Summary
Bu yazıda, Oryantal meyve sineği Bactrocera dorsalis'in CRISPR / Cas9 mutagenezi için adım adım protokoller sunulmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokol tarafından sağlanan ayrıntılı adımlar, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmaları için mutant sineklerin üretilmesi için yararlı bir rehber görevi görecektir.
Abstract
Oryantal meyve sineği, Bactrocera dorsalis, narenciye ve dünya çapında 150'den fazla diğer meyve ürününe zarar veren oldukça istilacı ve uyarlanabilir bir haşere türüdür. Yetişkin meyve sinekleri büyük uçuş kapasitesine sahip olduklarından ve dişiler yumurtalarını meyve derilerinin altına bıraktıklarından, haşere ile doğrudan temas gerektiren böcek öldürücüler genellikle tarlada zayıf performans gösterir. Moleküler biyolojik araçların ve yüksek verimli dizileme teknolojisinin geliştirilmesiyle, birçok bilim adamı çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmeye çalışmaktadır. Bunlar, çeşitli böcek zararlılarında, arama davranışında yer alan koku alma genleri gibi genleri (moleküler hedefleri) aşağı regüle eden veya susturan RNAi veya gen düzenleme tabanlı pestisitleri içerir. Bu stratejileri Oryantal meyve sineği kontrolüne uyarlamak için, fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemlere ihtiyaç vardır. B. dorsalis'in hayatta kalması ve üremesinde kritik fonksiyonlara sahip genler, gen yıkımı ve / veya susturulması için iyi moleküler hedefler olarak hizmet eder. CRISPR / Cas9 sistemi, özellikle böceklerde gen düzenleme için kullanılan güvenilir bir tekniktir. Bu yazıda B. dorsalis'in CRISPR/Cas9 mutagenezisi için kılavuz RNA'ların tasarımı ve sentezi, embriyo toplama, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştirme ve mutant taraması gibi sistematik bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokoller, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmaları ile ilgilenen araştırmacılar için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber görevi görecektir.
Introduction
Oryantal meyve sineği, Bactrocera dorsalis , guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirazı, narenciye, yenidünya ve papaya1 dahil olmak üzere 150'den fazla meyve mahsulü türüne zarar veren kozmopolit bir böcek haşere türüdür. Sadece Guangdong Eyaletinde (Çin) meydana gelen hasarın 200 milyon yuan'ın üzerinde olduğu tahmin edilmektedir. Yetişkin dişiler yumurtalarını olgunlaşan veya olgunlaşmış meyvelerin derisinin altına yerleştirir, bu da meyvenin çürümesine ve yok olmasına neden olur, bu da meyve kalitesini ve mahsulün genel verimini azaltır2. Yetişkin meyve sinekleri büyük uçuş kapasitesine sahip olduklarından ve larvaları meyve derisine girdiğinden, haşere ile doğrudan temas gerektiren böcek öldürücüler tarlada zayıf performans gösterir. Ek olarak, insektisitlerin yaygın kullanımı, B. dorsalis'in çeşitli tarımsal kimyasallara karşı direncini arttırmış ve bu zararlı zararlıların kontrolünü daha da zorlaştırmıştır3. Bu nedenle, etkili ve çevre dostu haşere yönetimi stratejilerinin geliştirilmesine umutsuzca ihtiyaç duyulmaktadır.
Son zamanlarda, moleküler biyolojik araçların ve yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesiyle, bilim adamları, çeşitli böcek zararlılarının önemli genlerinin (moleküler hedeflerin) işlevselliğini hedefleyen RNAi gibi çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmeye çalışıyorlar. Zararlıların hayatta kalması ve üremesi için kritik olan genler, fonksiyonel gen çalışmaları yoluyla tanımlanabilir ve ayrıca özel olarak hedeflenmiş ve çevre dostu haşere yönetim araçlarının iyileştirilmesi için potansiyel moleküler hedefler olarak hizmet edebilir4. Bu tür stratejileri Oryantal meyve sineği kontrolüne uyarlamak için, fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemlere ihtiyaç vardır.
