Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

C. elegans Gonaddisseksjon og frysesprekk for immunfluorescens og DAPI-farging

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Massachusetts Lowell
* These authors contributed equally

Summary

Dette er en vanlig metode for C. elegans gonad disseksjon etterfulgt av fryse sprekk, som produserer germline prøver for immunfluorescens via antistofffarging, eller for enkel DAPI farging for å visualisere DNA. Denne protokollen har vært vellykket for studenter i et forskningslaboratorium og i en kursbasert grunnforskningserfaring.

Abstract

C. elegans germline er en utmerket modell for å studere meiose, delvis på grunn av det enkle å gjennomføre cytologiske analyser på dissekerte dyr. Hele monteringspreparater bevarer strukturen til meiotiske kjerner, og viktigere, hver gonadarm inneholder alle stadier av meiose, organisert i en temporal-romlig progresjon som gjør det enkelt å identifisere kjerner på forskjellige stadier. Voksne hermafroditter har to gonadarmer, hver organisert som et lukket rør med prolifererende germline stamceller i den distale lukkede enden og cellulariserte oocytter i den proksimale åpne enden, som går sammen i midten ved livmoren. Disseksjon frigjør en eller begge gonadarmene fra kroppshulen, slik at hele meiose kan visualiseres. Her presenteres en felles protokoll for immunfluorescens mot et protein av interesse, etterfulgt av DAPI-farging for å markere alle kromosomer. Unge voksne immobiliseres i levamisol og dissekeres raskt ved hjelp av to sprøytespisser. Etter germline ekstrudering blir prøven løst før den gjennomgår en frysesprekk i flytende nitrogen, noe som hjelper til med å permeabilisere neglebåndet og andre vev. Prøven kan deretter dehydreres i etanol, rehydreres og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. DAPI legges til prøven i monteringsmediet, noe som muliggjør pålitelig visualisering av DNA og gjør det enkelt å finne dyr å avbilde under et fluorescerende mikroskop. Denne teknikken er lett vedtatt av de som er kjent med håndtering av C. elegans etter noen timer brukt på å praktisere disseksjonsmetoden selv. Denne protokollen har blitt undervist til videregående skoleelever og studenter som arbeider i et forskningslaboratorium og innlemmet i en kursbasert grunnforskningserfaring ved en liberal arts college.

Introduction

Meiose er den spesialiserte celledelingen som brukes til å lage kjønnsceller (egg og sæd/pollen) i alle seksuelt reproduserende organismer 1,2. Crossover rekombinasjon er gjensidig utveksling av DNA mellom homologe kromosomer; Det er viktig for meiose, både å gi en viktig kilde til genetisk mangfold og fremme genomstabilitet gjennom generasjoner. Kromosomer som ikke klarer å danne minst en crossover under meiose, vil segregere tilfeldig, noe som kan resultere i kromosom nondisjunction, og skape gameter med feil antall kromosomer - en tilstand som vanligvis er dødelig for resulterende avkom3. Under meiose induseres crossovers av programmerte dobbeltstrengede DNA-brudd4. En delmengde av disse pausene vil bli reparert som crossovers som gir fysiske koblinger av DNA, kalt chiasmata, som hjelper til med å orientere homologe kromosomer som forberedelse til celledeling5. Meiotiske stadier er svært konservert over alle eukaryoter, og deres kromosomale konformasjon gjør at de lett kan identifiseres.

Som et grunnleggende konsept i biologi er meiose et tema som studentene møter flere ganger i ulike biologikurs. De blir ofte introdusert til mekanikken i meiotisk kromosomsegregering i videregående skole, mens kurs på høyskolenivå fokuserer på cellebiologi av segregering og den genetiske effekten av crossover-rekombinasjon. Meiose er imidlertid et notorisk vanskelig konsept for mange studenter1. En manglende forståelse av forholdet mellom gener, DNA, kromosomer og meiose kan generere student misforståelser og hull i forståelse som hindrer en full forståelse av genetisk arv 6,7. En måte å forbedre studentens forståelse av abstrakte emner er å gi konkrete, praktiske aktiviteter. For eksempel, når de underviser i meiose, kan instruktører velge mellom aktiviteter som emulerer molekylær analyse8, 3D-modeller som lar elevene manipulere molekyler9, eller rollespill der studentene selv spiller ut molekylær koreografi1. Å inkorporere forskning med ukjente utfall er en spesielt effektiv måte å forbedre studentforståelsen på. Denne praksisen er kjent som en kursbasert grunnforskningserfaring (CURE) og har den ekstra fordelen av å styrke studentenes holdninger og handlefrihet, spesielt for de som tilhører grupper som fortsatt er underrepresentert i STEM10,11. Nematodeormen Caenorhabditis elegans er spesielt egnet for klasseromsstudier av atferd, fruktbarhet og genetiske kryss, og er en effektiv modell for å introdusere studenter til biologisk forskning12.

C. elegans lager en kraftig modellorganisme for cellebiologi ved å kombinere molekylær genetikk med enkel cytologisk analyse. Det er også spesielt godt egnet for bruk i en biologi klasserom 13,14,15. De er enkle og økonomiske å vedlikeholde i et laboratorium, og produserer hundrevis av avkom hver 3. dag, både ved standard romtemperatur eller ved 20 ° C, den vanligste inkubasjonstemperaturen. Det er viktig at de kan fryses som glyserollagre og oppbevares i en fryser på -80 °C, noe som betyr at eventuelle oppdrettsfeil gjort av nybegynnere lett kan korrigeres16. Videre tillater det godt kommenterte genomet fremover og reverserer genetiske teknikker17,18, slik at C. elegans kan brukes til å løse biologiske spørsmål som spenner fra molekylær til evolusjonær. Endelig har C. elegans forskere skapt et støttende samfunn som ofte er villig til å gi hjelp og råd til spirende forskere19. Disse fordelene har ført til at C. elegans har blitt innlemmet i en rekke CUREs ved ulike typer institusjoner 12,19,20,21,22,23.

I tillegg til fordelene for forskning og undervisning, har C. elegans blitt en populær modell for studier av meiose og germline utvikling24,25,26. Den optiske klarheten til disse dyrene forenkler cytologiske tilnærminger27, og hos voksne representerer gonader nesten halvparten av dyret, og gir hundrevis av meiotiske celler å studere. I gonader er meiotiske kimlinjekjerner arrangert som et samlebånd (figur 1); Mitotisk replikasjon skjer ved den distale spissen av gonaden, med kjerner som utvikler seg gjennom meiotiske stadier når de migrerer mot den proksimale enden av gonaden, hvor befruktede embryoer kommer fra vulva. Fordi den stereotype romlige organisasjonen også representerer en tidsmessig progresjon gjennom meiose, kan forskjellige stadier lett identifiseres basert på deres kromosomale organisasjon og plassering i gonaden. Til slutt skaper prosesser som forstyrrer meiose og forårsaker aneuploidi fenotyper som er enkle å karakterisere, selv for nybegynnere: sterilitet, embryonal dødelighet eller høy forekomst av menn (Him fenotype)28.

