINWEIS: Mögliche Zielstellen in der Nähe der 5' UTR des Zielgens und 1-2 Gs zu Beginn der 20 bp Sequenz werden bevorzugt. Um eine große Deletion zu erreichen, die durch PCR gefolgt von Agarosegelelektrophorese identifiziert wird, wird empfohlen, zwei Targets28 zu entwerfen, die durch über 100 bp getrennt sind (Abbildung 1C). - Verwenden Sie das kommerziell erhältliche gRNA-Synthesekit, um die entworfene sgRNA zu erzeugen. Führen Sie jeden Schritt gemäß dem Benutzerhandbuch aus. Resuspendieren Sie das gRNA-Produkt in nukleasefreiem Wasser, quantifizieren Sie die Konzentration mit einem UV-Vis-Spektralphotometer und lagern Sie es vor der Verwendung bei -80 °C (die Konzentration der erfolgreich synthetisierten einzelnen gRNA [10 μL] mit dem hier verwendeten Kit beträgt etwa 4000-6000 ng/μL oder sogar noch höher).
HINWEIS: Obwohl die Erzeugung der mutierten Fliegen der erste Schritt für jeden Forscher ist, ist die geeignete Negativkontrolle für nachgeschaltete Experimente / Analysen von entscheidender Bedeutung. Die Generierung dieser Kontrollen zusammen mit den Mutanten spart Forschern Zeit und Mühe. Stellen Sie beispielsweise verschlüsselte sgRNA als Negativkontrolle ein.
2. Embryonenentnahme und -vorbereitung
- B. dorsalis pupae in Plastikkäfige geben. Geben Sie eine Mischung aus Zucker und Hefe (1:1) als Nahrung zusammen mit einer Wasserquelle an, nachdem die Erwachsenen geschlossen haben (Abbildung 2A, B). Die Aufzuchtbedingungen sind 55% relative Luftfeuchtigkeit (rF), 26,5 °C und ein 14:10 L/D-Zyklus (Licht an um sechs Uhr morgens, Licht aus um acht Uhr abends).
- Die meisten Erwachsenen erreichen die Geschlechtsreife 10 Tage nach dem Auftauchen. Stellen Sie eine geeignete Umgebung bereit, um erwachsenen Fliegen zu helfen, sich so weit wie möglich zu paaren. Verwenden Sie idealerweise einen Lichtständer mit einem Licht von 30-50 Lux. Dies kann die Fruchtbarkeit der Weibchen verbessern und somit die Effizienz der Embryonensammlung verbessern.
HINWEIS: Wenn Sie die Erwachsenen (im Alter von 5-6 Tagen nach dem Schlüpfen) in eine schwach beleuchtete Umgebung (<100 Lux) bringen, kann dies die Paarung fördern. Im Allgemeinen findet der Höhepunkt der Eiablage um 15:00 Uhr statt (14:10/L:D, Licht um 06:00 Uhr, Licht aus um 20:00 Uhr); Um genügend Embryonen zu erhalten, wird empfohlen, Eiablagekammern 30 Minuten vor 15:00 Uhr in die Käfige zu legen. - Legen Sie eine 200-mesh-Gaze in die Eiablagekammer, 1-2 mm vom Kammerdeckel entfernt. Dies wird dazu beitragen, so viele Embryonen wie möglich zu erhalten.
HINWEIS: Lassen Sie die Embryonen nicht in Orangensaft einweichen oder mit Gaze eingerieben, da dies die Überlebensrate der Embryonen erheblich verringern kann. - Stellen Sie eine neue Eiablagekammer in den Käfig, wenn der Mikroinjektionsaufbau fertig ist. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten mit einer feinen nassen Bürste und richten Sie sie dann auf einer selbstgebauten Injektionsplatte aus (Plexiglas mit einer Länge von 55 mm, einer Breite von 13,75 mm und einer Höhe von 5 mm, eine 45 mm x 5 mm x 0,3 mm flache Rille wird in der Mitte geöffnet, um die Eiablage zu erleichtern). Wenn die Embryonen einen hohen Innendruck haben, ist eine leichte Austrocknung bei <10% RH für 10 min optional. Tauchen Sie die Embryonen während der Injektion in Halogenkohlenstofföl, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden (Abbildung 2C).