CRISPR / Cas (kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili) endonükleaz sistemi başlangıçta bakteri ve arkelerde keşfedildi ve bakteriyofajların enfekte edilmesiyle ortaya çıkanlar gibi yabancı hücre içi DNA'nın tanınması ve parçalanmasında rol oynayan adaptif bir mekanizma olduğu bulundu5. Tip II CRISPR sisteminde, Cas9 endonükleaz, küçük ilişkili RNA'lar (crRNA ve tracrRNA) tarafından izinsiz DNA 6,7,8'i parçalamak için yönlendirilir ve bugüne kadar 9,10,11,12 gen düzenleme için en yaygın kullanılan araçlardan biri haline gelmiştir. CRISPR / Cas9 sistemi, gen susturmanın yüksek verimliliği ve düşük maliyet gibi çeşitli avantajlara sahip olduğundan, Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 ve Bombyx mori16 dahil olmak üzere çeşitli böcek türlerinde gen düzenleme için zaten uygulanmıştır. B. dorsalis'te, vücut rengi, kanat dimorfizmi ve cinsiyet tayini ile ilgili genler, CRISPR / Cas917,18,19 kullanılarak başarıyla nakavt edilmiştir. Bununla birlikte, bu böcekte CRISPR / Cas9 uygulaması için ayrıntılı prosedürler eksik kalmaktadır. Ayrıca, araştırmacılar tarafından B. dorsalis gen düzenlemesi için sağlanan bazı adımlar da çeşitlidir ve standardizasyona ihtiyaç duymaktadır. Örneğin, Cas9'un formlarıyayınlanmış referanslarda farklıydı 17,18,19.
Bu yazıda CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak B. dorsalis'in mutagenezisi için kılavuz RNA'ların tasarımı ve sentezi, embriyo toplama, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştirme ve mutant taraması dahil olmak üzere sistematik bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmalarıyla ilgilenen araştırmacılar için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber görevi görecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hedef tasarım ve sgRNA'nın in vitro sentezi
- İlgilenilen hedef genlerin yapısını tahmin edin ve B. dorsalis genomunun biyoinformatik analizi yoluyla ekzonlar ve intronlar arasındaki sınırları belirleyin (burada kullanılan yazılım uygulamaları Malzeme Tablosunda listelenmiştir).
NOT: BLAT20 , genomdaki potansiyel gen lokuslarını aramak için kullanıldı. Yüksek kaliteli RNA-seq okumaları (transkriptom), Hisat221 kullanılarak edinilen gen lokuslarına hizalandı. Sıralanmış bam dosyalarını oluşturmak için Samtools22 kullanıldı. Sıralanmış bam dosyaları, derleme transkriptlerini sağlamak içinStringtie2 23'e girildi. Birleştirilmiş transkriptler ve gen lokus bilgileri Transdekoder24 ile birleştirildi. Transdekoderden elde edilen sonuçlar IGV araçları25'te görselleştirildi ve ekzonlar ile intronlar arasındaki sınırlar belirlenebildi. - Aday hedef gen bölgesi içindeki uygun hedef bölgeleri tanımlayın. Daha uygun sıralama için toplam uzunluk 750 bp'den az olmalıdır (Şekil 1B). Hedef alanı PCR ile vahşi tip genomik DNA'dan yükseltmek için spesifik primerler tasarlayın (Şekil 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). PCR ürünlerini kör bir son vektör26'ya klonlayın ve hedef bölgenin laboratuvar böcek popülasyonlarında ne kadar korunduğunu belirlemek için dizileme için 20 ayrı bakteri kolonisi seçin.
- Tipik bir hedef bölge, üç nükleotid dizi motifi (NGG veya CCN) ve NGG veya CCN motiflerine bitişik 20 bp dizisi (20 bp-NGG veya CCN-20 bp) içerir. Aday hedef bölgeleri B. dorsalis genomuna karşı patlatın ve tahmin edilen verimliliğin yeterince yüksek olduğundan ve hedefleme dışı oranın düşük olduğundan emin olun; birkaç açık kaynaklı yazılım programı bunu otomatik olarak tahmin edebilir. Bu protokolde, optimal hedefleri seçmek ve değerlendirmek için sgRNAcas9 -AI27 kullanılır. Kullanım ayrıntıları bu yazılımın kılavuzunda bulunabilir.