Dette er en enkel protokoll for å visualisere meiotiske kromosomer i C. elegans. Montering, disseksjon, festing og antistofffarging utføres alle på samme mikroskopglid, noe som forenkler protokollen og tillater nesten perfekt prøvegjenoppretting. Denne metoden fungerer for enkel DAPI-farging for å visualisere kromosomer og kan brukes til immunfluorescens for å visualisere lokalisering av proteiner i gonaden. Studentene dissekerer gonader ved hjelp av grunnleggende dissekeringsmikroskoper, genererer helmonterte preparater for visualisering av DNA eller immunfluorescens, og avbilder dem på et sammensatt fluorescerende mikroskop. Denne protokollen har blitt undervist til videregående studenter og studenter som arbeider i et C. elegans forskningslaboratorium og innlemmet i en CURE på en liberal arts college12. Selv om CURE hadde en relativt liten klassestørrelse, ville denne protokollen være egnet for klasser ved en rekke institusjoner på grunn av den relativt lave prisen på ormstammer og reagenser. Instruktører vil bare være begrenset av antall dissekeringsmikroskoper som er tilgjengelige for bruk. Den forrige implementeringen hadde studenter som jobbet i grupper på tre for å dele et enkelt mikroskop og fant sted over tre 90-minutters økter: den første til å øve disseksjon, den andre til å implementere disseksjon og DAPI-farging, og den tredje til bildelysbilder på et bredfeltfluorescensmikroskop. Deltakelse i grunnforskning gir mange fordeler for studenter11,29, både faglig og personlig. Embedding forskning i kurs via CUREs tillater elevene å delta i forskning i løpet av normal klassetid11,30,31, noe som gjør eksponering for disse fordelene mer tilgjengelig og rettferdig.

Protocol

1. C. elegans husdyrhold

MERK: Se C. elegans vedlikeholdsprotokoll16 og Elgin et al.32 for flere detaljer. C. elegans stammer kan lett kjøpes fra Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) og sendes via vanlig post til ethvert sted i USA. Hver stamme koster $ 10, og hvert laboratorium / bruker betaler en årlig avgift på $ 30.

  1. Ved hjelp av steril teknikk, lag 6 cm nematode vekstmedium agarplater (NGM agarplater).
    MERK: Helleplater kan oppbevares opp ned i originale plasthylser eller lufttette beholdere ved 4 °C i flere måneder.
    1. For å lage NGM agarplater, tilsett 3 g NaCl, 2,5 g Bacto pepton, 20 g NGM agar og ddH2O til 1 L (~ 975 ml). Autoklav mediet ved hjelp av en væskesyklus som holder ved 121 °C i 20 minutter. La avkjøles til 55 ° C, og bruk steril teknikk, tilsett 1 ml kolesterol, 0,5 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 og 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffer (pH 6).
      MERK: For å lage 1 M kaliumfosfatbuffer, bland 108,3 g KH 2 PO 4 (monobasisk) og 35,6 g K2HPO4 (dibasisk); Juster om nødvendig pH til 6 ved hjelp av KOH. Tilsett ddH2O opp til 1 L (vanligvis ~900 ml) og autoklav i 40 min ved 121 °C. 1 L NGM lager ca. 100 plater som inneholder 10 ml hver.
  2. Bruk en serologisk eller overføringspipet til å oppdage platene med tre dråper E.coli OP50 bakteriekulturer (~ 150 μL). Prøv å få øye på midten av platen og unngå å plassere flekker for nær platekantene; Dette vil motvirke dyrene i å krype opp på sidene av platene og tørke ut.
  3. Når bakterieplenen tørker, oppbevar de flekkete platene opp ned ved romtemperatur (RT) i opptil 2 uker. Spotting plater minst 1-2 dager før bruk vil tillate bakterielle plener å vokse tykkere og støtte en høyere tetthet av dyr.
    MERK: For å forberede OP50 bakteriekulturer, kan OP50 bestilles fra Caenorhabditis Genetics Center. OP50-bakterier stripes fra en glyserolbestand på en LB-plate for å sikre enkeltkolonier og holdes ved 4 °C i 4-6 uker. OP50 bakteriekulturer dyrkes i LB over natten ved 37 °C fra en enkelt koloni – ingen risting er nødvendig. For å forberede LB-medier, tilsett 10 g trypton, 10 g NaCl, 5 g gjærekstrakt, 950 ml ddH 2 O, juster pH til 7 med 10N NaOH og juster sluttvolumet til 1 L med ddH2O. Aliquot i 100 ml mengder og autoklav i 20 minutter ved 121 °C.
  4. For å lage et arbeidslager for hver stamme, velg tre L4-trinns hermafroditter på en flekket NGM-plate. Oppbevar platene ved 15-25 °C. Standard dyrkingstilstand er 20 °C. Hvis tilgang til temperaturkontrollerte inkubatorer ikke er tilgjengelig, må du opprettholde kulturene på benken på RT.
    MERK: L4-trinns hermafroditter kan lett iscenesettes både etter størrelse (mindre enn voksne) og tilstedeværelsen av en tydelig halvsirkel halvveis gjennom kroppen (den utviklende vulvaen). Ved 20 °C vil dyrene nå L4-stadiet 34-46 timer etter klekking (som er ca. 40-52 timer etter at embryoer er lagt). Se Corsi et al.14 for flere detaljer om tidspunktet for utviklingsstadier.
    1. Skift kulturene til forskjellige temperaturer for å kontrollere utviklingshastigheten. Dyr vil vokse raskere ved høyere temperaturer og langsommere ved lavere temperaturer. De vil begynne å bli sterile ved temperaturer over 25 °C.
      MERK: Noen mutante genotyper er temperaturfølsomme og vil vise forskjellige fenotyper avhengig av dyrkingstemperaturen.
  5. Oppretthold arbeidsbestandene ved å plukke tre L4-trinns hermafroditter til en ny flekket NGM-plate hver 4. Å gjøre det vil sikre en konstant, godt matet befolkning med et bredt spekter av utviklingsstadier.