3. Mikroinjektion des Embryos
- Bereiten Sie die Glasinjektionsnadel mit einem Mikropipettenzieher vor.
HINWEIS: Das Einstellen der Parameter nach dem Benutzerhandbuch ist wichtig. In diesen Protokollen können verschiedene Nadelformen mit den Parametern hergestellt werden, die im Handbuch des Mikropipettenziehers vorgeschlagen werden. Die Glaskapillare muss so sauber wie möglich sein, um zu verhindern, dass Staub die Nadel verstopft. - Bereiten Sie die funktionierende Lösung vor. Das Cas9-Protein und die entsprechende sgRNA werden auf folgende Arbeitskonzentrationen gemischt: sgRNA, 300 ng/μL; Cas9-Protein, 150 ng/μL. Fügen Sie der Mischung 1 μL Phenolrot hinzu, um als bequeme Möglichkeit zur Markierung injizierter Embryonen zu dienen. Die vorbereitete Mischung auf Eis legen, um einen Abbau der sgRNA zu vermeiden.
HINWEIS: Verwenden Sie nukleasefreie Pipettenspitzen und PCR-Röhrchen. Die Konzentration des Cas9-Proteins muss kleiner oder gleich 150 ng/μL sein; Höhere Konzentrationen sind toxisch und verringern die Überlebensrate des Embryos erheblich. Cas9 könnte auch im DNA- oder mRNA-Format geliefert werden, um eine erfolgreiche Genbearbeitung zu erreichen17,19. In diesem Protokoll wird das Cas9-Protein empfohlen, da mRNAs anfällig für den Abbau sind und die Expression des Cas9-Proteins aus Plasmid-DNA Zeit für die Transkription und Translation benötigt. - Stellen Sie die Parameter für den Injektor ein. Das Ausgangsprogramm ist Pi-500 hPa, Ti-0,5 s und PC-200 hPa. Passen Sie diese Parameter während der Mikroinjektion nach Bedarf weiter an.
- 3 μL der Mischung in die Injektionsnadel geben. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen, die möglicherweise die Nadel verstopfen können. Öffnen Sie die Nadel mit einem Microgrinder.
- Verbinden Sie die Nadel gemäß der Bedienungsanleitung mit dem Mikromanipulator (Abbildung 2E).
- Stellen Sie den Teller mit aufgereihten Embryonen auf den objektiven Tisch. Stellen Sie die Position der Mikropipette unter einem feinen Lichtmikroskop ein und stellen Sie die Mikropipette und den Embryo auf die gleiche Ebene. Stellen Sie die Tröpfchenlautstärke ein, indem Sie das Pedal drücken. 1/10 des Embryonenvolumens wird empfohlen.
- Führen Sie die Nadelspitze in den hinteren (pflanzlichen Pol) des Embryos ein. Geben Sie die Mischungen in den Embryo ab, indem Sie das Pedal vom Injektor drücken. Wenn Phenolrot hinzugefügt wird, wird sofort eine leicht rötliche Farbe beobachtet.
HINWEIS: Ein kleines Volumen zytoplasmatischer Rückfluss aus der Lochblende verringert die Überlebensrate des Embryos nicht. Die Injektion von 200 Embryonen reicht für eine erfolgreiche Mutagenese eines Gens aus. Die Zugabe von mehr Halogenkohlenstofföl zum Eintauchen der Embryonen kann eine weitere Austrocknung verhindern. Die Injektion muss vor der Polzellbildung durchgeführt werden, wodurch sichergestellt wird, dass jede Mutation effizient vererbt werden kann.
4. Insektenaufzucht nach der Injektion
- Legen Sie die Injektionsplatte mit den injizierten Embryonen in eine künstliche Klimakammer, die bei 55% relative Luftfeuchtigkeit, 26,5 °C und einem 14:10 l / D-Zyklus gehalten wird (Licht um sechs Uhr morgens, Licht aus um acht Uhr abends).
- Nach der Injektion dauert die Bildung des Embryos in der Regel 24 Stunden und 36 Stunden bis zum Schlüpfen. Verwenden Sie eine feine Bürste, um die Larven auf eine vorbereitete Larvendiät zu übertragen. Sammeln Sie Larven drei- bis viermal täglich bis keine Larven mehr schlüpfen. Im Allgemeinen brauchen Larven 2-3 Tage, um das Schlüpfen zu beenden und sich innerhalb von 7 Tagen zu verpuppen.