NOT: Hedef genin 5' UTR'sine ve 20 bp dizisinin başlangıcındaki 1-2 Gs'ye kapalı olası hedef bölgeler tercih edilir. PCR ve ardından agaroz jel elektroforezi ile tanımlanacak büyük bir delesyon elde etmek için, 100 bp'nin üzerinde28 ile ayrılmış iki hedefin tasarlanması önerilir (Şekil 1C). - Tasarlanan sgRNA'yı üretmek için piyasada bulunan gRNA sentez kitini kullanın. Kullanım kılavuzunu izleyerek her adımı gerçekleştirin. gRNA ürününü nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın, bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak konsantrasyonu ölçün ve kullanımdan önce -80 ° C'de saklayın (burada kullanılan kit ile başarılı bir şekilde sentezlenmiş tek gRNA [10 μL] konsantrasyonu yaklaşık 4000-6000 ng / μL veya daha yüksektir).
NOT: Mutant sineklerin üretilmesi her araştırmacı için ilk adım olsa da, aşağı akış deneyi / analizi için uygun negatif kontrol kritik öneme sahiptir. Bu kontrolleri mutantlarla birlikte üretmek, araştırmacılara zaman ve çaba kazandırır. Örneğin, karıştırılmış sgRNA'yı negatif kontrol olarak ayarlayın.
2. Embriyo toplama ve hazırlama
- B. dorsalis pupalarını plastik kafeslere yerleştirin. Yetişkinler kapandıktan sonra bir su kaynağı ile birlikte yiyecek olarak şeker ve maya karışımı (1: 1) sağlayın (Şekil 2A, B). Yetiştirme koşulları %55 bağıl nem (RH), 26,5 °C ve 14:10 L/D döngüsüdür (sabah altıda yanar, akşam sekizde yanar).
- Çoğu yetişkin, ortaya çıktıktan 10 gün sonra cinsel olgunluğa ulaşır. Yetişkin sineklerin mümkün olduğunca çiftleşmesine yardımcı olmak için uygun bir ortam sağlayın. İdeal olarak, 30-50 lüks ışıklı bir ışık standı kullanın. Bu, kadınların doğurganlığını artırabilir, bu nedenle embriyo toplama verimliliğini artırabilir.
NOT: Yetişkinleri (ortaya çıktıktan 5-6 gün sonra) loş ışıklı (<100 lüks) bir ortama koymak çiftleşmeyi teşvik edebilir. Genel olarak, yumurtlamanın zirvesi saat 15:00'te gerçekleşir (14:10 / L: D, ışıklar 06: 00'da yanar, ışıklar 20: 00'de kapanır); Yeterli embriyo elde etmek için, yumurtlama odalarının kafeslere saat 15: 00'ten 30 dakika önce yerleştirilmesi önerilir. - Yumurtlama odasına, oda kapağından 1-2 mm uzakta 200 ağlık bir gazlı bez yerleştirin. Bu, mümkün olduğunca çok sayıda embriyo elde etmenize yardımcı olacaktır.
NOT: Embriyoların portakal suyuna batırılmasına veya gazlı bezle ovalanmasına izin vermekten kaçının, çünkü bu embriyoların hayatta kalma oranını önemli ölçüde azaltabilir. - Mikroenjeksiyon kurulumu hazır olduğunda kafese yeni bir yumurtlama odası koyun. İnce bir ıslak fırça kullanarak embriyoları her 10 dakikada bir toplayın, ardından kendi kendine yapılan bir enjeksiyon plakasına hizalayın (55 mm uzunluğunda, 13.75 mm genişliğinde ve 5 mm yüksekliğinde pleksiglas, yumurta yerleşimini kolaylaştırmak için ortada 45 mm x 5 mm x 0.3 mm sığ oluk açılır). Embriyolar yüksek iç basınca sahipse, 10 dakika boyunca% <10 RH'de hafif kuruma isteğe bağlıdır. Daha fazla kurumayı önlemek için enjeksiyon sırasında embriyoları halokarbon yağına batırın (Şekil 2C).
3. Embriyonun mikroenjeksiyonu
- Cam enjeksiyon iğnesini bir mikropipet çektirici kullanarak hazırlayın.
