Summary
这是秀 丽隐杆线虫 性腺解剖后冷冻裂纹的常用方法，该方法通过抗体染色 产生 用于免疫荧光的种系样本，或用于简单的DAPI染色以可视化DNA。该协议对于研究实验室和基于课程的本科生研究经验的本科生来说是成功的。
Abstract
秀丽隐杆线虫种系是研究减数分裂的绝佳模型，部分原因是易于对解剖动物进行细胞学分析。整个支架制剂保留了减数分裂细胞核的结构，重要的是，每个性腺臂都包含减数分裂的所有阶段，按时间空间进展组织，便于识别不同阶段的细胞核。成年雌雄同体有两个性腺臂，每个臂组织成一个封闭的管子，远端封闭端有增殖的种系干细胞，近端开口端有细胞化的卵母细胞，它们在子宫的中心连接。解剖从体腔释放一个或两个性腺臂，使整个减数分裂可见。在这里，提出了针对目标蛋白质的免疫荧光的通用方案，然后进行DAPI染色以标记所有染色体。年轻人被固定在左旋咪唑中，并使用两个注射器针头快速解剖。种系挤出后，样品在液氮中经历冷冻裂纹之前固定，这有助于透化角质层和其他组织。然后将样品在乙醇中脱水，再水化，并与一抗和二抗一起孵育。将DAPI添加到封片剂中的样品中，这样可以可靠地可视化DNA，并易于找到动物在荧光显微镜下成像。熟悉处理秀丽隐杆线虫的人在练习解剖方法本身几个小时后很容易采用这种技术。该协议已教授给在研究实验室工作的高中生和本科生，并纳入文理学院基于课程的本科研究经验中。
Introduction
减数分裂是用于在所有有性繁殖生物中产生配子（卵子和精子/花粉）的特殊细胞分裂1，2。交叉重组是同源染色体之间DNA的相互交换;它对减数分裂至关重要，既是遗传多样性的重要来源，又能促进基因组几代人的稳定性。在减数分裂过程中未能形成至少一个交叉的染色体将随机分离，这可能导致染色体不分离，从而产生染色体数量不正确的配子——这种情况对于产生的后代通常是致命的3.在减数分裂过程中，交叉是由程序化的双链DNA断裂诱导的4。这些断裂的一个子集将被修复为交叉，提供DNA的物理连接，称为交叉，帮助定向同源染色体，为细胞分裂5做准备。减数分裂阶段在所有真核生物中都是高度保守的，它们的染色体构象使它们易于识别。
减数分裂作为生物学的基本概念，是学生在不同的生物学课程中多次遇到的话题。他们经常在高中时介绍减数分裂染色体分离的机制，而大学水平的课程侧重于分离的细胞生物学和交叉重组的遗传影响。然而，减数分裂对于许多学生来说是一个众所周知的棘手概念1.未能理解基因，DNA，染色体和减数分裂之间的关系会产生学生的误解和理解差距，从而阻碍对基因遗传的全面理解6，7。提高学生对抽象主题的理解的一种方法是提供具体的实践活动。例如，在教授减数分裂时，教师可以选择模拟分子分析的活动8，允许学生操纵分子的3D模型9，或学生自己表演分子编排的角色扮演1。结合未知结果的研究是提高学生理解力的一种特别有效的方法。这种做法被称为基于课程的本科研究体验 （CURE），并具有加强学生态度和能动性的额外好处，特别是对于那些属于在 STEM10，11 中代表性不足的群体的人。线虫秀 丽隐杆线虫 特别适合行为、生育能力和遗传杂交的课堂研究，是向学生介绍生物学研究的有效模式12.
秀丽隐杆线虫通过将分子遗传学与简单的细胞学分析相结合，为细胞生物学制造了强大的模式生物。它也特别适合在生物教室中使用13，14，15。它们在实验室中易于维护且经济，在标准室温或最常见的孵育温度 20 °C 下每 3 天产生数百个后代。重要的是，它们可以作为甘油储备液冷冻并保存在-80°C的冰箱中，这意味着新手研究人员犯的任何饲养错误都可以轻松纠正16。此外，其注释良好的基因组允许正向和反向遗传技术17，18，允许秀丽隐杆线虫用于解决从分子到进化的生物学问题。最后，秀丽隐杆线虫研究人员创建了一个支持性的社区，通常愿意为崭露头角的科学家提供帮助和建议19。这些优点导致秀丽隐杆线虫被纳入各种类型的机构的许多CURE中12，19，20，21，22，23。
除了对研究和教学的好处外，秀丽隐杆线虫已成为研究减数分裂和种系发育的流行模型24，25，26。这些动物的光学清晰度简化了细胞学方法27，在成年动物中，性腺占动物的近一半，提供了数百个减数分裂细胞进行研究。在性腺中，减数分裂种系细胞核像装配线一样排列（图1）;有丝分裂复制发生在性腺的远端，细胞核在向性腺近端迁移时通过减数分裂阶段进行，受精胚胎从外阴中出现。由于刻板的空间组织也代表了减数分裂的时间进展，因此可以根据其染色体组织和在性腺中的位置轻松识别不同的阶段。最后，破坏减数分裂并导致非整倍体的过程会产生易于表征的表型，即使对于新手也是如此：不育、胚胎致死率或男性的高发病率（Him 表型）28。