HINWEIS: Zur Fütterung der Larven wurde eine Maisdiät verwendet. Das Rezept enthält 150 g Maismehl, 150 g Banane, 0,6 g Natriumbenzoat, 30 g Hefe, 30 g Saccharose, 30 g Papiertuch, 1,2 ml Salzsäure und 300 ml Wasser29. Minimieren Sie die Zeit, in der Larven in Öl verbleiben (<2 h). Bewegen Sie die Larven sofort nach dem Schlüpfen so weit wie möglich auf das Futter. Dies kann die Überlebens- und Verpuppungsraten deutlich erhöhen. Geben Sie nicht zu viel Diät (eine Diät mit 2/3 einer 90 mm Petrischale reicht für 30 Larven); Andernfalls wird es schimmelig und verringert die Überlebensrate der Larven. - Setzen Sie die reifen Larven in den nassen Sand, um sich zu verpuppen. Die Verpuppungsphase dauert etwa 10 Tage. Bewegen Sie die Puppen in Plastikkäfige, bevor die Eklosion beginnt.
5. Mutanten-Screening
- Ein Flussdiagramm des Mutantenscreenings ist in Abbildung 3A dargestellt. Kreuzen Sie G0-Erwachsene, die durch Mikroinjektion mit Wildtyp-Erwachsenen erhalten wurden, um heterozygote Linien zu erhalten. Überprüfen Sie die Art der Mutationen, die die Nachkommen (G1) tragen, durch Genotypisierung.
- Selbstkreuzung von G1 mit dem gleichen mutierten Genotyp, um homozygote Linien in G2 zu erhalten. Wenn die Genotypen der Mutanten in G1 völlig unterschiedlich sind, kreuzen Sie die Heterozygoten mit Wildtypfliegen. Homozygote Linien werden normalerweise in G3 erhalten. Pflegen Sie zwei oder drei homozygote Linien für nachfolgende Phänotypisierungsexperimente.
- Verwenden Sie die genomische DNA eines frischen Pupariums oder eines einzelnen Mittelbeins einzelner Erwachsener, um eine Genotypisierung durchzuführen. Entwerfen Sie spezifische Primer, um den Zielbereich zu verstärken; Die Primer müssen mindestens 50 bps stromaufwärts und stromabwärts der Zielstelle einstellen. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 1.2.
HINWEIS: Da die Menge der DNA in einem Puparium extrem gering ist, werden kommerziell erhältliche DNA-Extraktionskits empfohlen. - Die PCR wird unter den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 98 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 98 °C für 10 s, 15 s bei einer für die ausgelegten Primer geeigneten Glühtemperatur, 72 °C für 35 s, gefolgt von einer endgültigen Verlängerung von 72 °C für 10 min.
- Sequenzieren Sie die gereinigten PCR-Produkte. Wenn mehrere überlappende Peaks neben der Zielstelle erkannt werden (Abbildung 3B), ist eine erfolgreiche Mutagenese aufgetreten. Subklonen Sie die gereinigten PCR-Produkte in einen stumpfen Vektor und wählen Sie 10 einzelne Bakterienkolonien für die Sequenzierung aus, um den Genotyp der Mutanten zu überprüfen. Pflegen Sie die Linien mit Frameshift-Mutationen und vorzeitigen Translationsabbrüchen (Abbildung 3C).
HINWEIS: Es ist keine Einzelklonsequenzierung erforderlich, um den Genotyp von G0-Individuen zu überprüfen. Sequenzieren Sie einfach die PCR-Produkte und pflegen Sie die Individuen mit offensichtlichen multiplen Überlappungspeaks neben der Zielstelle. Nach der ersten Injektion wird empfohlen, 10 Embryonen zur Extraktion genomischer DNA auszuwählen und die PCR-Produkte basierend auf den Standards in Schritt 5.3 zu sequenzieren. Dies kann helfen, Mutationsraten im Voraus vorherzusagen. In dieser Studie wurde die Sanger-Sequenzierung zur Bestimmung des Genotyps von einer Sequenzierungsfirma durchgeführt.