NOT: Kullanım kılavuzunu izleyerek parametrelerin ayarlanması önemlidir. Bu protokollerde, mikropipet çektirme makinesinin kılavuzunun önerdiği parametreler kullanılarak farklı iğne şekilleri yapılabilir. Cam kılcal damar, tozun iğneyi tıkamasını önlemek için mümkün olduğunca temiz olmalıdır. - Çalışma çözümünü hazırlayın. Cas9 proteinini ve karşılık gelen sgRNA'yı aşağıdaki çalışma konsantrasyonlarına karıştırın: sgRNA, 300 ng / μL; Cas9 proteini, 150 ng / μL. Enjekte edilen embriyoları işaretlemek için uygun bir yol olarak hizmet etmek üzere karışıma 1 μL fenol kırmızısı ekleyin. SgRNA'nın bozulmasını önlemek için hazırlanan karışımı buz üzerine yerleştirin.
NOT: Nükleaz içermeyen pipet uçları ve PCR tüpleri kullanın. Cas9 proteininin konsantrasyonu 150 ng / μL'den az veya ona eşit olmalıdır; daha yüksek konsantrasyonlar toksiktir ve embriyo sağkalım oranını önemli ölçüde azaltır. Cas9, başarılı gen düzenleme17,19'u elde etmek için DNA veya mRNA formatında da verilebilir. Bu protokolde, mRNA'lar bozulmaya duyarlı olduğundan Cas9 proteini önerilir ve Cas9 proteininin plazmid DNA'sından ekspresyonu transkripsiyon ve translasyon için zaman alır. - Enjektör parametrelerini ayarlayın. Başlangıç programı Pi-500 hPa, Ti-0.5 s ve PC-200 hPa'dır. Mikroenjeksiyon sırasında bu parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
- Enjeksiyon iğnesine karışımın 3 μL'sini ekleyin. İğneyi tıkayabilecek hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. İğneyi bir Microgrinder kullanarak açın.
- İğneyi kullanım kılavuzuna göre mikromanipülatöre bağlayın (Şekil 2E).
- Sıralı embriyolarla plakayı objektif masaya koyun. İnce bir optik mikroskop altında mikropipetin konumunu ayarlayarak mikropipeti ve embriyoyu aynı düzleme ayarlayın. Pedala basarak damlacık sesini ayarlayın; Embriyo hacminin 1/10'u tavsiye edilir.
- İğne ucunu embriyonun arka kısmına (bitkisel kutup) yerleştirin. Enjektörden pedala basarak karışımları embriyoya iletin. Fenol kırmızısı eklenirse, anında hafif kırmızımsı bir renk gözlenir.
NOT: İğne deliğinden küçük bir sitoplazmik geri akış, embriyonun hayatta kalma oranını azaltmaz. Bir genin başarılı mutagenezisi için 200 embriyo enjeksiyonu yeterlidir. Embriyoları batırmak için daha fazla halokarbon yağı eklemek, daha fazla kurumayı önleyebilir. Enjeksiyonun, kutup hücresi oluşumundan önce yapılması gerekir, bu da her mutasyonun verimli bir şekilde kalıtsal olmasını sağlar.
4. Enjeksiyon sonrası böcek yetiştiriciliği
- Enjeksiyon plakasını, enjekte edilen embriyolarla% 55 RH, 26.5 ° C ve 14: 10 L / D döngüsünde tutulan yapay bir iklim odasına koyun (sabah altıda yanar, akşam sekizde yanar).
- Enjeksiyondan sonra, embriyo oluşumunun tamamlanması genellikle 24 saat ve yumurtadan çıkması 36 saat sürer. Larvaları hazırlanmış bir larva diyetine aktarmak için ince uçlu bir fırça kullanın. Artık larva yumurtadan çıkmayana kadar larvaları günde üç veya dört kez toplayın. Genel olarak, larvaların yumurtadan çıkmayı bitirmesi ve 7 gün içinde yavrulanması 2-3 gün sürer.