2. Gonad disseksjon

  1. Samle aldersbestemte voksne: 12-24 timer før disseksjon, velg L4-trinns hermafroditter til en ny flekket NGM-plate - disse vokser til unge voksne dagen etter, noe som er ideelt for disseksjon. Antall L4-trinns hermafroditter vil avhenge av den cytologiske analysen som utføres; Vanligvis blir 10-20 hermafroditter dissekert per lysbilde, med to til fire lysbilder generert per tilstand.
    MERK: Gonader ekstruderes mest effektivt i godt matede dyr. Sørg for å plukke L4 hermafroditter fra arbeidsbestander som ikke er sultet (dvs. fortsatt ha en synlig bakteriell plen tilstede på platen). Utsultede dyr har en tendens til å gjennomgå ufullstendige gonadprofiler, noe som gjør dem vanskelige å visualisere.
    1. Hvis du vurderer senere stadier av meiose, som diakinese, dissekerer eldre voksne (48 timer etter L4) fordi de akkumulerer flere diakinese-stadium kjerner, forenkle analysen. Forskere bør imidlertid merke seg muligheten for at noen effekter kan være forårsaket av avansert mors alder.
  2. Forbered deg på disseksjon.
    1. Forbered M9: Tilsett 3 g KH 2 PO 4 (monobasisk), 6 g Na 2 HPO4 (dibasisk), 5 g NaCl, og tilsett ddH2O til 100 ml. Autoklav oppløsningen i 20 minutter ved 121 °C, la den avkjøles, og tilsett deretter 1 ml 1 M MgSO4 ved hjelp av steril teknikk.
    2. Forbered dissekeringsbuffer: Bland 1 μL 10% Tween 20, 12 μL 100 mM levamisol, 10 μL 10x M9 og 77 μL ddH2O.
      MERK: Tween 20 er inkludert i dissekeringsbufferen for å redusere overflatespenning og ytterligere permeabilisere vevsmembraner.
    3. Klargjør fikseringsløsning (2% PFA [100 μL]): Bland 12,5 μL 16% paraformaldehyd (PFA), 10 μL 10x M9 og 77,5 μL ddH2O; Sørg for å bruke en ny ampulle med PFA (åpnet i ikke lenger enn 2 uker).
      FORSIKTIG: PFA er et farlig kjemikalie, og festeløsning bør tilberedes i avtrekksviften.
    4. Sett opp frysemetoden - flytende nitrogen er enklere å håndtere, men om nødvendig kan en aluminiumblokk brukes på toppen av tørris.
      1. Flytende nitrogenmetode: Sett et plastbeger eller en Coplin-krukke av plast i en isoporboks. Fyll begeret med flytende nitrogen (overløp i polystyrenbeholderen er bra). Sett pinsetten i nærheten. Ideelt sett bør begeret være smalt nok til å forhindre at mikroskopsklier faller helt horisontalt - lysbilder bør ligge på en tilt og være lett å ta tak i med pinsett.
        MERK: Det er viktig å bruke plastbeholdere når du arbeider med flytende nitrogen i stedet for glass for å unngå knusing på grunn av rask avkjøling.
      2. Tørris metode:
        1. Plasser en flat aluminiumsblokk på tørris i en polystyrenbeholder eller rektangulær isbøtte. Det er lettere å fryse lysbildene hvis toppen av blokken sitter over toppen av beholderen.
        2. Bruk hansker, trykk forsiktig ned på aluminiumsblokken for å sikre god kontakt med tørris og fremskynde kjøleprosessen (det kan frigjøre et skrik når metallet avkjøles raskt). Sett et barberblad i nærheten.
        3. La aluminiumsblokken ligge på tørris i minst 30 minutter før frysesprekkstopp for å tillate full nedkjøling, noe som er nødvendig for en rask frysing.
          MERK: Ideelt sett bør faste blokker av tørris brukes, noe som hjelper overflaten til å forbli jevn. Om nødvendig kan aluminiumsblokk plasseres på tørrispellets, men det bør tas hensyn til at overflaten forblir jevn.
        4. Overflaten på aluminiumsblokken vil samle frost, noe som kan forhindre nær kontakt mellom lysbildene og blokken. Bruk barberbladet til å skrape frost av overflaten, og rydd et område for hvert lysbilde. Å dekke polystyrenbeholderen med et lokk vil bidra til å forhindre overdreven frostakkumulering.
    5. Fyll en Coplin-krukke med ~ 40 ml 95% etanol.
    6. Fyll tre Coplin krukker med ~ 40 ml PBS-T.
      MERK: For å lage PBS-T, bland 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 og 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8). Tilsett 873 ml ddH2O. Rist kraftig for å løse opp Triton X-100. For å lage 10x PBS, bland 25,6 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 80 g NaCl, 2 g KCl og 2 g KH2PO4. Tilsett ddH2O for å bringe volumet opp til 1 L. Autoklav i 40 minutter ved 121 °C. Vaskemiddelet Triton X-100 er inkludert i vaskebufferen PBS-T for å redusere overflatespenningen og øke retensjonen av helmonterte dyr på lysbildet.
  3. Disseker dyrene på et 18 mm x 18 mm glassdeksel. Dette trinnet er tidsfølsomt på grunn av fordampning av dissekeringsbufferen. Det bør ta mindre enn 5 minutter å fullføre disseksjoner.
    Levamisol brukes til å immobilisere dyr for å gjøre dem lettere å dissekere, men å la dem ligge i levamisol for lenge vil resultere i dårlig gonadekstrudering. Det er lettest å redusere antall dyr dissekert per lysbilde for å passe innenfor tidsrammen på 5 minutter.
    1. Plasser et holdesklie på scenen i et dissekeringsmikroskop - holdelysbildet brukes til å flytte dekselet lettere rundt, og kan gjenbrukes på ubestemt tid (figur 2A, venstre bilde).
    2. Plasser dekselet på toppen av holdesklien og pipet 4 μL av dissekeringsløsningen i midten av dekselet. Flytt holdelysbildet til den ene siden av scenen for å frigjøre visningen.
    3. Velg 10-20 hermafroditter i dråpen av dissekeringsløsning. Velg nok dyr til å avbilde ~ 10 per lysbilde, men ikke så mange at de ikke kan dissekeres innen 5 minutter.