这是一个简单的协议，用于可视化秀丽隐杆线虫中的减数分裂染色体。安装、解剖、固定和抗体染色均在同一显微镜载玻片上进行，这简化了方案并实现了近乎完美的样品回收率。该方法适用于简单的DAPI染色以可视化染色体，并可用于免疫荧光以可视化性腺中蛋白质的定位。学生使用基本的解剖显微镜解剖性腺，生成用于可视化DNA或免疫荧光的全安装制剂，并在复合荧光显微镜上成像。该协议已教授给在秀丽隐杆线虫研究实验室工作的高中生和本科生，并纳入文理学院的CURE12。尽管CURE的班级规模相对较小，但由于蠕虫菌株和试剂的成本相对较低，因此该协议适用于一系列机构的课程。讲师只会受到可供使用的解剖显微镜数量的限制。以前的实施让学生以三人为一组，共享一台显微镜，并在三个90分钟的课程中进行：第一个练习解剖，第二个实施解剖和DAPI染色，第三个在宽场荧光显微镜上成像载玻片。参与本科研究为学生11，29 提供了许多好处，包括学术和个人。通过治愈将研究嵌入课程中，允许学生在正常课堂时间参与研究11，30，31，这使得接触这些好处更容易获得和公平。
Protocol
1. 秀丽隐杆线虫 饲养
注意：有关更多详细信息，请参阅 秀丽隐杆线虫 维护协议16 和 Elgin 等人 32 。 秀丽隐杆线虫 菌株可以很容易地从 Caenorhabditis 遗传学中心（https://cgc.umn.edu）获得，并通过普通邮件运送到美国的任何地方。每个菌株的成本为10美元，每个实验室/用户支付30美元的年费。
- 使用无菌技术，制备6cm线虫生长培养基琼脂平板（NGM琼脂平板）。
注意：倾倒的板可以在4°C下倒置在其原始塑料套管或密封容器中存放数月。- 要制作NGM琼脂平板，将3克NaCl，2.5克杆菌蛋白胨，20克NGM琼脂和ddH2O添加到1L（~975毫升）中。使用在121°C下保持20分钟的液体循环高压灭菌介质。冷却至 55 °C，并使用无菌技术，加入 1 mL 胆固醇、0.5 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4 和 25 mL 1 M 磷酸钾缓冲液 （pH 6）。
注意：要制作 1 M 磷酸钾缓冲液，请混合 108.3 g KH 2 PO 4（单碱）和 35.6 g K2HPO4（二元）; 如果需要，使用 KOH 将 pH 值调节至 6。加入ddH2O至1L（通常~900mL），并在121°C高压灭菌40分钟。 1L的NGM可制成约100个板，每个板含有10mL。
- 要制作NGM琼脂平板，将3克NaCl，2.5克杆菌蛋白胨，20克NGM琼脂和ddH2O添加到1L（~975毫升）中。使用在121°C下保持20分钟的液体循环高压灭菌介质。冷却至 55 °C，并使用无菌技术，加入 1 mL 胆固醇、0.5 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4 和 25 mL 1 M 磷酸钾缓冲液 （pH 6）。
- 使用血清移液管或转移移液管，用三滴 大肠杆菌 OP50细菌培养物（~150μL）点样板。尽量在板的中心点，避免将斑点放在太靠近板边缘的位置;这将阻止动物爬上盘子的侧面并干燥。
- 细菌草坪干燥后，将斑点板在室温 （RT） 下倒置存放长达 2 周。使用前至少 1-2 天点缀板将使细菌草坪变得更厚并支持更高密度的动物。
注意：要制备OP50细菌培养物，可以从Caenorhabditis遗传学中心订购OP50。将OP50细菌从甘油原液划线到LB板上以确保单个菌落，并在4°C下保持4-6周。OP50细菌培养物在LB中于37°C从单个菌落中生长过夜 - 无需摇动。为了制备LB培养基，加入10g胰蛋白胨，10gNaCl，5g酵母提取物，950mL ddH 2 O，用10N NaOH将pH调节至7，并用ddH 2O将最终体积调节至1L.等分试样成100mL量并在121°C高压灭菌20分钟。 - 要为每个菌株创建工作储备，请在斑点 NGM 板上选择三个 L4 期雌雄同体。将板储存在15-25°C。 标准培养条件为20°C。 如果无法使用温控培养箱，请将培养物保持在室温工作台上。
注意：L4期雌雄同体可以很容易地通过大小（小于成人）和在身体中途存在一个明显的半圆（发育中的外阴）来分期。在20°C下，动物将在孵化后34-46小时（产下胚胎后约40-52小时）达到L4阶段。参见Corsi等人14 ，了解有关发育阶段时间的更多详细信息。- 将培养物转移到不同的温度以控制发育速度。动物在较高温度下生长得更快，在较低温度下生长较慢。它们将在高于25°C的温度下开始变得无菌。
注意：一些突变基因型对温度敏感，并且会根据培养温度显示不同的表型。
- 将培养物转移到不同的温度以控制发育速度。动物在较高温度下生长得更快，在较低温度下生长较慢。它们将在高于25°C的温度下开始变得无菌。
- 通过每 4 天将三个 L4 期雌雄同体挑选到新的斑点 NGM 板上来维持工作库存。这样做将确保具有广泛发育阶段的恒定，吃得饱的人群。
2.性腺夹层
- 收集年龄匹配的成虫：在解剖前12-24小时，将L4期雌雄同体挑选到新的斑点NGM板上 - 这些雌雄同体在第二天长成年轻人，非常适合解剖。L4期雌雄同体的数量将取决于正在进行的细胞学分析;通常，每张载玻片解剖 10-20 张雌雄同体，每种情况生成两到四张载玻片。