NOT: Larvaları beslemek için mısır bazlı bir diyet kullanılmıştır. Tarifte 150 g mısır unu, 150 g muz, 0.6 g sodyum benzoat, 30 g maya, 30 g sakaroz, 30 g kağıt havlu, 1.2 mL hidroklorik asit ve 300 mL su29 bulunur. Larvaların yağda kaldığı süreyi en aza indirin (<2 saat). Larvaları yumurtadan çıktıktan hemen sonra mümkün olduğunca diyete taşıyın. Bu, hayatta kalma ve yavru oranlarını önemli ölçüde artırabilir. Çok fazla diyet vermeyin (90 mm'lik Petri kabının 2 / 3'ünü içeren bir diyet 30 larva için yeterlidir); aksi takdirde, küflenir ve larva hayatta kalma oranını azaltır. - Olgun larvaları yavrulamak için ıslak kuma koyun. Yavru aşaması yaklaşık 10 gün sürer. Eklozyon başlamadan önce pupaları plastik kafeslere taşıyın.
5. Mutant taraması
- Mutant taramanın akış şeması Şekil 3A'da gösterilmiştir. Heterozigot çizgiler elde etmek için vahşi tip yetişkinlerle mikroenjeksiyon ile elde edilen G0 yetişkinlerini geçin. Yavruların (G1) genotipleme yoluyla taşıdığı mutasyon tipini doğrulayın.
- G2'de homozigot çizgiler elde etmek için aynı mutant genotiple G1'i kendiliğinden çaprazlayın. G1'deki mutantların genotipleri tamamen farklıysa, heterozigotları vahşi tip sineklerle geçin. Homozigot çizgiler genellikle G3'te elde edilir. Sonraki fenotipleme deneyleri için iki veya üç homozigot çizgi tutun.
- Genotipleme yapmak için taze bir puparyumdan veya bireysel yetişkinlerin tek bir orta bacağından genomik DNA'yı kullanın. Hedef alanı büyütmek için özel astarlar tasarlayın; astarlar, hedef bölgenin yukarı ve aşağı yönünde en az 50 bps ayarlamalıdır. Astar ayrıntıları için adım 1.2'ye bakın.
NOT: Bir puparyumdaki DNA miktarı son derece düşük olduğundan, ticari olarak temin edilebilen DNA ekstraksiyon kitleri önerilir. - Aşağıdaki döngü koşullarını kullanarak PCR gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 98 °C, ardından 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, tasarlanan astarlar için uygun bir tavlama sıcaklığında 15 sn, 35 s için 72 °C, ardından 10 dakika boyunca 72 °C'lik son bir uzatma.
- Saflaştırılmış PCR ürünlerini sıralayın. Hedef bölgeye bitişik birden fazla örtüşen tepe noktası tespit edildiğinde (Şekil 3B), başarılı mutagenez meydana gelmiştir. Saflaştırılmış PCR ürünlerini künt uçlu bir vektöre alt klonlayın ve mutantların genotipini doğrulamak için dizileme için 10 ayrı bakteri kolonisi seçin. Çerçeve kaydırma mutasyonları ve erken çeviri sonlandırmaları ile çizgileri koruyun (Şekil 3C).
NOT: G0 bireylerinin genotipini doğrulamak için tek klon dizilemesi yapmaya gerek yoktur. Sadece PCR ürünlerini sıralayın ve bireyleri hedef bölgeye bitişik belirgin çoklu örtüşme zirveleri ile koruyun. İlk enjeksiyondan sonra, genomik DNA'yı çıkarmak için 10 embriyo seçilmesi ve PCR ürünlerinin adım 5.3'teki standartlara göre sıralanması önerilir. Bu, mutasyon oranlarını önceden tahmin etmeye yardımcı olabilir. Bu çalışmada genotipi belirlemek için sanger dizilimi bir dizileme şirketi tarafından yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, gDNA seçimi, embriyo toplama ve mikroenjeksiyon, böcek bakımı ve mutant taramasından elde edilen temsili sonuçlar da dahil olmak üzere CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak B. dorsalis mutantlarının geliştirilmesi için ayrıntılı adımlar sunmaktadır.
Seçilen genin hedef bölgesinin örneği üçüncü ekzonda bulunur (Şekil 1C). Bu bölge oldukça korunmuştur ve sentetik gRNA (Şekil 1D) ve in vitro transkripsiyon ile elde edilen gRNA için DNA şablonu için jel elektroforezi ile tek bir bant tespit edilmiştir (Şekil 1E).