    4. Disseker dyrene med to sprøytespisser, en for hver hånd (figur 2A).
      1. Kryss punktene på nålene for å lage en X-form og bruk bunnen av X til å feste en voksen ned til overflaten av dekselet.
        MERK: Det kan ta øvelse å finne den beste måten å holde hver nål på når det gjelder vinkel og rotasjon. Begynn med å holde nålene med skråkantene (skrå kant) vendt nedover. Se diskusjonen for forslag til først å lære å dissekere i et større volum (figur 2D).
      2. Plasser X-formen rett bak svelget, omtrent 1/5 av kroppslengden til en ung voksen, eller like under den klare delen av hodet (figur 2A, høyre diagram).
      3. Halshugg dyret med en saksbevegelse (som å kutte mat med kniv og gaffel). En god ekstrudering vil resultere i at en arm av gonaden (eller noen ganger begge armene) slipper helt ut fra kroppshulen, sammen med en eller begge halvdeler av tarmen (figur 2B, venstre bilde). Tarmen vil virke mørkere og med jevn bredde, mens gonaden vil virke klar med en distal konisk spiss.
        1. Hvert dyr skal bare kuttes en gang; Hvis gonaden ikke ekstruderer etter å ha kuttet, er det bare å gå videre til neste dyr. Det første kuttet reduserer det hydrostatiske trykket i kroppen betydelig, noe som gjør det lite sannsynlig at ytterligere kutt vil resultere i en bedre ekstrudering. Ufullstendige eller dårlige profiler er lett synlige under avbildning og kan ignoreres (figur 2B, høyre bilde).
          MERK: Ikke forsøk å skille gonaden fra, så det vil vanligvis rive vevet og begrense antall meiotiske stadier som kan analyseres.
      4. Gjenta disseksjonen for de resterende dyrene på dekselet.
  4. Fest prøven med formaldehyd.
    1. Arbeid forsiktig, pipet 4 μL av festeløsningen på dekselet veldig nær dråpen med dyr. Ideelt sett er dråpene nær nok til å fusjonere; Unngå pipettering direkte inn i disseksjonsdråpen og forskyv de dissekerte slaktkroppene.
    2. Fest dekselet til holdesklien med en finger. Med den andre hånden, knips forsiktig på dekselet et par ganger for å blande dråpene. Den endelige fikskonsentrasjonen er 0,8% PFA.
    3. Hold en positivt ladet lysbilde forside ned, bruk den til å plukke opp dekselet i midten av lysbildet. Berør prøvedråpen forsiktig, og overflatespenningen på dråpen vil plukke opp dekselet.
      MERK: Positivt ladede lysbilder har et elektrostatisk belegg som hjelper vev å feste seg til overflaten for å forhindre tap av prøver.
      1. Hvis ønskelig, plasser dekselet diagonalt, slik at det ene hjørnet henger av den øverste eller nedre kanten av lysbildet med 1 mm. Å forlate et overheng vil gjøre det lettere å knekke dekselet etter frysing (figur 2C).
    4. Sett lysbildet på benken og fest i nøyaktig 5 minutter på RT. I løpet av denne tiden merker du lysbildet med en blyant.
      MERK: Det er vanlig å overfikse prøvene, som kan oppdages ved utelukkelse av antistoff fra kjerner eller til og med alle vev. I tillegg er noen antistoffer spesielt følsomme for formaldehyd. I disse tilfellene, reduser fikseringstiden, eller reduser den endelige konsentrasjonen av formaldehyd som brukes.
  5. Fryse-sprekk
    1. Umiddelbart etter løsningen, frys lysbildene.
      1. Hvis du bruker flytende nitrogen: Hold den merkede kanten av lysbildet med pinsett og senk den forsiktig ned i flytende nitrogen. Slipp lysbildet slik at det lener seg mot siden av begeret, coverslip-side opp. Lysbilder fryses innen 10 s (når væsken slutter å koke).
      2. Hvis du bruker tørris: skrap frosten av overflaten av aluminiumsblokken med en barberhøvel. Hold godt den merkede kanten av lysbildet og sett den på den klarerte overflaten, og trykk litt nedover for å sikre full kontakt med blokken. Dekselet skal være helt på blokkoverflaten. Frysing skjer innen 10 s og kan bekreftes visuelt når prøven under dekselet blir til is.
      3. For begge metodene, la lysbildene stå i minst 5 minutter for å fryse helt.
        MERK: Når de er frosset, kan lysbildene stå i flytende nitrogen eller på blokken i 15-20 minutter, så lenge de forblir frosne. Dette gjør at flere lysbilder kan samles på dette stadiet før du fortsetter til sprekktrinnet.
    2. Arbeid raskt, knekk dekselet av prøven. Dette trinnet er tidssensitivt. Fjern dekselet og senk lysbildet i etanol før prøven begynner å tine.
      1. Fjern det frosne lysbildet (bruk pinsett for flytende nitrogen).
      2. Ta godt tak i skliemerket kort kant og spenne en lang kant mot benken.
      3. Med den andre hånden, ta godt tak i en barberhøvel, og skyv barberhøvelens kant nedover lysbildet for å flikke dekselet av og bort fra prøven. Dette trinnet er litt enklere hvis dekselet er plassert med et hjørneoverheng (figur 2C).
  6. Legg lysbildet umiddelbart i en Coplin-krukke som inneholder 95% etanol ved RT. La skliene ligge i etanol i minst 5 minutter.
    MERK: Lysbilder kan stå i etanol en stund - dette gjør at flere lysbilder kan samles på dette trinnet før du fortsetter på vasker. Lysbilder kan også lagres på dette trinnet i flere dager. Hvis du oppbevarer, flytter du Coplin-krukken med lysbilder i etanol til -20 °C.
  7. Vask lysbildene i PBS-T tre ganger i 5 min hver på RT. Bruk fersk PBS-T for hver vask.
  8. Hvis farging med antistoffer, fortsett til trinn 3 (antistofffarging). Hvis bare farging med DAPI for å visualisere kromosomer, fortsett til trinn 4 (montering og bildebehandling).