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Representative Results
Dieses Protokoll enthält detaillierte Schritte für die Entwicklung von B. dorsalis-Mutanten unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie, einschließlich repräsentativer Ergebnisse der gDNA-Selektion, der Entnahme von Embryonen und der Mikroinjektion, der Insektenpflege und des Mutantenscreenings.
Das Beispiel der Zielstelle des ausgewählten Gens befindet sich im dritten Exon (Abbildung 1C). Diese Stelle ist hoch konserviert, und eine einzelne Bande wurde durch Gelelektrophorese für die DNA-Vorlage für synthetische gRNA (Abbildung 1D) und gRNA, die durch In-vitro-Transkription erhalten wurde (Abbildung 1E), nachgewiesen.
Die Injektion in 200 frisch geerntete Eizellen wurde wie in Abschnitt 3 beschrieben durchgeführt. Die Embryonen wurden gemäß den in den Schritten 4.1-4.3 beschriebenen Protokollen gehalten. Wie durch Sequenzierung der PCR-Produkte nachgewiesen, sind 80% der G0-Individuen Mosaikmutanten (Tabelle 1). Hier wurden Mutanten mit 8 bp Deletion ausgewählt, die zu einer vorzeitigen Beendigung der Aminosäuretranslation in G1 führten (Abbildung 3C). Dies sollte zu Veränderungen der entsprechenden Funktionen dieses Genprodukts in B. dorsalis führen. Die ausgewählten G1 wurden mit Wildtyp-Heterozygoten gekreuzt, um G2-Heterozygoten zu erhalten. Die G2-Heterozygoten und Homozygoten wurden in der nächsten Generation selbst geborgen, was zeigt, dass dieses Schema für die Entwicklung von B. dorsalis-Mutanten erfolgreich ist und in funktionellen Genstudien an dieser und nahe verwandten Arten breiter angewendet werden könnte.
Abbildung 1: Herstellung von sgRNA. (A) Allgemeine Verfahren zur sgRNA-Herstellung. (B) Zielfläche, amplifiziert durch PCR aus gDNA (100 bp). (C) Beispiel für Zielgenstruktur und Zielspaltstelle durch Cas9. (D) PCR-Assemblierung von sgRNA (~100 bp). (E) Synthese von sgRNA durch in vitro Transkription und Aufreinigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikroinjektion des Embryos. (A) Verfahren und Methode der Injektion. (B) Embryo-Entnahmegerät, Eier auf Gaze legen. (C) Embryonen mit Wasser ausrichten und mit Halogenkohlenstofföl abdecken. (D) Mikropipettenzieher. (E) Der gesamte Aufbau des Mikroinjektionssystems. Mikroskop (links), Mikroinjektor und Mikromanipulator (Mitte) und automatische Luftpumpe (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mutanten-Screening . (A) Paarung von Mutanten und Erwerb von Homozygoten. (B) PCR-Produkte aus dem mutierten Genom, die einen bestimmten Satz von Peaks am Ziel erzeugen. (C) Einer der Mutationstypen und Aminosäureveränderungen. Deletionsmutationen führen zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Abkürzungen: HE = heterozygot, HO = homozygot. Kontrolle: Embryo mit verschlüsselten sgRNAs injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Injektionsmischung | Injizierte Embryonen | Schlüpfte Larven | Puppen | Mosaik G0 | ||
| (Mosaik/Erwachsene insgesamt) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Phenolrot (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Phenolrot (1 μL) | ||||||
Tabelle 1: Überleben und Mutagenese von B. dorsalis nach Mikroinjektionen.