200 taze hasat edilmiş yumurtaya enjeksiyon, bölüm 3'te açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Embriyolar, adım 4.1-4.3'te açıklanan protokoller izlenerek korunmuştur. PCR ürünlerinin dizilenmesiyle saptandığı üzere G0 bireylerinin %80'i mozaik mutantlardır (Tablo 1). Burada, G1'de amino asit translasyonunun erken sonlandırılmasına neden olan 8 bp delesyonlu mutantlar seçildi (Şekil 3C). Bu, B. dorsalis'teki bu gen ürününün karşılık gelen işlevlerinde değişikliklere yol açmalıdır. Seçilen G1, G2 heterozigotları elde etmek için vahşi tiple çaprazlandı. G2 heterozigotları ve homozigotları bir sonraki nesilde kendiliğinden geçti, bu da bu şemanın B. dorsalis mutantlarının geliştirilmesinde başarılı olduğunu ve bu ve yakından ilişkili türlerdeki fonksiyonel gen çalışmalarında daha yaygın olarak uygulanabileceğini gösterdi.
Şekil 1: SgRNA'nın hazırlanması. (A) sgRNA preparasyonu için genel prosedürler. (B) PCR ile gDNA'dan (100 bp) yükseltilen hedef alan. (C) Cas9 tarafından hedef gen yapısı ve hedef bölünme bölgesi örneği. (D) sgRNA'nın PCR montajı (~100 bp). (E) İn vitro transkripsiyon ve saflaştırma ile sgRNA'nın sentezi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyo mikroenjeksiyonu . (A) Enjeksiyon işlemi ve yöntemi. (B) Gazlı bez üzerine yumurta bırakan embriyo toplama cihazı. (C) Embriyoları suyla hizalayın ve halokarbon yağı ile örtün. (D) Mikropipet çektirme. (E) Mikroenjeksiyon sisteminin tüm kurulumu. Mikroskop (solda), mikroenjektör ve mikromanipülatör (ortada) ve otomatik hava pompası (sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mutant Taraması . (A) Mutantların çiftleşmesi ve homozigotların edinilmesi. (B) Hedefte farklı bir pik kümesi oluşturan mutant genomdan PCR ürünleri. (C) Mutasyon tiplerinden biri ve amino asit değişiklikleri. Delesyon mutasyonları translasyonun erken sonlandırılmasına yol açar. Kısaltmalar: HE = heterozigotlar, HO = homozigotlar. Kontrol: Karıştırılmış sgRNA'larla enjekte edilen embriyo. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Enjeksiyon karışımı | Enjekte edilen embriyolar | Yumurtadan çıkmış larvalar | Pupa | Mozaik G0 | ||
| (Mozaik/Toplam yetişkin) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Fenol kırmızısı (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Fenol kırmızısı (1 μL) | ||||||
Tablo 1: B. mikroenjeksiyon sonrası dorsalis sağkalımı ve mutagenezi.
| Sorun | Potansiyel neden(ler) | Çözümleri | |
| Verimsiz embriyo toplama | 1. Yetişkinler kötü durumda | 1. Yiyecek ve suyun, özellikle de yiyeceğin şeker içeriğinin mevcudiyetini sağlayın. | |
| 2. Yetersiz çiftleşme | 2. 30-50 Lux loş koşullar altında önceden çiftleşme. 12-15 günlük çiftleşmiş yetişkinleri seçmek en iyisidir. | ||
| Enjeksiyondan sonra yumurtaların zayıf kuluçka kabiliyeti | 1. Düşük kaliteli embriyolar | 1. Taze ve dolgun yumurtaları toplayın ve suya batırılmış bir fırçayla hafifçe fırçalayın. | |
| 2. İğne sığmıyor | 2. İğnenin ucu, enjeksiyon sırasında yumurtaya verilen zararı en aza indirmek için mümkün olduğunca küçüktür. | ||
| 3. Enjeksiyondan sonra yumurtaların yanlış yetiştirilmesi | 3. Dehidrasyonun kurumasını önlemek için enjeksiyondan sonra yumurtaların hidratlı tutulması gerekir. Yumurtalar enjeksiyondan sonra doğrudan yiyeceğe de aktarılabilir. | ||