3. Antistofffarging

  1. Primær antistoffinkubasjon
    MERK: Når du utarbeider passende forhold for nye antistoffer, er det viktig å inkludere følgende negative kontroller for å verifisere spesifisiteten til fluorescerende signal: 1) Et lysbilde som mangler et primært antistoff og bare har et sekundært antistoff; 2) et lysbilde med et primært antistoff bare som mangler et sekundært antistoff. Hver av disse negative kontrollene skal gi en fullstendig mangel på signal. Hvis fluorescens identifiseres på det sekundære antistoff-lysbildet, bør den sekundære antistofffortynningen økes eller en annen sekundær brukes. Hvis fluorescens er identifisert på det primære antistoff-eneste lysbildet, er det sannsynligvis på grunn av autofluorescens eller andre potensielle forurensninger.
    1. Fortynn det primære antistoffet i antistofffortynningsbuffer (50 mg BSA + 50 μL 10% natriumazid + 10 ml PBS-T ) - forbered nok antistofffortynning til å bruke 20-30 μL per lysbilde.
    2. Forbered et fuktig kammer: Kle bunnen av en plastbeholder med et lufttett lokk med fuktige papirhåndklær. Legg et enkelt lag med Pasteur-pipetter i glass på toppen av papirhåndklærne. Disse pipettene skaper en overflate som gjør at lysbildene kan holde seg i vater og holder dem hevet av papirhåndklærne.
      MERK: For fuktige kamre er det best å bruke matbeholdere av plast med festelokk, noe som gjør det lettere å åpne og lukke beholderen uten å forstyrre lysbildene innenfor. Se etter en som er lang nok til Pasteur-pipetene, men som også har en relativt flat bunn uten innrykk slik at lysbildene kan hvile helt horisontalt.
    3. Fjern lysbildet fra den endelige PBS-T-vasken. Arbeid raskt fra dette trinnet fremover for å holde prøven våt til enhver tid og unngå fordampning. Hvis prøven tørker ut, vil antistofffarging bli negativt påvirket.
    4. Tørk hele overflaten av lysbildet ved hjelp av et tørkepapir brettet inn i et kompakt rektangel. Tørk av forsiden og baksiden av lysbildet, men la det være god plass rundt prøven. Vær spesielt forsiktig når du tørker overflaten nær prøven - unngå å komme for nær prøven, noe som etterlater et område på størrelse med dekselet ubegrenset. Sørg imidlertid for at omkretsen av prøven er tørr for neste trinn.
    5. Tegn en sirkel rundt prøven med en hydrofob PAP-penn. Vær forsiktig med å omslutte hele prøveområdet, men unngå å forstyrre dyreskrotter som er synlige på overflaten av lysbildet. Vent til ~ 5 s for å la barrieren tørke helt.
      MERK: En hydrofob barriere er nødvendig for å inneholde den primære antistoffløsningen fordi overflaten av lysbildet er belagt med PBS-T, som inneholder et vaskemiddel. PAP-pennen fungerer best på en tørr lysbildeoverflate, så det er viktig å skape en tørr omkrets rundt prøven. Hvis du lar området nærmest prøven være utørket, beskyttes prøven i dette trinnet
    6. Arbeid raskt, bruk hjørnet eller kanten av det brettede tørkevevet for å transportere væske bort fra prøven innenfor den hydrofobe barrieren. Pass på å unngå å forstyrre dyrekropper.
    7. Pipet 20 μL av den primære antistoffoppløsningen umiddelbart inn i ringen skapt av den hydrofobe barrieren. Pass på pipet forsiktig og i vinkel for å forhindre forstyrrende. Unngå pipettering direkte på.
    8. Vipp lysbildet forsiktig for å sikre at hele overflaten innenfor den hydrofobe barrieren er dekket av løsningen.
      MERK: Det er best hvis de hydrofobe barrierene har en indre omkrets på 1-1,5 cm, som er fullt dekket av 20 μL av antistoffløsningen. Omkretsbredden vil avhenge av hvordan fordeles under frysesprekktrinnet. Bredere barrierer kan kreve et høyere volum antistoffløsning. Om ønskelig kan små firkanter av parafilm (kuttet til størrelsen på 18 mm x 18 mm coverslip) plasseres forsiktig på toppen av prøven. Parafilmfirkantene vil sikre at antistoffløsningen dekker hele prøven og vil også bidra til å forhindre fordampning.
    9. Gjenta trinn 3.1.3–3.1.8 for resten av lysbildene.
    10. Overfør forsiktig lysbildene til det fuktige kammeret, og sørg for at løsningen forblir inneholdt innenfor den hydrofobe barrieren og at lysbildene hviler helt i vater.
    11. Inkuber lysbildene over natten på RT. Avhengig av antistoffet, kan dette trinnet forkortes til 6 timer eller utføres over natten ved 4 ° C ved å holde det fuktige kammeret i et kjølerom eller kjøleskap.
      MERK: Bruk av fuktig kammer og hydrofobe barrierer er vanligvis tilstrekkelig for å forhindre fordampning av antistoffløsningen, selv for lange inkubasjoner over natten. Men hvis fordampning viser seg å være et problem, kan små firkanter av parafilm plasseres forsiktig på hver prøve, noe som vil bidra til å forhindre fordampning. Disse kan fjernes i det første vasketrinnet: senk hvert lysbilde i en Coplin-krukke fylt med PBS-T (inneholder ingen andre lysbilder), og la parafilmen flyte bort fra prøven. Fjern parafilmen fra Coplin-krukken før du bruker den samme krukken til å fjerne parafilmen fra neste lysbilde.
  2. Vask lysbildene i Coplin-krukker som inneholder ~ 40 ml PBS-T tre ganger i 5 minutter hver ved RT. Bruk fersk PBS-T for hver vask.
    1. Under disse vaskene fortynnes det sekundære antistoffet i antistofffortynningsbuffer. Forbered nok antistofffortynning til å bruke 20-30 μL per lysbilde. Det er vanlig å bruke Alexa Fluor konjugerte sekundære antistoffer fortynnet ved 1:200.
  3. Sekundær antistoffinkubasjon
    1. Fjern lysbildet fra den endelige PBS-T-vasken. Arbeid raskt fra dette trinnet fremover for å holde prøven våt til enhver tid og unngå fordampning.
    2. Tørk lysbildet med et brettet tørkepapir. Unngå å tørke området ved den hydrofobe barrieren.
    3. Arbeid raskt, bruk hjørnet eller kanten av det brettede tørkevevet for å transportere væske bort fra prøven innenfor den hydrofobe barrieren. Pass på å unngå å forstyrre dyrekroppene.
    4. Pipet 20 μL av den sekundære antistoffoppløsningen umiddelbart inn i ringen skapt av den hydrofobe barrieren. Pass på pipet forsiktig og i vinkel for å unngå å forstyrre slaktkroppene.
    5. Unngå pipettering direkte på. Sørg for at hele overflaten innenfor den hydrofobe barrieren er dekket av løsningen. Bredere barriereomkretser kan kreve et høyere volum antistoffoppløsning. Hvis ønskelig, dekk prøven med en liten firkant av parafilm (se merknaden nedenfor trinn 3.1.8).
    6. Overfør forsiktig lysbildet til det fuktige kammeret, og sørg for at løsningen forblir inneholdt i den hydrofobe barrieren og at lysbildet hviler helt jevnt. Sett lokket på det fuktige kammeret igjen for å holde lysbildet mørkt.
    7. Gjenta trinn 3.3.1-3.3.6 for resten av lysbildene.
    8. Inkuber i mørket i 4 timer ved RT.
      MERK: Avhengig av antistoffet, kan dette trinnet forkortes til 2 timer eller utvides til 6 timer. Hvis det fuktige kammeret ikke er mørkt, legg det i en skuff eller dekk det med en pappkasse. Alternativt kan det fuktige kammeret pakkes inn i aluminiumsfolie for å holde lysbildene i mørket.
  4. Vask lysbildene i Coplin-krukker som inneholder ~ 40 ml PBS-T tre ganger i 5 minutter hver ved RT. Bruk fersk PBS-T for hver vask.

4. Montering og avbildning

  1. Forbered montering av prøven ved å ha monteringsmedium + DAPI (2 μg/ml), 18 mm x 18 mm glassdeksler og neglelakk innen rekkevidde.
  2. Fjern lysbildet fra den endelige vasken og tørk med et brettet tørkepapir. Unngå å tørke området ved den hydrofobe barrieren.
  3. Bruk hjørnet av det brettede tørkevevet, vek forsiktig bort væske fra prøven inne i barrieren. Fjern mest væske på dette trinnet, men uten å la slaktkroppene tørke helt ut.
  4. Arbeid raskt, tilsett 8 μL av monteringsmediet til prøven. Pipet forsiktig og i vinkel for å forhindre å forstyrre slaktkroppene. Unngå pipettering direkte på slaktkroppen.
  5. Fortsatt arbeider raskt, forsiktig senke et glass coverslip på prøven.
    1. Luftbobler kan forstyrre avbildning og føre til nedbrytning av prøver. For å minimere luftbobler, hvil den ene kanten av dekselet på lysbildet ved siden av prøven, slik at den holdes diagonalt over prøven. Det kan bidra til å hvile den øvre kanten av dekselet på en blyant eller pinsett. Senk deretter sakte den øvre kanten av dekselet ned - denne bevegelsen gjør at monteringsmediet kan skape en flytende tetning som går fra en kant til motsatt kant.
  6. Gjenta trinn 4.2–4.5 for resten av lysbildene.
  7. Forsegl dekslene med neglelakk. Pass på at du ikke trykker ned på dekselet (som vil knuse prøven) eller løsner dekselet horisontalt (som vil smøre prøven).
    1. Legg til en liten prikk neglelakk til hvert hjørne av en coverslip (~ 1 mm bred). Disse vil bidra til å holde dekselet på plass. La prikkene tørke helt.
    2. Når hjørnene er helt tørre, forsegl kantene med neglelakk. Forsikre deg om at poleringen fyller gapet mellom dekselet og glidningen helt, men unngå å dekke dekselet for mye. Det er best å opprettholde en overlapping på 1 mm på dekselet. Bruk bare så mye neglelakk som nødvendig. Unngå å bruke for mye eller ha overflødig polering, noe som kan ta lang tid å tørke og risikerer å skade mikroskopmålet.
      MERK: Det er å foretrekke å bruke farget neglelakk i stedet for klar, noe som gjør det lettere å se grensen til forseglingen og bidrar til å forhindre avbildningsdyr som ligger under neglelakkgrensen.
    3. La neglelakken tørke helt før avbildning. Dette trinnet er viktig, da våt neglelakk kan skade mikroskopmålene alvorlig.
      MERK: Lysbilder bør holdes i mørket så mye som mulig herfra og ut. Bruk en flat pappeske til å dekke dem når de tørker på benken.
  8. Oppbevar lysbildene i mørket ved 4 °C i 1-2 uker før avbildning. Oppbevar om nødvendig lysbildene ved -20 °C over lengre tid.
  9. Bilde ved bruk av standard fluorescensforbindelse lysmikroskopi.
    1. For hvert lysbilde, undersøk først hele prøven ved 10x i DAPI-kanalen for å identifisere godt ekstruderte gonader og notere plasseringen. For de fleste applikasjoner, unngå å avbilde gonader som er kuttet, ufullstendig eller delvis dekket av en annen del av dyret. For de fleste dyr vil bare en gonadearm være fullstendig ekstrudert og synlig.
      MERK: Det kan være nyttig å ta et bilde med lavere forstørrelse ved 10x av hele gonaden i DAPI-kanalen for senere orientering eller identifisere plasseringen av bestemte kjerner.
    2. Avhengig av applikasjonen kan bilder tas på 40x, 63x eller 100x. Hvis hele gonaden skal fanges, lag en montasje med overlappende grenser. Mens du avbilder, husk at gonaden er et hult rør, med kjerner mest tette øverst og nederst.