| Problem | Mögliche Ursache(n) | Lösungen | |
| Ineffiziente Embryonenentnahme | 1. Erwachsene sind in schlechtem Zustand | 1. Stellen Sie die Verfügbarkeit von Nahrung und Wasser sicher, insbesondere den Zuckergehalt der Lebensmittel. | |
| 2. Unzureichende Paarung | 2. Paarung im Voraus unter 30-50 Lux schwachen Bedingungen. Es ist am besten, 12-15 Tage alte verpaarte Erwachsene auszuwählen. | ||
| Schlechte Schlupffähigkeit der Eier nach der Injektion | 1. Embryonen von schlechter Qualität | 1. Pflücken Sie frische und pralle Eier und bestreichen Sie sie vorsichtig mit einer wassergetränkten Bürste. | |
| 2. Nadel passt nicht | 2. Die Spitze der Nadel ist so klein wie möglich, um Schäden am Ei während der Injektion zu minimieren. | ||
| 3. Unsachgemäße Aufzucht von Eiern nach der Injektion | 3. Eier müssen nach der Injektion hydratisiert gehalten werden, um zu verhindern, dass Dehydrierung austrocknet. Eier können nach der Injektion auch direkt in die Nahrung überführt werden. | ||
| Niedrige Larvenüberlebensrate | 1. Schimmelpilzfutter ist nicht für das Larvenwachstum geeignet | 1. Für frisch geschlüpfte Larven eine kleine Menge Futter hinzufügen. Zu viel Nahrung schimmelt oder trocknet aus und beeinträchtigt das Wachstum der Larven. | |
| 2. Frisch geschlüpfte Larven, die lange Zeit in Öl getränkt wurden | 2.Die frisch geschlüpften Larven müssen rechtzeitig in die Larvennahrung überführt werden oder die Eier sollten nach der Injektion direkt in das Futter gepflückt werden. | ||
| Die Mutationsrate bei Erwachsenen ist niedrig | 1. Geringe Qualität der gRNA | 1. Rigoroser experimenteller Betrieb zur Synthese hochwertiger gRNA, um den Abbau zu verhindern. | |
| 2. Ineffiziente Ziele führen zu Zielabweichungen | 2. Überprüfung hocheffizienter Ziele, wie in unserer Diskussion erwähnt. | ||
Tabelle 2: Mögliche Probleme bei der Konstruktion von Mutanten, mögliche Ursachen und Lösungen.
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Discussion
Das CRISPR/Cas9-System ist das am weitesten verbreitete Gen-Editing-Tool und hat verschiedene Anwendungen, wie Gen-Threpy30, Pflanzenzüchtung 31 und grundlegende Studien der Genfunktionen32. Dieses System wurde bereits für die Gen-Editierung bei verschiedenen Insektenarten eingesetzt und diente als effektives Werkzeug für funktionelle Genstudien bei Schädlingen. Die Protokolle, die wir hier vorstellen, standardisieren das Verfahren des Designs und der Synthese von Guide-RNAs, der Sammlung von Embryonen, der Embryoinjektion, der Insektenaufzucht und des Mutantenscreenings. Darüber hinaus wurde eine Fehlerbehebungstabelle hinzugefügt, um das potenzielle Problem aus jedem Schritt zusammenzufassen, und ihre Lösungen wurden bereitgestellt, um die Arbeitsbelastung zu verringern und die Effizienz zu verbessern (Tabelle 2). Dieses Verfahren bietet eine zuverlässige Möglichkeit, Gene von Interesse zu bearbeiten und verbessert die funktionellen genomischen Studien in B. dorsalis.
Erstens ist die Auswahl von Zielgenen entscheidend für die Steigerung der Effizienz des CRISPR/Cas9-Systems, und mehrere Open-Source-Softwareprogramme wie ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 und CRISPR optimal target finder 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) können automatisch Ziele generieren und potenzielle Off-Target-Raten vorhersagen. Da die hohe Fruchtbarkeit von B. dorsalis die Embryonenentnahme erleichtert, können Mutantenraten vorhergesagt werden, indem ein Teil der Embryonen für die DNA-Extraktion und Sequenzierung der Zielregion geopfert wird. Wenn im Labor keine Sequenzierung verfügbar ist, wird auch die Verwendung der T7-Endonuklease I zur Vorhersage von Mutationsraten empfohlen37. Zielstellen mit hohen genomischen Deletionsraten können durch diese drei Methoden ausgewählt werden, und daher könnte die Effizienz der Genbearbeitung in B. dorsalis erhöht werden.
Das Entwicklungsstadium des Embryos bestimmt, ob Mutationen vererbt werden. Um vererbte Mutationen zu erhalten, muss die Gen-Editierung in Keimzellen erfolgen. Im Allgemeinen kann die Mischung aus sgRNA und Cas9 nach der Polzellbildung nicht in Keimzellen abgegeben werden. Bei B. dorsalis fand die Polzellbildung 3 h nach der Eiablage38 statt, während das hier beschriebene Protokoll für B. dorsalis 30 Minuten von der Embryonenentnahme bis zum Ende der Mikroinjektion dauert. Während der Injektion werden fast keine Polzellen im pflanzlichen Ende des Embryos gebildet; Daher sollten Genmutationen, die im G0 erhalten wurden, effizient vererbt werden. Der Zeitaufwand für die Mikroinjektion ist auch geringer als die in zuvor veröffentlichten Arbeiten erwähnte Methode (in der Regel 1-3 h)18,19.