注意：性腺在喂养良好的动物中挤出最有效。一定要从未饥饿的工作库存中挑选L4雌雄同体（即，盘子上仍然存在可见的细菌草坪）。饥饿的动物往往会经历不完全的性腺挤压，使它们难以想象。- 如果评估减数分裂的后期阶段，如糖尿病，解剖老年人（L4后48小时），因为他们积累了更多的糖尿病期核，简化了分析。然而，研究人员应该注意，一些影响可能是由高龄产妇引起的。
- 准备解剖。
- 准备 M9：加入 3 克 KH 2 PO 4（单碱）、6 克钠 2 HPO4（二碱）、5 克氯化钠，并将ddH 2 O加入 100 毫升。将溶液在121°C高压灭菌20分钟，使其冷却，然后使用无菌技术加入1mL的1M MgSO4。
- 制备解剖缓冲液：混合 1 μL 10% 吐温 20、12 μL 100 mM 左旋咪唑、10 μL 10x M9 和 77 μL ddH2O。
注意：吐温20包含在解剖缓冲液中，以降低表面张力并进一步透化组织膜。 - 制备固定溶液（2% PFA [100 μL]）：混合 12.5 μL 16% 多聚甲醛 （PFA）、10 μL 10x M9 和 77.5 μL ddH2O;一定要使用新鲜的PFA安瓿（打开不超过2周）。
注意：PFA是一种危险化学品，应在通风橱中制备固定溶液。 - 设置冷冻方法-液氮更容易管理，但如有必要，可以在干冰上使用铝块。
- 液氮法：将塑料烧杯或塑料科普林罐放在聚苯乙烯盒中。用液氮填充烧杯（溢出到聚苯乙烯容器中是可以的）。将镊子放在附近。理想情况下，烧杯应足够窄，以防止显微镜载玻片完全水平下落 - 载玻片应倾斜并易于用镊子抓住。
注意：使用液氮而不是玻璃时，使用塑料容器很重要，以避免由于快速冷却而破碎。 - 干冰法：
- 将扁平铝块放在聚苯乙烯容器或矩形冰桶中的干冰上。如果块的顶部位于容器顶部上方，则更容易冻结载玻片。
- 戴上手套，轻轻按压铝块，以确保与干冰良好接触并加速冷却过程（当金属快速冷却时，它可能会发出尖叫声）。在附近放置剃须刀片。
- 在冻结裂纹停止之前，将铝块放在干冰上至少 30 分钟，以完全冷却，这是快速冷冻所必需的。
注意：理想情况下，应使用固体干冰块，这有助于表面保持水平。如有必要，可以将铝块放置在干冰颗粒上，但应注意确保表面保持水平。 - 铝块的表面会积霜，这可以防止滑块与块之间的紧密接触。使用剃须刀片刮掉表面的霜，为每个载玻片清理一个区域。用盖子盖住聚苯乙烯容器将有助于防止过多的霜冻积聚。
- 液氮法：将塑料烧杯或塑料科普林罐放在聚苯乙烯盒中。用液氮填充烧杯（溢出到聚苯乙烯容器中是可以的）。将镊子放在附近。理想情况下，烧杯应足够窄，以防止显微镜载玻片完全水平下落 - 载玻片应倾斜并易于用镊子抓住。
- 用 ~40 mL 的 95% 乙醇填充科普林罐。
- 用 ~40 mL PBS-T 填充三个科普林罐。
注意：要制作 PBS-T，请混合 100 mL 的 10x PBS、5 mL 的 Triton X-100 和 2 mL 的 0.5 M EDTA （pH 8）。加入 873 mL 的 ddH 2 O。用力摇晃以溶解Triton X-100。要制作 10x PBS，请混合 25.6 克Na2 HPO 4·7H 2 O、80 克氯化钠、2 克 KCl 和 2 克 KH2PO4。加入ddH2O以使体积达到1L.高压灭菌器在121°C下40分钟。 洗涤剂Triton X-100包含在洗涤缓冲液PBS-T中，以降低表面张力并增强整个动物在载玻片上的保留力。
- 在 18 毫米 x 18 毫米的玻璃盖玻片上解剖动物。由于解剖缓冲液的蒸发，此步骤对时间敏感。完成解剖应该不到5分钟。
注意：左旋咪唑用于固定动物，使它们更容易解剖，但将它们放在左旋咪唑中太久会导致性腺挤出不良。最简单的方法是减少每张载玻片解剖的动物数量，以便在5分钟的时间范围内适应。- 将固定载玻片放在解剖显微镜的载物台上 - 固定载玻片用于更轻松地移动盖玻片，并且可以无限期地重复使用（图2A，左图）。
- 将盖玻片放在固定载玻片的顶部，并将 4 μL 的解剖溶液移液到盖玻片的中心。将保持幻灯片移动到舞台的一侧以释放视图。
- 将10-20个雌雄同体放入解剖溶液中。选择足够的动物来成像每张载玻片~10个，但不要太多以至于它们无法在5分钟内解剖。
- 使用两个注射器针头解剖动物，每只手一个（图2A）。
- 将针尖交叉成X形，并使用X的底部将成虫固定在盖玻片的表面上。
注意：可能需要练习才能发现在角度和旋转方面握住每根针的最佳方法。首先握住针，使其斜面（倾斜边缘）朝下。有关首次学习在更大体积中解剖的建议，请参阅讨论（图 2D）。 - 将X形放在咽部后面，大约是年轻人体长的1/5，或者正好在头部的透明部分下方（图2A，右图）。
- 用一个剪刀动作将动物斩首（如用刀叉切食物）。良好的挤压将导致性腺的一个臂（或有时两个臂）与肠道的一半或两半完全释放（图2B，左图）。肠道会显得更暗且宽度均匀，而性腺会看起来很清晰，尖端远端呈锥形。