Representative Results

DAPI binder seg sterkt til DNA, og fargingen er robust selv under en rekke forhold (figur 3A, B). Det skal være tilstede i alle kjerner og gir derfor en effektiv positiv kontroll for tilstedeværelsen av noe ormvev på lysbildet og evnen til å oppdage fluorescens på mikroskopet. Farging er effektivt når antistoffet er tilstede i meiotiske kjerner (figur 3A, B). For eksempel viser figur 3A, B mid-pachytene kjerner farget med DAPI og et antistoff rettet mot RAD-51, en markør for dobbeltstrengsbrudd. KLE-2 er en komponent av kondensin, et svært konservert proteinkompleks som strukturerer kromosomer som forberedelse til mitose og meiose. kle-2/+-mutanter har mindre defekter i kromosomstrukturen, som vist ved lett forstyrret DAPI-farging og en økning i dobbeltstrengsbruddstall reflektert i det høyere antallet RAD-51-foci (figur 3B). En vanlig feil for immunfluorescens er å forlate prøven i fix-løsningen for lenge. Overfiksering kan føre til mislykket farging fordi det vanligvis forhindrer antistoffer i å diffundere til kjerner. Denne feilen kan identifiseres når antistoffet er diffust i de cytoplasmatiske områdene i gonaden, men ser ut til å være utelukket fra kjerner.

I kimlinjen (figur 1) prolifererer kjerner mitotisk ved distalspissen, går inn i meiose under overgangssonen, og utvikler seg gjennom pachyten (som ofte deles inn i tre like stadier av et antall kjernerader) før de går inn i diploten og til slutt diakinese. Oocytter i diakinesis er nummerert basert på deres nærhet til spermatheca, med -1 oocyten som er mest proksimal til spermatheca, -2 oocyten er den neste distal, og så videre. C. elegans har seks kromosomer, som manifesterer seg som kompakte ovaler i diakinesekjerner. Hver av disse representerer et homologt par av to søsterkromatider holdt sammen av en chiasma, også kalt en bivalent (figur 3C). Mutanter, som spo-11, som forstyrrer crossover-dannelsen, vil ikke danne chiasmata; derfor vil diakinesekjerner ha 12 separate DAPI-legemer (også kalt univalenter), en for hver søsterkromatid (figur 3D).

Figure 1
Figur 1: Germline kjerner er oppstilt på en romlig-temporal måte som representerer deres progresjon gjennom meiose . (A) Helmontert ung voksen hermafroditt farget med DAPI. Gonad- og meiotiske stadier er skissert, fra distalspissen (stjerne) til den proksimale regionen (-1 oocyten, indikert med en pil), som inneholder spermatheca (trekant). Skalastang representerer 100 μm. (B) Projisert fluorescensbilde av en dissekert hermafrodittgonad farget med DAPI. Meiotiske stadier er betegnet, med representative kjerner vist i innfelt (alle innfelt er vist å skalere med hverandre). Kjerner kan enkelt iscenesettes basert på deres plassering i kimlinjen og karakteristisk kromosommorfologi, som går fra den mitotiske sonen ved distalspissen (stjerne), til overgangssonen, gjennom pachyten, diploten og diakinese. Spermatheca er preget av en trekant. Dette tallet er tilpasset fra Hillers og medarbeidere under lisens CC BY 3.028. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Demonstrasjon av disseksjonsoppsett . (A) Mikroskopstadiet under disseksjon. Dyr dissekeres i 4 μL disseksjonsløsning på en deksel plassert på holdesklie, som brukes til å flytte dekselet til syne. Diagrammet viser ideell nåleplassering. Nåler holdes med en skrå kant vendt ned, krysset over pharyngeal regionen. Rosa piler demonstrerer en sakslignende bevegelse for nåler. Den rosa stiplede linjen viser den ideelle kuttplasseringen. (B) Bilder av dissekerte dyr, med et eksempel på full ekstrudering og en ufullstendig ekstrudering. Deler av ekstruderte gonader og tarmer er merket. (C) Bilde som viser frysesprekktrinnet. Lysbildet skal holdes fast i den ene hånden, med dekselsiden vendt bort fra kroppen. Den motsatte kanten er avstivet mot benken. Barberhøvelen skal holdes i den andre hånden. Den rosa pilen indikerer bevegelsesretningen for barberhøvelen for å flikke dekselet av lysbildet, med en liten sving slik at dekselet glir bort fra kroppen. Legg merke til at dekselet er plassert slik at det ene hjørnet henger over den lange kanten av lysbildet. (D) Bilde av oppsettet for disseksjonspraksis i en glassembryofargingsfat. Dyr er plassert i 50-200 μL disseksjonsløsning, noe som negerer problemet med fordampning og forlenger tiden for disseksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representative fluorescensresultater av kimlinjekjerner. (A,B) Z-stack-projeksjoner av sene pachytenkjerner farget med RAD-51 antistoff (grønn) og DAPI (rød) i (A) villtype og (B) kle-2/+ heterozygoter. (C,D) Z-stack-projeksjoner av en enkelt diakinesekjerne farget med DAPI i (C) villtype (med seks DAPI-fargelegemer) og (D) spo-11-mutanter (med 12 DAPI-fargelegemer). Skalastenger representerer 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Seksuell reproduksjon krever opprettelse av haploide gameter, som produseres via spesialisert celledeling av meiose. C. elegans har blitt en populær modell for cytologisk studie av meiose på grunn av sin optiske gjennomsiktighet, praktisk germline anatomi og kraftig genetikk28. Enkle organismeeksperimenter som vurderer fruktbarhet og embryonal dødelighet kan kombineres med molekylær genetikk for å løse mange spørsmål i laboratoriet eller klasserommet. For eksempel, fordi crossovers er avgjørende for riktig kromosomsegregering, vil prosesser som forstyrrer dannelsen eller oppløsningen generere aneuploide kjønnsceller. I sin tur fører aneuploidi til misunnelsesverdig avkom, som lett kan vurderes ved å telle avkom, eller gjennom den litt mer kompliserte metoden for å bestemme embryonal dødelighet. Cytologisk vil mangel på overganger påvirke antall DAPI-fargingslegemer observert under diakinese. Robustheten til DAPI-farging og den enkle scoringen gjør dette til et ideelt eksperiment for å lære cytologiske teknikker. Den temporale-romlige utformingen av kjerner i hermafroditt-kimlinjen gir et øyeblikksbilde av hvert stadium av meiose på et enkelt tidspunkt. Kjerner tar omtrent 54 timer å fortsette fra den distale mitotiske enden av kimlinjen til den proksimale enden (for eksempler, se Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 og Libuda et al.35). Denne veletablerte timingen av meiotisk fremgang muliggjør pulsjaktmerking eller DNA-skadelige eksperimenter.