| Düşük larva hayatta kalma oranı | 1. Küflü yiyecekler larva büyümesi için uygun değildir | 1. Yeni yumurtadan çıkmış larvalar için az miktarda yiyecek ekleyin. Çok fazla yiyecek küflenir veya kurur ve larvaların büyümesini etkiler. | |
| 2. Yeni yumurtadan çıkmış larvalar uzun süre yağa batırılmış | 2. Yeni yumurtadan çıkan larvaların larva yemine zamanında aktarılması veya yumurtaların enjeksiyondan sonra doğrudan yiyeceğe toplanması gerekir. | ||
| Erişkin mutasyon oranı düşüktür | 1. Düşük gRNA kalitesi | 1. Bozulmayı önlemek için yüksek kaliteli gRNA'yı sentezlemek için titiz deneysel işlem. | |
| 2. Verimsiz hedefler hedef dışı hedeflere yol açar | 2. Tartışmamızda bahsettiğimiz gibi yüksek verimlilik hedeflerini taramak. | ||
Tablo 2: Mutantların oluşturulmasıyla ilgili olası sorunlar, potansiyel nedenler ve çözümler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR / Cas9 sistemi en yaygın kullanılan gen düzenleme aracıdır ve gen threpy30, mahsul ıslahı31 ve gen fuksiyonlarının temel çalışmaları32 gibi çeşitli uygulamalara sahiptir. Bu sistem zaten çeşitli böcek türlerinde gen düzenleme için uygulanmış ve zararlılarda fonksiyonel gen çalışmaları için etkili bir araç olarak hizmet etmiştir. Burada sunduğumuz protokoller, kılavuz RNA'ların tasarımı ve sentezi, embriyoların toplanması, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştiriciliği ve mutant tarama prosedürünü standartlaştırmaktadır. Ayrıca, her adımdaki olası sorunu özetlemek için bir sorun giderme tablosu eklenmiş ve iş yükünü hafifletmek ve verimliliği artırmak için çözümleri sağlanmıştır (Tablo 2). Bu prosedür, ilgilenilen genleri düzenlemek için güvenilir bir yol sağlar ve B. dorsalis'teki fonksiyonel genomik çalışmaları geliştirir.
İlk olarak, hedef gen seçimi CRISPR / Cas9 sisteminin verimliliğini artırmak için kritik öneme sahiptir ve ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 ve CRISPR optimal hedef bulucu 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) gibi çeşitli açık kaynaklı yazılım programları otomatik olarak hedefler oluşturabilir ve potansiyel hedef dışı oranları tahmin edebilir. B. dorsalis'in yüksek doğurganlık oranı embriyo toplamayı kolaylaştırdığından, DNA ekstraksiyonu ve hedef bölgenin dizilimi için embriyoların bir kısmının feda edilmesiyle mutant oranlar tahmin edilebilir. Laboratuarda dizileme mevcut değilse, mutasyon oranlarını tahmin etmek için T7 endonükleaz I kullanılması da önerilir37. Bu üç yöntemle genomik delesyon oranları yüksek hedef bölgeler seçilebilir ve bu nedenle B. dorsalis'te gen düzenlemenin etkinliği arttırılabilir.
Embriyonun gelişim aşaması, mutasyonların kalıtsal olup olmayacağını belirler. Kalıtsal mutasyonları elde etmek için, germ hücrelerinde gen düzenlemesi yapılmalıdır. Genel olarak, sgRNA ve Cas9 karışımı, kutup hücresi oluşumu gerçekleştikten sonra germ hücrelerine verilemez. B. dorsalis'te, kutup hücresi oluşumu yumurtlamadan 3 saat sonra3 saatte meydana gelirken, B. dorsalis için burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, embriyo toplanmasından mikroenjeksiyonun sonuna kadar 30 dakika sürer. Enjeksiyon sırasında, embriyonun vejetal ucunda neredeyse hiç kutup hücresi oluşmaz; bu nedenle, G0'da elde edilen gen mutasyonları verimli bir şekilde kalıtsal olmalıdır. Mikroenjeksiyonun harcadığı süre de daha önce yayınlanmış makalelerde bahsedilen yöntemden daha azdır (genellikle 1-3 saat)18,19.
Embriyo toplama ve taşıma işlemi sırasında mekanik veya kimyasal hasarı en aza indirmek önemlidir. Enjeksiyon plakasındaki embriyoları nazikçe hizalamak için ince bir fırça kullanın. Enjeksiyonun pozisyonu daha önce Drosophila'da (Yöntemler - Nicolas Gompel'in laboratuvarı, http://gompel.org/methods) ve Ceratitis capitata39'da yapılan çalışmaları yansıtmalıdır. Embriyoları bitkisel kutba enjekte edin; iğneyi asla hayvan direğine sokmayın. İğneyi mikropipet çektirme kılavuzunu izleyerek hazırlayın; İğnenin açılması, aşırı sitoplazmik geri akışı önlemek için mümkün olduğunca küçük olmalıdır. B. dorsalis'te yayınlanan çalışmalarda bahsedilen yöntem genellikle embriyoları sodyum hipokorit17,18,19 ile dekoriyonize etti; bu kimyasal hasara neden olabilir ve embriyoların hayatta kalma oranlarını azaltabilir. Bu protokolde, embriyolar dekoriyonize edilmez ve enjeksiyon hala iyi çalışır. Embriyolara kimyasal hasar minimum düzeyde olabilir.
Enjeksiyon sonrası böcek yetiştiriciliği çok önemlidir. Burada sağlanan standartlaştırılmış yetiştirme protokolü, diğer meyve sineği türlerinin, özellikle de Bactrocera türlerinin yetiştirilmesi için bir referans görevi görebilir. Embriyolar, kendi kendine yapılan enjeksiyon plakamızı kullanarak enjeksiyon sırasında kurumayı önlemek için yağa batırılabilir. G0'da% 50'nin üzerinde hayatta kalma oranlarına ulaşmak için larvaların yağda geçirdiği zamanı (<2 saat) en aza indirin.
Mutant tespiti için invaziv olmayan bir genomik DNA ekstraksiyonu yöntemi önerilir. Örneğin, bazı lepidopteran araştırmacılar, son instar larvalarının eksüviatlarının daha fazla genotipleme için genomik DNA'yı çıkarmak için kullanılabileceğini öne sürmektedir. B. dorsalis için, invaziv olmayan bir yöntem, taze bir puparyumdan genomik DNA'nın çıkarılmasını içerir. Bir belirteç genini ve ilgilenilen geni hedef alan çoklu sgRNA'ların enjeksiyonu da mutantların tanımlanmasını iyileştirebilir. Örneğin, göz rengini (kmo) ve juvenil hormon reseptörünü (Met) hedef alan birlikte enjekte edilen sgRNA'lar, sivrisineklerde çift mutasyonlu yavruların% 75'ini üretebilir. Met mutantları, larvaların göz rengine göre önceden tarandı37. Bu, CRISPR / Cas9 sistemini kullanarak bu böcek türünde gen düzenlemenin etkinliğini daha da artırmak için gelecekte B. dorsalis'te değerlendirilmelidir.
Sonuç olarak, CRSIPR/Cas9 sistemi B. dorsalis'te fonksiyonel genomikte güçlü bir araçtır. Ayrıntılı protokollerimiz, araştırmacıların verimli embriyo toplama, larvaların ideal hayatta kalma oranları ve istenen düzenleme verimliliğini elde etmelerine yardımcı olacak yararlı bilgiler sağlar. Bu, araştırmacıların B. dorsalis'te mutagenezi elde etmelerine yardımcı olmanın basit ve hızlı bir yolu olabilir. Bu teknik, ölümcül genlerin fonksiyonel çalışmalarında uygulanamamıştır, çünkü kalıtsal mutasyonlar başarılı melezlemelere ihtiyaç duyar. Gelecekteki çalışmalar, bu sınırlamayı aşmak için evre veya dokuya özgü CRISPR elemanlarını ifade etmek için transgenik araçlar geliştirmeye odaklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Shenzhen Bilim ve Teknoloji Programı (Hibe No. KQTD20180411143628272) ve Shenzhen Dapeng Yeni Bölgesi'nin bilim teknolojisi inovasyonu ve endüstriyel gelişimi için özel fonlar (Hibe No. PT202101-02) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