Es ist wichtig, mechanische oder chemische Schäden während des Prozesses der Embryonenentnahme und -handhabung zu minimieren. Verwenden Sie eine feine Bürste, um die Embryonen vorsichtig auf der Injektionsplatte auszurichten. Die Position der Injektion sollte die Arbeit widerspiegeln, die zuvor in Drosophila (Methoden - Nicolas Gompels Labor, http://gompel.org/methods) und Ceratitis capitata39 durchgeführt wurde. Embryonen am Pflanzenpol injizieren; Führen Sie die Nadel niemals in die Tierstange ein. Bereiten Sie die Nadel nach der Mikropipettenzieherführung vor; Die Öffnung der Nadel sollte so klein wie möglich sein, um einen übermäßigen zytoplasmatischen Rückfluss zu vermeiden. Die in veröffentlichten Studien in B. dorsalis erwähnte Methode dechorionierte die Embryonen im Allgemeinen mit Natriumhypochorit17,18,19; Dies könnte chemische Schäden verursachen und die Überlebensraten der Embryonen verringern. In diesem Protokoll werden die Embryonen nicht dechorioniert, und die Injektion funktioniert immer noch gut. Der chemische Schaden an den Embryonen könnte minimal sein.
Die Insektenaufzucht nach der Injektion ist sehr wichtig. Das hier bereitgestellte standardisierte Aufzuchtprotokoll kann als Referenz für die Aufzucht anderer Fruchtfliegenarten, insbesondere Bactrocera-Arten , dienen. Die Embryonen können mit unserer selbstgebauten Injektionsplatte in Öl getaucht werden, um Austrocknung während der Injektion zu vermeiden. Minimieren Sie die Zeit, die Larven im Öl verbringen (<2 h), um Überlebensraten im G0 über 50% zu erreichen.
Für den Nachweis von Mutanten wird eine nicht-invasive Methode der genomischen DNA-Extraktion empfohlen. Zum Beispiel schlagen einige Lepidoptera-Forscher vor, dass die Exuviaten der endgültigen Larven verwendet werden könnten, um genomische DNA für die weitere Genotypisierung zu extrahieren. Für B. dorsalis besteht eine nicht-invasive Methode darin, genomische DNA aus einem frischen Puparium zu extrahieren. Die Injektion mehrerer sgRNAs, die auf ein Markergen und das interessierende Gen abzielen, könnte auch die Identifizierung von Mutanten verbessern. Zum Beispiel können co-injizierte sgRNAs, die auf die Augenfarbe (kmo) und den juvenilen Hormonrezeptor (Met) abzielen, 75% der Nachkommen mit Doppelmutationen in Moskitos produzieren. Met-Mutanten wurden vorläufig anhand der Augenfarbe der Larvengescreent 37. Dies sollte in Zukunft bei B. dorsalis evaluiert werden, um die Wirksamkeit der Gen-Editierung bei dieser Insektenart unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems weiter zu verbessern.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das CRSIPR/Cas9-System ein leistungsfähiges Werkzeug in der funktionellen Genomik von B. dorsalis ist. Unsere detaillierten Protokolle bieten nützliche Informationen, die Forschern helfen, eine effiziente Embryonensammlung, ideale Überlebensraten von Larven und die gewünschte Bearbeitungseffizienz zu erreichen. Dies könnte ein einfacher und schneller Weg sein, um Forschern zu helfen, Mutagenese in B. dorsalis zu erhalten. Diese Technik konnte nicht in den funktionellen Studien von letalen Genen angewendet werden, da die vererbten Mutationen erfolgreiche Kreuzungen erfordern. Zukünftige Studien könnten sich auf die Entwicklung transgener Werkzeuge konzentrieren, um stadien- oder gewebespezifische CRISPR-Elemente zu exprimieren, um diese Einschränkung zu durchbrechen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) und Sonderfonds für wissenschaftlich-technologische Innovation und industrielle Entwicklung des Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