- 每只动物只能被切割一次;如果性腺在切割后没有挤出，只需移动到下一只动物身上。第一次切割显着降低了主体中的静水压力，这使得任何进一步的切割都不太可能导致更好的挤压。成像时很容易看到不完整或不良的挤出，可以忽略（图2B，右图）。
注意：不要试图将性腺与胴体分离 - 这样做通常会撕裂组织并限制可以分析的减数分裂阶段的数量。
- 每只动物只能被切割一次;如果性腺在切割后没有挤出，只需移动到下一只动物身上。第一次切割显着降低了主体中的静水压力，这使得任何进一步的切割都不太可能导致更好的挤压。成像时很容易看到不完整或不良的挤出，可以忽略（图2B，右图）。
- 对盖玻片上的剩余动物重复解剖。
- 将针尖交叉成X形，并使用X的底部将成虫固定在盖玻片的表面上。
- 用甲醛固定样品。
- 轻轻工作，将 4 μL 固定溶液移液到非常靠近动物液滴的盖玻片上。理想情况下，液滴足够接近以合并;避免直接移入解剖液滴并移位解剖的尸体。
- 用一根手指将盖玻片固定到固定载玻片上。用另一只手轻轻轻弹盖玻片几次以混合滴剂。最终固定浓度为0.8%PFA。
- 将带正电荷的载玻片正面朝下握住，用它来拾取载玻片中央的盖玻片。轻轻触摸样品液滴，液滴的表面张力将拾取盖玻片。
注意：带正电的载玻片具有静电涂层，可帮助组织粘附在表面上以防止样品损失。- 如果需要，将盖玻片对角线放置，使一个角悬挂在载玻片的顶部或底部边缘 1 毫米。留下悬垂将使冷冻后更容易将盖玻片弄掉（图2C）。
- 将载玻片放在工作台上，并在室温下固定5分钟。在此期间，用铅笔标记幻灯片。
注意：过度固定样品是很常见的，这可以通过从细胞核甚至所有组织中排除抗体来检测。此外，一些抗体对甲醛特别敏感。在这些情况下，减少固定时间，或降低所用甲醛的最终浓度。
- 冻裂
- 修复后，立即冻结幻灯片。
- 如果使用液氮：用镊子握住载玻片的标签边缘，然后将其轻轻降低到液氮中。松开载玻片，使其靠在烧杯的侧面，盖玻片面朝上。载玻片在10秒内冷冻（一旦液体停止沸腾）。
- 如果使用干冰：用剃须刀刮掉铝块表面的霜。牢固地握住载玻片的标记边缘并将其放在清除的表面上，向下施加一些压力以确保与块完全接触。盖玻片应完全在块表面上。冻结发生在10秒内，当盖玻片下的样品变成冰时，可以目视确认。
- 对于这两种方法，将载玻片放置至少5分钟以完全冻结。
注意：一旦冷冻，载玻片可以在液氮或块上放置15-20分钟，只要它们保持冷冻状态。这允许在此阶段收集多个载玻片，然后再进行开裂步骤。
- 快速工作，从样品上打开盖玻片。此步骤对时间敏感。在样品开始解冻之前，取下盖玻片并将载玻片浸入乙醇中。
- 取出冷冻载玻片（使用镊子液氮）。
- 牢牢抓住载玻片贴有标签的短边，并将一个长刃支撑在工作台上。
- 用另一只手牢牢握住剃须刀，然后将剃须刀的边缘滑下载玻片，将盖玻片从样品上轻弹下来并远离样品。如果盖玻片的位置有角悬垂，则此步骤稍微容易一些（图2C）。
- 修复后，立即冻结幻灯片。
- 立即将载玻片放入室温下含有95%乙醇的Coplin罐中，将载玻片置于乙醇中至少5分钟。
注意：载玻片可以在乙醇中放置一段时间 - 这允许在继续洗涤之前在此步骤中收集多个载玻片。玻片也可以在此步骤中存储数天。如果储存，将乙醇中的Coplin载玻片罐移至-20°C。 - 在PBS-T中洗涤载玻片三次，每次在室温下洗涤5分钟。 每次洗涤使用新鲜的PBS-T。
- 如果用抗体染色，请继续执行步骤3（抗体染色）。如果仅用DAPI染色以可视化染色体，请继续执行步骤4（安装和成像）。
3. 抗体染色
- 一抗孵育
注意：在为新抗体制定适当的条件时，重要的是要包括以下阴性对照以验证荧光信号的特异性：1）缺乏一抗且仅具有二抗的载玻片;2）仅具有一抗且缺少二抗的载玻片。这些阴性对照中的每一个都应该产生完全缺乏信号。如果在仅二抗载玻片上检测到荧光，则应增加二抗稀释度或使用不同的二抗稀释度。如果在仅一抗载玻片上鉴定出荧光，则可能是由于自发荧光或其他潜在污染物。- 在抗体稀释缓冲液（50 mg BSA + 50 μL 10% 叠氮化钠 + 10 mL PBS-T ）中稀释一抗 - 准备足够的抗体稀释液以每张载玻片使用 20-30 μL。
- 准备一个潮湿的房间：用湿纸巾在塑料容器的底部用密封盖子排列。在纸巾上铺一层玻璃巴斯德移液管。这些移液器形成一个表面，使载玻片保持水平，并使它们从纸巾上抬高。
注意：对于潮湿的房间，最好使用带卡扣盖的塑料食品储存容器，这样可以更轻松地打开和关闭容器，而不会破坏内部的载玻片。寻找一个足够长的巴斯德移液管，但也有一个相对平坦的底部，没有压痕，以使载玻片完全水平放置。 - 从最终的PBS-T洗涤中取出载玻片。从这一步开始快速工作，以始终保持样品湿润并避免蒸发。如果样品变干，抗体染色将受到负面影响。
- 使用折叠成紧凑矩形的擦拭纸巾擦干载玻片的整个表面。擦拭载玻片的正面和背面，但在样品周围留出足够的空间。干燥样品附近的表面时要特别小心 - 避免离样品太近，这会留下一个大约盖玻片大小的区域未干燥。但是，请确保样品的周边干燥以进行下一步。
- 使用疏水性PAP笔在样品周围画一个圆圈。小心包围整个样品区域，但避免破坏载玻片表面上可见的动物尸体。等待~5秒以使屏障完全干燥。
注意：疏水屏障是包含一抗溶液所必需的，因为载玻片的表面已涂有PBS-T，其中含有洗涤剂。PAP笔在干燥的载玻片表面上效果最好，因此在样品周围创建一个干燥的周边非常重要。在此步骤中，保持最靠近样品的区域不干燥可保护样品 - 快速工作，使用折叠擦拭纸巾的角落或边缘将液体从疏水屏障内的样品中吸走。注意避免破坏动物尸体。
- 立即将 20 μL 一抗溶液移液到疏水屏障形成的环中。注意以一定角度轻柔移液，以防止破坏胴体。避免直接移液到任何胴体上。
- 轻轻倾斜载玻片，以确保疏水屏障内的整个表面被溶液覆盖。
注意：疏水屏障最好具有 1-1.5 cm 的内部周长，该内周长被 20 μL 抗体溶液完全覆盖。圆周宽度将取决于在冷冻裂纹步骤中胴体的分布方式。更宽的屏障可能需要更大量的抗体溶液。如果需要，可以将小方块的封口膜（切割成18 mm x 18 mm盖玻片的大小）轻轻地放在样品顶部。封口膜方块将确保抗体溶液覆盖整个样品，也有助于防止蒸发。 - 对幻灯片的其余部分重复步骤 3.1.3-3.1.8。
- 小心地将载玻片转移到潮湿的室中，确保溶液保持在疏水屏障内，并且载玻片完全水平放置。
- 根据抗体的不同，通过将潮湿室保持在冷藏室或冰箱中，可以将此步骤缩短至6小时或在4°C下过夜。
注意：使用潮湿的室和疏水屏障通常足以防止抗体溶液蒸发，即使对于长时间的过夜孵育也是如此。但是，如果蒸发被证明是一个问题，则可以在每个样品上轻轻放置小方块的封口膜，这将有助于防止蒸发。这些可以在第一个洗涤步骤中去除：将每个载玻片浸入装有PBS-T（不含其他载玻片）的Coplin罐中，并让封口膜漂浮在样品上。从 Coplin 罐中取出封口膜，然后使用相同的罐子从下一张幻灯片中取出封口膜。
- 在含有~40mL PBS-T的Coplin罐中洗涤载玻片三次，每次室温5分钟。 每次洗涤使用新鲜的PBS-T。
- 在这些洗涤过程中，将二抗稀释在抗体稀释缓冲液中。准备足够的抗体稀释液，每张载玻片使用 20-30 μL。通常使用以1：200稀释的Alexa Fluor偶联二抗。
- 二抗孵育
- 从最终的PBS-T洗涤中取出载玻片。从这一步开始快速工作，以始终保持样品湿润并避免蒸发。
- 用折叠的擦拭纸擦干载玻片。避免干燥疏水屏障所包含的区域。
- 快速工作，使用折叠擦拭纸巾的角落或边缘将液体从疏水屏障内的样品中吸走。注意避免破坏动物尸体。
- 立即将 20 μL 二抗溶液移液到疏水屏障产生的环中。注意以一定角度轻柔移液，以防止破坏胴体。
- 避免直接移液到任何胴体上。确保疏水屏障内的整个表面都被溶液覆盖。更宽的屏障周长可能需要更大量的抗体溶液。如果需要，用一小块封口膜覆盖样品（参见步骤3.1.8下面的注释）。
- 小心地将载玻片转移到潮湿的腔室中，确保溶液保持在疏水屏障内，并且载玻片完全水平。盖上潮湿室的盖子，使载玻片保持在黑暗中。
- 对幻灯片的其余部分重复步骤 3.3.1-3.3.6。
- 在室温下在黑暗中孵育4小时。
注意：根据抗体的不同，此步骤可以缩短至2小时或延长至6小时。如果潮湿的房间不暗，请将其放在抽屉中或用纸板箱盖住。或者，可以将潮湿的腔室包裹在铝箔中，以使载玻片处于黑暗中。
- 在含有~40mL PBS-T的Coplin罐中洗涤载玻片三次，每次室温5分钟。 每次洗涤使用新鲜的PBS-T。
4. 安装和成像
- 准备安装样品，将封片剂 + DAPI （2 μg/mL）、18 mm x 18 mm 玻璃盖玻片和指甲油触手可及。
- 从最后的洗涤中取出载玻片，然后用折叠的擦拭纸擦干。避免干燥疏水屏障所包含的区域。
- 使用折叠的擦拭纸巾的一角，小心地将屏障内样品中的液体吸走。在此步骤中去除大部分液体，但不让胴体完全变干。
- 快速工作，向样品中加入 8 μL 封片剂。轻轻地以一定角度移液，以防止破坏胴体。避免直接在胴体上移液。
- 仍然快速工作，小心地将玻璃盖玻片放到样品上。
- 气泡会破坏成像并导致样品降解。为了尽量减少气泡，请将盖玻片的一个边缘放在样品旁边的载玻片上，使其保持在样品的对角线上。将盖玻片的较高边缘放在铅笔或镊子上会有所帮助。然后慢慢降低盖玻片的较高边缘 - 这种运动允许安装介质形成从一个边缘到另一个边缘的液体密封。
- 对幻灯片的其余部分重复步骤 4.2-4.5。
- 用指甲油密封盖玻片。注意避免按下盖玻片（这会压碎样品）或水平移动盖玻片（这会弄脏样品）。
- 在盖玻片的每个角（~1毫米宽）上添加一小点指甲油。这些将有助于将盖玻片固定到位。让圆点完全干燥。
- 当角落完全干燥时，用指甲油密封边缘。确保抛光剂完全填充盖玻片和载玻片之间的间隙，但避免过多地覆盖盖玻片样品。最好在盖玻片上保持 1 毫米的重叠。仅根据需要使用尽可能多的指甲油。避免使用过多或过多的抛光剂，这可能需要很长时间才能干燥，并有损坏显微镜物镜的风险。
注意：最好使用彩色指甲油而不是透明指甲油，这样可以更容易看到海豹的边界，并有助于防止对位于指甲油边界下的动物进行成像。 - 成像前让指甲油完全干燥。此步骤很重要，因为湿指甲油会严重损坏显微镜物镜。
注意：从现在开始，幻灯片应尽可能保持在黑暗中。当它们在长凳上干燥时，使用扁平纸板箱盖住它们。
- 在成像前将载玻片在4°C的黑暗中储存1-2周。如果需要，将载玻片在-20°C下存放更长时间。
- 使用标准荧光复合光学显微镜的图像。
- 对于每张载玻片，首先，在DAPI通道中以10倍的速度检查整个样品，以识别挤出良好的性腺并注意其位置。对于大多数应用，避免对任何被切断、不完整或部分被动物另一部分覆盖的性腺进行成像。对于大多数动物来说，只有一个性腺臂会被完全挤压和可见。
注意：在DAPI通道中以整个性腺的10倍拍摄较低放大倍率的图像可能会有所帮助，以便以后定向或识别特定细胞核的位置。 - 根据应用的不同，可以以 40x、63x 或 100x 拍摄图像。如果要捕获整个性腺，请创建具有重叠边界的蒙太奇。成像时，请记住性腺是一个空心管，细胞核在顶部和底部最密集。
- 对于每张载玻片，首先，在DAPI通道中以10倍的速度检查整个样品，以识别挤出良好的性腺并注意其位置。对于大多数应用，避免对任何被切断、不完整或部分被动物另一部分覆盖的性腺进行成像。对于大多数动物来说，只有一个性腺臂会被完全挤压和可见。
Representative Results
DAPI与DNA紧密结合，即使在各种条件下，其染色也很稳健（图3A，B）。它应该存在于所有细胞核中，因此对载玻片上是否存在任何蠕虫组织以及在显微镜上检测荧光的能力进行有效的阳性对照。当抗体存在于减数分裂细胞核内时，染色是有效的（图3A，B）。例如， 图3A，B 显示了用DAPI染色的中厚皮细胞核和靶向RAD-51的抗体，RAD-51是双链断裂的标志物。KLE-2是凝聚蛋白的成分，凝聚蛋白是一种高度保守的蛋白质复合物，可构建染色体以准备有丝分裂和减数分裂。 kle-2/+ 突变体在染色体结构上具有轻微缺陷，如轻微无序的 DAPI 染色和双链断裂数的增加所反映的 RAD-51 病灶数量增加（图 3B）。免疫荧光的一个常见错误是将样品留在固定溶液中的时间过长。过度固定会导致染色不成功，因为它通常会阻止抗体扩散到细胞核中。当抗体扩散在性腺的细胞质区域，但似乎被排除在细胞核之外时，可以识别出这个错误。
在种系中（图1），细胞核在远端有丝增殖，在过渡区进入减数分裂，并通过厚皮（通常被许多细胞核行分为三个相等的阶段）进展，然后进入二普洛汀，最后进入diakinesis。卵母细胞根据它们与精子的接近程度进行编号，其中-1卵母细胞最靠近精子，-2卵母细胞是下一个远端，依此类推。 秀丽隐杆线虫 有六条染色体，在透视核中表现为紧凑的椭圆形。它们中的每一个都代表一对由交叉（也称为二价）结合在一起的两个姐妹染色单体的同源（图3C）。像 spo-11这样破坏交叉形成的突变体将无法形成交叉;因此，Dikinesis细胞核将有12个独立的DAPI体（也称为单价体），每个姐妹染色单体一个（图3D）。
图1：种系细胞核以时空方式排列，代表它们通过减数分裂的进展 。 （A）用DAPI染色的全安装年轻成年雌雄同体。勾勒出性腺和减数分裂阶段，从远端尖端（星号）到近端区域（-1卵母细胞，用箭头表示），其中包含精子（三角形）。比例尺代表100μm。 （B）用DAPI染色的解剖雌雄同体性腺的投影荧光图像。表示减数分裂阶段，代表性细胞核以插图显示（所有插图都显示为彼此缩放）。根据细胞核在种系中的位置和特征染色体形态，可以很容易地分期，从远端的有丝分裂区（星号）发展到过渡区，通过厚皮烯、双普洛汀和透析。精子由三角形标记。该数字改编自Hillers等人，许可为CC BY 3.028。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：解剖设置演示 。 （A）解剖过程中的显微镜载物台。在放置在固定载玻片上的盖玻片上的 4 μL 解剖溶液中解剖动物，用于将盖玻片移入视野。该图显示了理想的针头位置。针头的斜边朝下，交叉在咽部区域。粉红色箭头展示了针的剪刀状运动。粉红色虚线表示理想的切割位置。（B）解剖动物的图像，包括完全挤压和不完全挤压的示例。挤出的性腺和内脏的部分被标记。（C） 显示冻结裂纹步骤的图像。载玻片应一只手牢牢握住，盖玻片侧背对身体。对面的边缘支撑在板凳上。剃须刀应握在另一只手上。粉红色箭头指示剃须刀将盖玻片从载玻片上甩开的移动方向，稍微转动一下，使盖玻片从身体上甩开。请注意，盖玻片的位置使得一个角悬挂在载玻片的长边缘上。（D）玻璃胚胎染色皿中解剖实践的设置图像。将动物置于50-200μL的解剖溶液中，这消除了蒸发问题并延长了解剖时间。 请点击此处查看此图的大图。
图3：种系细胞核的代表性荧光结果。 （A，B） 在 （A） 野生型和 （B） kle-2/+ 杂合子中用 RAD-51 抗体（绿色）和 DAPI（红色）染色的晚期厚皮烯细胞核的 Z 堆栈投影。（中，四）在 （C） 野生型（具有 6 个 DAPI 染色体）和 （D） spo-11 突变体（具有 12 个 DAPI 染色体）中用 DAPI 染色的单个 diakinesis 细胞核的 Z 堆栈投影。比例尺代表 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
有性生殖需要产生单倍体配子，单倍体配子是通过减数分裂的特殊细胞分裂 产生的 。 秀丽隐杆线虫 由于其光学透明性、方便的种系解剖结构和强大的遗传学而成为减数分裂细胞学研究的流行模型28.评估生育力和胚胎致死性的简单有机体实验可以与分子遗传学相结合，以解决实验室或课堂上的许多问题。例如，由于交叉对于适当的染色体分离至关重要，因此破坏其形成或分辨率的过程将产生非整倍体配子。反过来，非整倍性导致无法存活的后代，这可以通过计数后代或通过稍微复杂的确定胚胎致死率的方法轻松评估。在细胞学上，缺乏交叉会影响在运动过程中观察到的DAPI染色小体的数量。DAPI染色的稳健性和易于评分使其成为教授细胞学技术的理想实验。雌雄同体种系中细胞核的时空布局提供了减数分裂每个阶段在某一时刻的快照。细胞核从种系的远端有丝分裂端到近端大约需要54小时（例如，参见Jaramillo-Lambert等人33，Stamper等人34 和Libuda等人35）。这种既定的减数分裂进展时间允许脉冲追逐标记或DNA损伤实验。
由于DAPI染色几乎总是有效，因此它可以作为荧光显微镜的有用技术对照（并且可以为接受培训的显微镜学家提供满意度）。抗体染色的可变性可能更大，是重复之间重现性的良好衡量标准。 秀丽隐杆线虫 性腺可能难以始终如一地固定，因为这一步需要在保留染色体结构和允许足够的抗体扩散之间取得平衡。用甲醛固定可以最好地保留染色体形态，用多聚甲醛安瓿制备新鲜甲醛提供了最可重复的结果。也可以使用由福尔马林（37%甲醛和甲醇水溶液）制备的甲醛。每种抗体的固定强度和时机可能需要根据经验确定。替代方法包括在步骤2.4中跳过甲醛固定，并在冷冻裂解后，在-20°C下浸入100%乙醇中，或浸入100%甲醇中10分钟，然后在-20°C下浸入100%丙酮中10分钟。 这些固定条件允许更好的抗体渗透，但会对组织形态产生负面影响（染色体看起来会膨胀和浮肿）。
时间对于步骤 2 中概述的解剖和修复步骤非常重要。由于解剖液的体积非常小，蒸发会影响最终的固定浓度，从而导致抗体染色不一。经验丰富的 秀丽隐杆线虫 处理人员可以在从开始（步骤2.3）到修复（步骤2.4）的不到2分钟内准备一张幻灯片。主要的技术障碍是能够将动物挑选到解剖液中并快速解剖它们。学习如何进行大体积解剖会更容易。新学员首先将动物挑选到玻璃胚胎染色皿中的 50-200 μL 解剖溶液中（图 2D）;在确定理想的针头位置以实现良好的性腺挤出时，较宽的表面提供了更大的回旋余地，而较大的液体体积使蒸发问题更少。一旦对解剖的动作感到满意，学员就开始在培养皿中仅使用 50 μL 进行解剖，然后切换到在载玻片上以 20 μL 进行解剖。在载玻片上解剖后，受训者可以快速开始减少溶液量，直到他们在 4 μL 中工作的速度足够快，蒸发可以忽略不计。
如果解剖时间仍然存在问题，受训者可以在步骤2.3中解剖8 μL的解剖溶液。然后，在步骤2.4中，他们可以加入8 μL固定溶液，轻轻移液以彻底混合（密切观察以确保胴体不会被破坏或移走），并从混合溶液中取出8 μL。这种替代方法将产生相同的8 μL最终体积和相同的最终固定浓度;该体积对于确保胴体在步骤2.5中的冷冻裂纹期间接触盖玻片和载玻片表面非常重要。如果即使在较大的解剖体积中，准备每张载玻片的时间仍然是一个问题，则Gervaise和Arur26描述了种系免疫荧光方案的悬浮方法。
使用免疫荧光原 位 可视化蛋白质的主要限制是靶向特定目标蛋白质的一抗的可用性。但是，如果已经设计了蛋白质的标记版本，则可以调整该协议以可视化蛋白质标签。靶向常见标签的抗体，如FLAG、HA或GFP，是常见的。像GFP这样的荧光标签通常可以通过固定步骤淬灭，因此建议使用靶向GFP的一抗，而不是依赖天然荧光信号本身。该协议的另一个限制是它在单个时间范围内捕获种系（尽管卵子发生的所有阶段都将在种系中表示）。因此，这种技术可能会错过卵母细胞通过卵子发生过程中可能发生的动态变化。然而，配子发生的时机已经在 秀丽隐杆线虫中得到了很好的研究;在野生型年轻成人中，卵母细胞从种系的远端尖端（有丝分裂区）进展到diakinesis 33大约需要60小时。因此，脉冲追逐或特定干预（如照射）后的时间过程将允许观察减数分裂不同阶段的效果。
总之，该协议描述了 秀丽隐杆线虫 性腺解剖，然后进行DAPI和用于荧光显微镜的抗体染色。解剖和固定（步骤2）需要60-90分钟，具体取决于生成的载玻片数量。抗体染色（步骤3）大多无需人工干预，根据抗体孵育时间，至少7小时至1.5天不等。安装（步骤4.1-4.7）大约需要15分钟。如果存在抗体或荧光标签试剂，这种可视化种系染色体和性腺的一般方法可用于任何蛋白质的细胞学研究。在最简单的形式中，diakinesis细胞核的DAPI染色可用于筛选影响减数分裂重组的因素。当与后代数量、雄性发病率（Him表型）和胚胎致死率的生物体分析相结合时，这种细胞学方法为基于群体的分析提供了单细胞对应。
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。本稿件中的内容完全由作者负责。它不一定代表美国国立卫生研究院或国家科学基金会的官方观点。
Acknowledgments
Lee实验室的工作得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（奖励号为1R15GM144861）和国家儿童与人类发展研究所（奖励号为1R15HD104115）的支持。DA得到了UML肯尼迪科学学院科学学者计划的支持。NW得到了UML荣誉学院奖学金和UMLSAMP奖学金（由国家科学基金会资助，资助号HRD-1712771）的支持。我们感谢 A. Gartner 提供的 RAD-51 抗体。所有 秀丽隐杆线虫 菌株均由 Caenorhabditis 遗传学中心提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施计划办公室资助，奖励号为P40 OD010440。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
| Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
| Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
| BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
| C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
| C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
| C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
| Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
| Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
| Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
| Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
| Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
| NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
| Parafilm | Bemis | 16 101 | |
| Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
| Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
| Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
| Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
| Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
| Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
| Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
| Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
| Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
| Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |
References
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