Fordi DAPI-farging nesten alltid fungerer, fungerer det som en nyttig teknisk kontroll for fluorescensmikroskopi (og kan gi tilfredsstillelse for mikroskopister i trening). Antistofffarging kan være mer variabel og er et godt mål på reproduserbarhet mellom replikasjoner. C.elegans gonader kan være vanskelig å fikse konsekvent, da dette trinnet krever en balanse mellom å bevare kromosomal struktur samtidig som det tillater nok antistoffdiffusjon. Festing med formaldehyd bevarer best kromosomal morfologi, og tilberedning av formaldehyd frisk fra paraformaldehydampuller har gitt de mest reproduserbare resultatene. Det er også mulig å bruke formaldehyd fremstilt av formalin (37% vandig formaldehyd og metanol). Fikseringsstyrke og timing må kanskje bestemmes empirisk for hvert antistoff. Alternative metoder innebærer å hoppe over formaldehydfikseringen i trinn 2.4 og, etter frysesprekk, nedsenking i 100% etanol ved -20 ° C, eller nedsenking i 100% metanol i 10 minutter etterfulgt av nedsenking i 100% aceton i 10 minutter ved -20 ° C. Disse fikseringsforholdene tillater bedre antistoffpenetrasjon, men vil påvirke vevsmorfologien negativt (kromosomer vil se utblåst og puffier ut).

Timing er svært viktig for disseksjon og fikse trinnene som er skissert i trinn 2. Fordi volumet av disseksjonsoppløsning er så lite, kan fordampning påvirke den endelige fikseringskonsentrasjonen, noe som vil forårsake variabel antistofffarging. En erfaren C. elegans handler kan forberede et lysbilde på mindre enn 2 minutter fra starten (trinn 2.3) for å fikse (trinn 2.4). Den viktigste tekniske hindringen er evnen til å plukke dyr i dråpen av disseksjonsløsning og raskt dissekere dem. Det kan være lettere å lære å dissekere i større volumer. Nye praktikanter starter først med å plukke dyr i 50-200 μL disseksjonsløsning i en glassembryofargingsfat (figur 2D); Den bredere overflaten gir mer handlingsrom når du identifiserer en ideell nålposisjon for gode gonadprofiler, mens det større volumet av væske gjør fordampning mindre av et problem. Når de er komfortable med bevegelsene til dissekering, begynner praktikanter å dissekere med bare 50 μL i parabolen, og bytter deretter til dissekering i 20 μL på et lysbilde. Når de er dissekert på lysbilder, kan praktikanter raskt begynne å redusere mengden løsning til de er raske nok til å jobbe i 4 μL for å gjøre fordampning ubetydelig.

Hvis tidspunktet for disseksjon forblir et problem, kan praktikanter dissekere i 8 μL av disseksjonsløsningen i trinn 2.3. Deretter, i trinn 2.4, kan de tilsette 8 μL av fiksløsningen, forsiktig pipettere for å blande grundig (se nøye på at ikke blir forstyrret eller pipettert bort), og fjerne 8 μL fra den blandede løsningen. Denne alternative tilnærmingen vil resultere i samme sluttvolum på 8 μL og samme endelige fikseringskonsentrasjon; Dette volumet er viktig for å sikre at kommer i kontakt med både dekselet og glideflaten under frysesprekken i trinn 2.5. Hvis tidspunktet for å forberede hvert lysbilde forblir et problem selv i større disseksjonsvolumer, er en suspensjonsmetode for germline immunofluorescensprotokoll beskrevet av Gervaise og Arur26.

Den største begrensningen ved bruk av immunfluorescens for å visualisere proteiner in situ er tilgjengeligheten av primære antistoffer rettet mot et bestemt protein av interesse. Men hvis en merket versjon av proteinet er konstruert, kan denne protokollen tilpasses for å visualisere proteinkoden. Antistoffer rettet mot vanlige koder, som FLAG, HA eller GFP, er ofte tilgjengelige. Fluorescerende koder som GFP kan ofte slukkes av fikseringstrinn, så det anbefales å bruke et primært antistoff rettet mot GFP, i stedet for å stole på det opprinnelige fluorescenssignalet selv. En annen begrensning av denne protokollen er at den fanger kimlinjen innen en enkelt tidsramme (selv om alle stadier av oogenese vil bli representert i kimlinjen). Derfor kan denne teknikken savne dynamiske endringer som kan oppstå når en oocyt utvikler seg gjennom oogenese. Imidlertid har tidspunktet for gametogenese blitt godt studert i C. elegans; I en villtype ung voksen tar en oocyt ca. 60 timer å utvikle seg fra den distale spissen av kimlinjen (den mitotiske sonen) til diakinesis33. Derfor vil en pulsjakt eller spesifikk intervensjon som bestråling etterfulgt av et tidsforløp tillate observasjon av effekter på forskjellige stadier av meiose.

Avslutningsvis beskriver denne protokollen C. elegans gonaddisseksjon etterfulgt av DAPI og antistofffarging for fluorescensmikroskopi. Disseksjon og fiksering (trinn 2) tar 60-90 minutter, avhengig av antall lysbilder som genereres. Antistofffarging (trinn 3) er for det meste hands-off og kan variere fra 7 timer på minimum til 1,5 dager, avhengig av antistoff inkubasjon ganger. Montering (trinn 4,1-4,7) tar ca. 15 min. Denne generelle tilnærmingen til å visualisere germline kromosomer og gonaden kan brukes til cytologiske studier av noe protein hvis et antistoff eller fluorescerende tag reagens eksisterer. I sin enkleste form kan DAPI-farging av diakinesekjerner brukes til å skjerme for faktorer som påvirker meiotisk rekombinasjon. Sammen med organismeanalyser av avkomtall, forekomst av hanner (He-fenotype) og embryonal letalitet, gir denne cytologiske tilnærmingen et encellet kontrapunkt til populasjonsbaserte analyser.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om. Innholdet i dette manuskriptet er utelukkende forfatternes ansvar. Det representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health eller National Science Foundation.

Acknowledgments

Arbeid i Lee-laboratoriet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences under prisnummer 1R15GM144861 og National Institute for Child and Human Development under prisnummer 1R15HD104115, begge av National Institutes of Health. DA ble støttet av UML Kennedy College of Sciences Science Scholars-programmet. NW ble støttet av et UML Honors College Fellowship og et UMLSAMP-fellesskap (finansiert av National Science Foundation under tilskuddsnummer HRD-1712771). Vi takker A. Gartner for RAD-51 antistoff. Alle C. elegans stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av Office of Research Infrastructure Programs of the National Institutes of Health under tildelingsnummerP40 OD010440.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody Molecular Probes 711-545-152
Aluminum heating/cooling block Millipore Sigma Z743497
Bacto Peptone Gibco DF0118 17 0
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches Fisherbrand 13 678 20B Used to make worm picks
BSA, Bovine Serum Albumin VWR 97061 420
C. elegans wild type (ancestral) Caenorhabditis Genetics Center N2 (ancestral)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants Caenorhabditis Genetics Center VC768 The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants.
C. elegans spo-11 (me44) mutants Caenorhabditis Genetics Center TY4342 The full genotype of this strains is: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants.
Calcium Chloride Anhydrous VWR 97062 590
Cholesterol Sigma Aldrich 501848300
DAPI Life Technologies D1306
EDTA, Disodium Dihydrate Salt Apex Bioresearch Products 20 147
Embryo Dish, glass, 30mm cavity Electron Microscopy Services 100492-980 Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic
Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
Food storage container, plastic various n/a Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred
Glass Coplin Jar DWK Life Sciences Wheaton 08-813E
Hydrophobic Barrier PAP Pen ImmEdge NC9545623
Kimwipes Kimtech Science 06 666A
Levamisole Hydrochloride Sigma Aldrich L0380000
Magnesium Sulfate Anhydrous Fisher Chemical M65 500
Needles, Single-use, 25 G BD PrecisionGlide 14 821 13D blue, 1 inch
NGM Agar, Granulated Apex Bioresearch Products 20 249NGM
Parafilm Bemis 16 101
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 50 980 487
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) Fisher BioReagents BP399500
Petri Dishes, 60-mm Tritech Research NC9321999 Non-vented, sharp edge
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) Tritech Research PT 9010 Used to make worm picks
Potassium Chloride Fisher BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH Chemicals BDH9266 500G
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH Chemicals BDH9268 500G
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm Fisherbrand 12-548-AP 0.13–0.17 mm thickness
Razor Blades, Single Edge VWR 55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant Molecular Probes S36937 Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging.
Sodium Azide Fisher BioReagents BP922I 500
Sodium Chloride Fisher Chemical S271 500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Sigma Aldrich 7558 79 4
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate Sigma Aldrich S9390
Styrofoam box various n/a Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 22 037 246
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 500
Tryptone Apex Bioresearch Products 20 251
Tween 20 Fisher Chemical BP337 500
Yeast Extract Apex Bioresearch Products 20 254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. L., Wright, L. K. Meiosis: A play in three acts, starring DNA sequence. CourseSource. 4, (2017).
  2. Ohkura, H. Meiosis: An overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), 015859 (2015).
  3. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  4. Keeney, S., Giroux, C. N., Kleckner, N. Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11, a member of a widely conserved protein family. Cell. 88 (3), 375-384 (1997).
  5. Rabitsch, K. P., et al. Kinetochore recruitment of two nucleolar proteins is required for homolog segregation in meiosis I. Developmental Cell. 4 (4), 535-548 (2003).
  6. Brown, C. R. Some misconceptions in meiosis shown by students responding to an advanced level practical examination question in biology. Journal of Biological Education. 24 (3), 182-186 (1990).
  7. Kalas, P., O'Neill, A., Pollock, C., Birol, G. Development of a meiosis concept inventory. CBE-Life Sciences Education. 12 (4), 655-664 (2013).
  8. McDonnel, L. M., Klenz, J. Teaching genetic linkage and recombination through mapping with molecular markers. CourseSource. 2, (2015).
  9. Wright, L. K., Cortez, P., Franzen, M. A., Newman, D. L. Teaching meiosis with the DNA triangle framework: A classroom activity that changes how students think about chromosomes. Biochemistry and Molecular Biology Education. 50 (1), 44-54 (2021).
  10. Shortlidge, E. E., Bangera, G., Brownell, S. E. Each to their own CURE: Faculty who teach course-based undergraduate research experiences report why you too should teach a CURE. Journal of Microbiology & Biology Education. 18 (2), 18 (2017).
  11. Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE-Life Sciences Education. 13 (1), 29-40 (2014).
  12. Lee, T. W., Carpenter, B. S., Birol, O., Katz, D. J., Schmeichel, K. L. The pipeline CURE: An iterative approach to introduce all students to research throughout a biology curriculum. CourseSource. 6, (2019).
  13. Lu, F. -M., Eliceiri, K. W., Stewart, J., White, J. G. WormClassroom.org: an inquiry-rich educational web portal for research resources of Caenorhabditis elegans. CBE Life Sciences Education. 6 (2), 98-108 (2007).
  14. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  15. JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  16. JoVE. Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. C. elegans Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  17. Lee, R. Web resources for C. elegans studies. WormBook. , (2005).
  18. JoVE. Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. RNAi in C. elegans. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  19. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
  20. Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 15 (1), 44-55 (2016).
  21. Kowalski, J. R., Hoops, G. C., Johnson, R. J. Implementation of a collaborative series of classroom-based undergraduate research experiences spanning chemical biology, biochemistry, and neurobiology. CBE-Life Sciences Education. 15 (4), 55 (2016).
  22. Mordacq, J., Drane, D., Swarat, S., Lo, S. Research and teaching: Development of course-based undergraduate research experiences using a design-based approach. Journal of College Science Teaching. 46 (4), (2017).
  23. Palmisano, N. J., et al. A laboratory module that explores RNA interference and codon optimization through fluorescence microscopy using Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 344069 (2021).
  24. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Analysis of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans. Meiosis. 557, 77-97 (2009).
  25. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis. 558, 171-195 (2009).
  26. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and temporal analysis of active ERK in the C. elegans germline. Journal of Visualized Experiments. (117), e54901 (2016).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 107, 35-66 (2012).
  28. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. Wormbook. , ed. The C. elegans Research Community (2017).
  29. Hunter, A. -B., Seymour, E., Laursen, S., Thiry, H., Melton, G. Undergraduate Research in the Sciences: Engaging Students in Real Science. , John Wiley & Sons. (2010).
  30. Wei, C. A., Woodin, T. Undergraduate research experiences in biology: Alternatives to the apprenticeship model. CBE-Life Sciences Education. 10 (2), 123-131 (2011).
  31. Elgin, S. C. R., et al. Insights from a convocation: Integrating discovery-based research into the undergraduate curriculum. CBE-Life Sciences Education. 15 (2), (2016).
  32. Stiernagle, T. Maintenance of C. Elegant. WormBook. , ed. The C. elegans Research Community (2006).
  33. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  34. Stamper, E. L., et al. Identification of DSB-1, a protein required for initiation of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans, illuminates a crossover assurance checkpoint. PLoS Genetics. 9 (8), 1003679 (2013).
  35. Libuda, D. E., Uzawa, S., Meyer, B. J., Villeneuve, A. M. Meiotic chromosome structures constrain and respond to designation of crossover sites. Nature. 502 (7473), 703-706 (2013).

Tags

Genetikk utgave 187
<em>C. elegans</em> Gonaddisseksjon og frysesprekk for immunfluorescens og DAPI-farging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ananthaswamy, D., Croft, J. C.,… More

Ananthaswamy, D., Croft, J. C., Woozencroft, N., Lee, T. W. C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining. J. Vis. Exp. (187), e64204, doi:10.3791/64204 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter