Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

C. elegans Gonaddissektion och frysspricka för immunofluorescens och DAPI-färgning

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Massachusetts Lowell
* These authors contributed equally

Summary

Detta är en vanligt förekommande metod för C. elegans gonaddissektion följt av frysspricka, som producerar bakterieprover för immunofluorescens via antikroppsfärgning, eller för enkel DAPI-färgning för att visualisera DNA. Detta protokoll har varit framgångsrikt för studenter i ett forskningslaboratorium och i en kursbaserad grundutbildningserfarenhet.

Abstract

C. elegans germline är en utmärkt modell för att studera meios, delvis på grund av att det är enkelt att genomföra cytologiska analyser på dissekerade djur. Hela monteringspreparat bevarar strukturen hos meiotiska kärnor, och viktigare är att varje gonadarm innehåller alla stadier av meios, organiserade i en tidsmässig-rumslig progression som gör det enkelt att identifiera kärnor i olika steg. Vuxna hermafroditer har två gonadarmar, var och en organiserad som ett slutet rör med prolifererande könsstamceller vid den distala slutna änden och cellulariserade oocyter vid den proximala öppna änden, som går med i mitten vid livmodern. Dissektion släpper ut en eller båda gonadarmarna från kroppshålan, vilket gör att hela meios kan visualiseras. Här presenteras ett gemensamt protokoll för immunofluorescens mot ett protein av intresse, följt av DAPI-färgning för att markera alla kromosomer. Unga vuxna immobiliseras i levamisol och dissekeras snabbt med två sprutnålar. Efter bakteriesträngsprutning fixeras provet innan det genomgår en frysspricka i flytande kväve, vilket hjälper permeabilisera nagelbandet och andra vävnader. Provet kan sedan dehydreras i etanol, rehydreras och inkuberas med primära och sekundära antikroppar. DAPI läggs till provet i monteringsmediet, vilket möjliggör tillförlitlig visualisering av DNA och gör det enkelt att hitta djur att avbilda under ett fluorescerande mikroskop. Denna teknik används lätt av dem som är bekanta med att hantera C. elegans efter några timmars övning av själva dissektionsmetoden. Detta protokoll har lärts ut till gymnasieelever och studenter som arbetar i ett forskningslaboratorium och införlivats i en kursbaserad grundutbildningsupplevelse vid en liberal arts college.

Introduction

Meios är den specialiserade celldelning som används för att skapa könsceller (ägg och spermier/pollen) i alla sexuellt reproducerande organismer 1,2. Crossover-rekombination är det ömsesidiga utbytet av DNA mellan homologa kromosomer; Det är viktigt för meios, både att tillhandahålla en viktig källa till genetisk mångfald och att främja genomstabilitet genom generationer. Kromosomer som inte bildar minst en crossover under meios kommer att separeras slumpmässigt, vilket kan resultera i kromosom nondisjunction, vilket skapar könsceller med felaktigt antal kromosomer - ett tillstånd som vanligtvis är dödligt för resulterande avkomma3. Under meios induceras crossovers genom programmerade dubbelsträngade DNA-brott4. En delmängd av dessa brott kommer att repareras som crossovers som ger fysiska kopplingar av DNA, kallad chiasmata, som hjälper till att orientera homologa kromosomer som förberedelse för celldelning5. Meiotiska stadier är mycket bevarade över alla eukaryoter, och deras kromosomala konformation gör att de lätt kan identifieras.

Som ett grundläggande begrepp inom biologi är meios ett ämne som studenter stöter på flera gånger i olika biologikurser. De introduceras ofta till mekaniken för meiotisk kromosomsegregering i gymnasiet, medan kurser på högskolenivå fokuserar på segregeringens cellbiologi och den genetiska effekten av crossover-rekombination. Meios är dock ett notoriskt knepigt begrepp för många elever1. Ett misslyckande med att förstå förhållandet mellan gener, DNA, kromosomer och meios kan generera studentmissuppfattningar och luckor i förståelsen som hindrar en fullständig förståelse av genetiskt arv 6,7. Ett sätt att förbättra elevernas förståelse för abstrakta ämnen är att tillhandahålla konkreta, praktiska aktiviteter. När lärare till exempel undervisar i meios kan de välja mellan aktiviteter som emulerar molekylär analys8, 3D-modeller som gör det möjligt för eleverna att manipulera molekyler9 eller rollspel där eleverna själva spelar ut den molekylära koreografin1. Att införliva forskning med okända resultat är ett särskilt effektivt sätt att förbättra studenternas förståelse. Denna praxis är känd som en kursbaserad grundutbildningserfarenhet (CURE) och har den extra fördelen att stärka studenternas attityder och handlingsfrihet, särskilt för dem som tillhör grupper som fortfarande är underrepresenterade i STEM10,11. Nematodmasken Caenorhabditis elegans är särskilt mottaglig för klassrumsstudier av beteende, fertilitet och genetiska korsningar och är en effektiv modell för att introducera studenter till biologisk forskning12.

C. elegans gör en kraftfull modellorganism för cellbiologi genom att kombinera molekylär genetik med enkel cytologisk analys. Det är också särskilt väl lämpat för användning i ett biologiklassrum 13,14,15. De är enkla och ekonomiska att underhålla i ett laboratorium och producerar hundratals avkommor var 3: e dag, både vid standard rumstemperatur eller vid 20 ° C, den vanligaste inkubationstemperaturen. Viktigt är att de kan frysas som glycerollager och förvaras i en frys på -80 °C, vilket innebär att eventuella djurhållningsfel som görs av nybörjare lätt kan korrigeras16. Dessutom möjliggör dess väl kommenterade genom framåt- och bakåtgenetiska tekniker17,18, vilket gör att C. elegans kan användas för att ta itu med biologiska frågor som sträcker sig från molekylära till evolutionära. Slutligen har C. elegans-forskare skapat ett stödjande samhälle som ofta är villigt att ge hjälp och råd till spirande forskare19. Dessa fördelar har lett till att C. elegans har införlivats i ett antal CUREs vid olika typer av institutioner 12,19,20,21,22,23.

Förutom dess fördelar för forskning och undervisning har C. elegans blivit en populär modell för studier av meios och bakterieutveckling24,25,26. Den optiska klarheten hos dessa djur förenklar cytologiska tillvägagångssätt27, och hos vuxna representerar gonader nästan hälften av djuret, vilket ger hundratals meiotiska celler att studera. I gonader är meiotiska bakteriekärnor anordnade som ett löpande band (figur 1); Mitotisk replikation sker vid den distala spetsen av gonaden, med kärnor som utvecklas genom meiotiska stadier när de migrerar mot den proximala änden av gonaden, där befruktade embryon kommer ut ur vulva. Eftersom den stereotypa rumsliga organisationen också representerar en tidsmässig progression genom meios, kan olika stadier lätt identifieras baserat på deras kromosomala organisation och plats i gonaden. Slutligen skapar processer som stör meios och orsakar aneuploidi fenotyper som är enkla att karakterisera, även för nybörjare: sterilitet, embryonal dödlighet eller en hög förekomst av män (honom fenotyp)28.

Detta är ett enkelt protokoll för visualisering av meiotiska kromosomer i C. elegans. Montering, dissektion, fixering och antikroppsfärgning utförs alla på samma mikroskopglas, vilket förenklar protokollet och möjliggör nästan perfekt provåtervinning. Denna metod fungerar för enkel DAPI-färgning för att visualisera kromosomer och kan användas för immunofluorescens för att visualisera lokaliseringen av proteiner i gonaden. Studenter dissekerar gonader med hjälp av grundläggande dissekeringsmikroskop, genererar helmonterade preparat för visualisering av DNA eller immunofluorescens och avbildar dem på ett sammansatt fluorescerande mikroskop. Detta protokoll har lärts ut till gymnasieelever och studenter som arbetar i ett C. elegans-forskningslaboratorium och införlivats i en CURE vid en liberal arts college12. Även om CURE hade en relativt liten klasstorlek, skulle detta protokoll vara mottagligt för klasser vid en rad institutioner på grund av den relativt låga kostnaden för maskstammar och reagenser. Instruktörer skulle endast begränsas av antalet dissekerande mikroskop som är tillgängliga för användning. Den tidigare implementeringen hade studenter som arbetade i grupper om tre för att dela ett enda mikroskop och ägde rum under tre 90-minuters sessioner: den första för att öva dissektion, den andra för att implementera dissektion och DAPI-färgning och den tredje för att bildbilder på ett fluorescensmikroskop med brett fält. Deltagande i grundforskning ger många fördelar för studenter11,29, både akademiska och personliga. Genom att bädda in forskning i kurser via CUREs kan studenter delta i forskning under normal klasstid11,30,31, vilket gör exponeringen för dessa fördelar mer tillgänglig och rättvis.

Protocol

1. C. elegans djurhållning

OBS: Se C. elegans underhållsprotokoll16 och Elgin et al.32 för mer information. C. elegans-stammar kan enkelt förvärvas från Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) och skickas via vanlig post till vilken plats som helst i USA. Varje stam kostar $ 10, och varje labb / användare betalar en årlig avgift på $ 30.

  1. Använd steril teknik, förbered 6 cm nematodtillväxtmedium agarplattor (NGM-agarplattor).
    OBS: Hällda plattor kan förvaras upp och ner i sina ursprungliga plasthylsor eller lufttäta behållare vid 4 ° C i flera månader.
    1. För att göra NGM-agarplattor, tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto pepton, 20 g NGM-agar ochddH2Otill 1 L (~ 975 ml). Autoklavera mediet med en vätskecykel som håller sig vid 121 °C i 20 minuter. Låt svalna till 55 ° C och tillsätt 1 ml kolesterol, 0,5 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 och 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffert (pH 6) med steril teknik.
      OBS: För att göra 1 M kaliumfosfatbuffert, blanda 108,3 g KH 2 PO 4 (monobasisk)och 35,6 g K2HPO4 (dibasisk); justera vid behov pH till 6 med KOH. Tillsätt ddH2O upp till 1 L (vanligtvis ~ 900 ml) och autoklav i 40 min vid 121 ° C. 1 L NGM gör cirka 100 plattor som innehåller 10 ml vardera.
  2. Använd en serologisk eller överföringspipett, upptäck plattorna med tre droppar E.coli OP50 bakteriekulturer (~ 150 μL). Försök att upptäcka i mitten av plattan och undvik att placera fläckar för nära plattkanterna; Detta kommer att avskräcka djuren från att krypa upp på sidorna av plattorna och torka.
  3. När bakteriegräsmattan har torkat, förvara de fläckiga plattorna upp och ner vid rumstemperatur (RT) i upp till 2 veckor. Spottingplattor minst 1-2 dagar före användning gör att bakteriegräsmattorna kan växa tjockare och stödja en högre densitet av djur.
    OBS: För att förbereda OP50 bakteriekulturer kan OP50 beställas från Caenorhabditis Genetics Center. OP50-bakterier stryks från en glycerolstam på en LB-platta för att säkerställa enstaka kolonier och hålls vid 4 ° C i 4-6 veckor. OP50 bakteriekulturer odlas i LB över natten vid 37 °C från en enda koloni – ingen skakning behövs. För att bereda LB-media, tillsätt 10 g trypton, 10 g NaCl, 5 g jästextrakt, 950 mlddH2O, justera pH till 7 med 10 N NaOH och justera den slutliga volymen till 1 L med ddH 2O. Alikvot i 100 ml mängder och autoklav i20min vid 121 °C.
  4. För att skapa ett fungerande lager för varje stam, välj tre L4-stegs hermafroditer på en fläckig NGM-platta. Förvara tallrikarna vid 15-25 °C. Standardodlingstillståndet är 20 °C. Om tillgång till temperaturkontrollerade inkubatorer inte är tillgänglig, behåll kulturerna på bänkskivan vid RT.
    OBS: Hermafroditer i L4-stadiet kan enkelt iscensättas både efter storlek (mindre än vuxna) och närvaron av en distinkt halvcirkel halvvägs genom deras kroppar (den utvecklande vulva). Vid 20 °C kommer djuren att nå L4-stadiet 34-46 h efter kläckning (vilket är cirka 40-52 timmar efter att embryon har lagts). Se Corsi et al.14 för mer information om tidpunkten för utvecklingsstadier.
    1. Flytta kulturerna till olika temperaturer för att kontrollera utvecklingshastigheten. Djur kommer att växa snabbare vid högre temperaturer och långsammare vid lägre temperaturer. De börjar bli sterila vid temperaturer högre än 25 °C.
      OBS: Vissa mutanta genotyper är temperaturkänsliga och kommer att visa olika fenotyper beroende på odlingstemperaturen.
  5. Underhåll arbetslagren genom att plocka tre L4-stegs hermafroditer till en ny fläckig NGM-platta var 4: e dag. Om du gör det kommer det att säkerställas en konstant, välmatad befolkning med ett brett spektrum av utvecklingsstadier.

2. Gonad dissektion

  1. Samla åldersmatchade vuxna: 12-24 timmar före dissektion, välj L4-stadium hermafroditer till en ny fläckig NGM-platta - dessa växer till unga vuxna dagen efter, vilket är perfekt för dissektion. Antalet hermafroditer i L4-stadiet beror på den cytologiska analysen som utförs; Vanligtvis dissekeras 10-20 hermafroditer per bild, med två till fyra bilder genererade per tillstånd.
    OBS: Gonader strängsprutas mest effektivt i välmatade djur. Var noga med att plocka L4-hermafroditer från arbetslager som inte är svälta (dvs. fortfarande har en synlig bakteriegräsmatta på tallriken). Svältade djur tenderar att genomgå ofullständiga gonadsträngsprutningar, vilket gör dem svåra att visualisera.
    1. Om man bedömer senare stadier av meios, som diakinesis, dissekerar äldre vuxna (48 h efter L4) eftersom de ackumulerar fler kärnor i diakinesistadiet, vilket förenklar analysen. Emellertid, forskare bör notera möjligheten att vissa effekter kan orsakas av avancerad moderålder.
  2. Förbered dig på dissektion.
    1. Förbered M9: Tillsätt 3 g KH 2 PO 4 (monobasisk), 6 g Na 2 HPO4 (dibasic), 5 g NaCl och tillsätt ddH2O till 100 ml. Autoklavera lösningen i 20 minuter vid 121 °C, låt den svalna och tillsätt sedan 1 ml 1 MMgSO4 med steril teknik.
    2. Förbered dissekeringsbufferten: Blanda 1 μl 10% Tween 20, 12 μL 100 mM levamisol, 10 μL 10x M9 och 77 μL ddH2O.
      OBS: Tween 20 ingår i dissekeringsbufferten för att minska ytspänningen och ytterligare permeabilisera vävnadsmembran.
    3. Förbered fixlösning (2% PFA [100 μL]): Blanda 12,5 μL 16% paraformaldehyd (PFA), 10 μL 10x M9 och 77,5 μL ddH2O; var noga med att använda en ny ampull PFA (öppnad i högst 2 veckor).
      VARNING: PFA är en farlig kemikalie och fixlösning bör beredas i dragskåpet.
    4. Ställ in frysningsmetoden-flytande kväve är lättare att hantera, men vid behov kan ett aluminiumblock användas ovanpå torris.
      1. Flytande kvävemetod: Ställ in en plastbägare eller en Coplin-burk i plast i en polystyrenlåda. Fyll bägaren med flytande kväve (överflöde i polystyrenbehållaren är bra). Ställ pincetten i närheten. Helst bör bägaren vara tillräckligt smal för att förhindra att mikroskopglas faller helt horisontellt - glidbanor ska ligga i lutning och vara lätta att ta tag i med pincett.
        OBS: Det är viktigt att använda plastbehållare när du arbetar med flytande kväve snarare än glas för att undvika splittring på grund av snabb kylning.
      2. Torrismetod:
        1. Placera ett platt aluminiumblock på torris i en polystyrenbehållare eller rektangulär ishink. Det är lättare att frysa bilderna om toppen av blocket sitter ovanför toppen av behållaren.
        2. Använd handskar, tryck försiktigt ner aluminiumblocket för att säkerställa god kontakt med torris och påskynda kylningsprocessen (det kan släppa ut ett skrik när metallen svalnar snabbt). Ställ ett rakblad i närheten.
        3. Låt aluminiumblocket ligga på torris i minst 30 minuter före fryssprickor för att möjliggöra full nedkylning, vilket är nödvändigt för en snabb frysning.
          OBS: Helst bör fasta block av torris användas, vilket hjälper ytan att förbli jämn. Vid behov kan aluminiumblock placeras på torrispellets, men man bör se till att ytan förblir jämn.
        4. Aluminiumblockets yta kommer att samla frost, vilket kan förhindra nära kontakt mellan bilderna och blocket. Använd rakbladet för att skrapa bort frost från ytan och rensa ett område för varje bild. Att täcka polystyrenbehållaren med lock hjälper till att förhindra överdriven frostansamling.
    5. Fyll en Coplinburk med ~40 ml 95% etanol.
    6. Fyll tre Coplin-burkar med ~ 40 ml PBS-T.
      OBS: För att göra PBS-T, blanda 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 och 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8). Tillsätt 873 ml ddH2O. Skaka kraftigt för att lösa upp Triton X-100. För att göra 10x PBS, blanda 25,6 g Na 2 HPO4·7H 2 O, 80 g NaCl, 2 g KCl och 2 g KH2PO4. Tillsätt ddH2O för att få upp volymen till 1 L. Autoklav i 40 min vid 121 °C. Tvättmedlet Triton X-100 ingår i tvättbufferten PBS-T för att minska ytspänningen och förbättra retentionen av helmonterade djur på bilden.
  3. Dissekera djuren på en 18 mm x 18 mm glastäckningsglid. Detta steg är tidskänsligt på grund av avdunstningen av dissekeringsbufferten. Det bör ta mindre än 5 minuter att avsluta dissektioner.
    OBS: Levamisol används för att immobilisera djur för att göra dem lättare att dissekera, men att lämna dem i levamisol för länge kommer att resultera i dålig gonadsträngsprutning. Det är lättast att minska antalet djur som dissekeras per bild för att passa inom tidsramen på 5 minuter.
    1. Placera en hållbild på scenen i ett dissekerande mikroskop - hållbilden används för att lättare flytta täckglaset och kan återanvändas på obestämd tid (figur 2A, vänster foto).
    2. Placera täckglaset ovanpå hållarglaset och pipetten 4 μL av dissekeringslösningen i mitten av täckglaset. Flytta hållbilden till ena sidan av scenen för att frigöra vyn.
    3. Välj 10-20 hermafroditer i droppen av dissekeringslösning. Välj tillräckligt med djur för att avbilda ~ 10 per bild, men inte så många att de inte kan dissekeras inom 5 minuter.
    4. Dissekera djuren med två sprutnålar, en för varje hand (figur 2A).
      1. Korsa nålarnas punkter för att göra en X-form och använd botten av X för att fästa en vuxen ner till ytan av täckglaset.
        OBS: Det kan krävas övning för att upptäcka det bästa sättet att hålla varje nål när det gäller vinkel och rotation. Börja med att hålla nålarna med fasaderna (lutande kant) nedåt. Se diskussionen för förslag på hur du först lär dig att dissekera i en större volym (figur 2D).
      2. Placera X-formen omedelbart bakom struphuvudet, cirka 1/5 av kroppslängden hos en ung vuxen, eller strax under den klara delen av huvudet (figur 2A, höger diagram).
      3. Halshugga djuret med en saxrörelse (som att skära mat med en kniv och gaffel). En bra extrudering kommer att resultera i att en arm av gonaden (eller ibland båda armarna) släpper helt från kroppshålan, tillsammans med en eller båda halvorna av tarmen (figur 2B, vänster bild). Tarmen kommer att se mörkare ut och ha enhetlig bredd, medan gonaden kommer att se klar ut med en distal avsmalnande spets.
        1. Varje djur ska bara skäras en gång; Om gonaden inte extruderar efter att ha gjort snittet, gå bara vidare till nästa djur. Det första snittet minskar avsevärt det hydrostatiska trycket i kroppen, vilket gör det osannolikt att ytterligare nedskärningar resulterar i en bättre extrudering. Ofullständiga eller dåliga profiler är lätt synliga under avbildning och kan ignoreras (figur 2B, höger bild).
          OBS: Försök inte att separera gonaden från slaktkroppen- att göra det kommer vanligtvis att riva vävnaden och begränsa antalet meiotiska steg som kan analyseras.
      4. Upprepa dissektionen för de återstående djuren på locket.
  4. Fixera provet med formaldehyd.
    1. Arbeta försiktigt, pipett 4 μL av fixlösningen på täckglaset mycket nära droppen med djur. Helst är dropparna tillräckligt nära för att slå samman; Undvik att pipettera direkt i dissektionsdroppen och förskjuta de dissekerade slaktkropparna.
    2. Fäst täckglaset på hållarbilden med ett finger. Med den andra handen, knäpp försiktigt täckglaset några gånger för att blanda dropparna. Den slutliga fixkoncentrationen är 0,8% PFA.
    3. Håll en positivt laddad glid framifrån och ner, använd den för att plocka upp täckglaset i mitten av bilden. Rör försiktigt provdroppen och droppens ytspänning tar upp täckglaset.
      OBS: Positivt laddade objektglas har en elektrostatisk beläggning som hjälper vävnader att fästa vid ytan för att förhindra provförlust.
      1. Om så önskas, placera täckglaset diagonalt, så att ett hörn hänger av bildens övre eller nedre kant med 1 mm. Om du lämnar ett överhäng blir det lättare att knäcka av täcket efter frysning (figur 2C).
    4. Ställ rutschkanan på bänken och fixa i exakt 5 min vid RT. Under denna tid, märk bilden med en penna.
      OBS: Det är vanligt att överfixera proverna, vilket kan detekteras genom att utesluta antikroppar från kärnor eller till och med alla vävnader. Dessutom är vissa antikroppar särskilt känsliga för formaldehyd. I dessa fall minska fixeringstiden eller minska den slutliga koncentrationen av formaldehyd som används.
  5. Frys-spricka
    1. Omedelbart efter fixen fryser du bilderna.
      1. Om du använder flytande kväve: Håll den märkta kanten på bilden med pincett och sänk den försiktigt till flytande kväve. Släpp rutschkanan så att den lutar sig mot bägarens sida, täcksidan uppåt. Bilderna fryses inom 10 s (när vätskan slutar koka).
      2. Om du använder torris: skrapa frosten från aluminiumblockets yta med en rakhyvel. Håll fast den märkta kanten på bilden och ställ den på den rensade ytan och tryck nedåt för att säkerställa full kontakt med blocket. Täckglaset ska vara helt på blockytan. Frysning sker inom 10 s och kan bekräftas visuellt när provet under täckglaset blir till is.
      3. För båda metoderna, låt bilderna stå i minst 5 minuter för att frysa helt.
        OBS: När de är frysta kan bilderna lämnas i flytande kväve eller på blocket i 15-20 minuter, så länge de förblir frysta. Detta gör att flera bilder kan samlas in i detta skede innan du fortsätter till spricksteget.
    2. Arbeta snabbt, knäck täckglaset från provet. Detta steg är tidskänsligt. Ta bort täckglaset och sänk ned rutschkanan i etanol innan provet börjar tina.
      1. Ta bort den frysta bilden (med pincett för flytande kväve).
      2. Ta ett stadigt grepp om rutschkanans märkta kortkant och håll en lång kant mot bänken.
      3. Med den andra handen, ta ett fast grepp om en rakhyvel och skjut rakhyvelns kant nerför rutschkanan för att knäppa täckglaset av och bort från provet. Detta steg är något enklare om täckglaset är placerat med ett hörnöverhäng (figur 2C).
  6. Placera omedelbart objektsglaset i en Coplinburk som innehåller 95 % etanol vid RT. Låt objektsglasen stå i etanol i minst 5 minuter.
    OBS: Slides kan lämnas i etanol ett tag - detta gör att flera bilder kan samlas in i detta steg innan du fortsätter på tvättar. Bilder kan också lagras i detta steg i flera dagar. Vid förvaring, flytta Coplin-burken med glasrutschbanor i etanol till -20 °C.
  7. Tvätta bilderna i PBS-T tre gånger i 5 min vardera vid RT. Använd färsk PBS-T för varje tvätt.
  8. Om färgning med antikroppar, fortsätt till steg 3 (antikroppsfärgning). Om du bara färgar med DAPI för att visualisera kromosomer, fortsätt till steg 4 (montering och avbildning).

3. Antikroppsfärgning

  1. Primär antikroppsinkubation
    OBS: När man utarbetar lämpliga förhållanden för nya antikroppar är det viktigt att inkludera följande negativa kontroller för att verifiera specificiteten hos den fluorescerande signalen: 1) En bild som saknar en primär antikropp och endast har en sekundär antikropp; 2) en bild med endast en primär antikropp som saknar en sekundär antikropp. Var och en av dessa negativa kontroller bör ge en fullständig brist på signal. Om fluorescens identifieras på det sekundära objektsglaset med enbart antikroppar bör den sekundära antikroppsutspädningen ökas eller en annan sekundär användas. Om fluorescens identifieras på den primära antikroppsbilden beror det sannolikt på autofluorescens eller andra potentiella föroreningar.
    1. Späd den primära antikroppen i antikroppsutspädningsbuffert (50 mg BSA + 50 μL 10% natriumazid + 10 ml PBS-T ) - förbered tillräckligt med antikroppsutspädning för att använda 20-30 μL per bild.
    2. Förbered en fuktig kammare: Klä botten av en plastbehållare med ett lufttätt lock med fuktiga pappershanddukar. Lägg ett enda lager pasteurpipetter av glas ovanpå pappershanddukarna. Dessa pipetter skapar en yta som gör att bilderna kan hålla sig jämna och håller dem upphöjda från pappershanddukarna.
      OBS: För fuktiga kamrar är det bäst att använda plastförvaringsbehållare med snäpplock, vilket gör det lättare att öppna och stänga behållaren utan att störa glidbanorna inuti. Leta efter en som är tillräckligt lång för Pasteur-pipetterna men som också har en relativt platt botten utan indragningar så att bilderna kan vila helt horisontellt.
    3. Ta bort bilden från den slutliga PBS-T-tvätten. Arbeta snabbt från detta steg framåt för att hålla provet vått hela tiden och undvika avdunstning. Om provet torkar ut påverkas antikroppsfärgningen negativt.
    4. Torka hela ytan av bilden med en torkvävnad vikad i en kompakt rektangel. Torka av fram- och baksidan av bilden, men lämna gott om utrymme runt provet. Var särskilt försiktig när du torkar ytan nära provet - undvik att komma för nära provet, vilket lämnar ett område ungefär storleken på täckglaset otorkat. Se dock till att provets omkrets är torr för nästa steg.
    5. Rita en cirkel runt provet med en hydrofob PAP-penna. Var försiktig så att du omsluter hela provområdet, men undvik att störa djurkroppar som är synliga på ytan av bilden. Vänta i ~ 5 s så att barriären torkar helt.
      OBS: En hydrofob barriär är nödvändig för att innehålla den primära antikroppslösningen eftersom ytan på bilden har belagts med PBS-T, som innehåller ett tvättmedel. PAP-pennan fungerar bäst på en torr glidyta, så det är viktigt att skapa en torr omkrets runt provet. Om du lämnar området närmast provet otorkat skyddas provet under detta steg
    6. Arbeta snabbt, använd hörnet eller kanten på den vikta torkvävnaden för att transportera vätska bort från provet inom den hydrofoba barriären. Var försiktig så att du inte stör djurkroppar.
    7. Pipett omedelbart 20 μL av den primära antikroppslösningen i ringen skapad av den hydrofoba barriären. Var noga med att pipettera försiktigt och i vinkel för att förhindra att slaktkroppar störs. Undvik pipettering direkt på någon slaktkropp.
    8. Luta bilden försiktigt för att säkerställa att hela ytan i den hydrofoba barriären täcks av lösningen.
      OBS: Det är bäst om de hydrofoba barriärerna har en inre omkrets på 1-1,5 cm, vilket är helt täckt av 20 μL av antikroppslösningen. Omkretsbredden beror på hur slaktkropparna fördelas under fryssprickan. Bredare barriärer kan kräva en högre volym antikroppslösning. Om så önskas kan små rutor av parafilm (skuren till storleken på 18 mm x 18 mm täckglas) försiktigt placeras ovanpå provet. Parafilmrutorna säkerställer att antikroppslösningen täcker hela provet och hjälper också till att förhindra avdunstning.
    9. Upprepa steg 3.1.3–3.1.8 för resten av bilderna.
    10. Överför försiktigt bilderna till den fuktiga kammaren och se till att lösningen förblir innesluten i den hydrofoba barriären och att glidbanorna vilar helt jämnt.
    11. Inkubera bilderna över natten vid RT. Beroende på antikroppen kan detta steg förkortas till 6 timmar eller utföras över natten vid 4 °C genom att hålla den fuktiga kammaren i ett kylrum eller kylskåp.
      OBS: Att använda en fuktig kammare och hydrofoba barriärer är vanligtvis tillräckligt för att förhindra avdunstning av antikroppslösningen, även för långa inkubationer över natten. Men om avdunstning visar sig vara ett problem kan små rutor av parafilm placeras försiktigt på varje prov, vilket hjälper till att förhindra avdunstning. Dessa kan tas bort i det första tvättsteget: sänk ner varje bild i en Coplin-burk fylld med PBS-T (som inte innehåller några andra bilder) och låt parafilmen flyta bort från provet. Ta bort parafilmen från Coplin-burken innan du använder samma burk för att ta bort parafilmen från nästa bild.
  2. Tvätta bilderna i Coplin-burkar som innehåller ~ 40 ml PBS-T tre gånger i 5 minuter vardera vid RT. Använd färsk PBS-T för varje tvätt.
    1. Under dessa tvättar späds den sekundära antikroppen ut i antikroppsutspädningsbufferten. Förbered tillräckligt med antikroppsutspädning för att använda 20-30 μL per objektglas. Det är vanligt att använda Alexa Fluor-konjugerade sekundära antikroppar utspädda vid 1:200.
  3. Sekundär antikroppsinkubation
    1. Ta bort bilden från den slutliga PBS-T-tvätten. Arbeta snabbt från detta steg framåt för att hålla provet vått hela tiden och undvika avdunstning.
    2. Torka bilden med en vikad torkvävnad. Undvik att torka området som finns i den hydrofoba barriären.
    3. Arbeta snabbt, använd hörnet eller kanten på den vikta torkvävnaden för att transportera vätska bort från provet inom den hydrofoba barriären. Var noga med att undvika att störa djurkropparna.
    4. Pipett omedelbart 20 μL av den sekundära antikroppslösningen i ringen skapad av den hydrofoba barriären. Var noga med att pipettera försiktigt och i vinkel för att förhindra att slaktkropparna störs.
    5. Undvik pipettering direkt på någon slaktkropp. Se till att hela ytan i den hydrofoba barriären täcks av lösningen. Bredare barriäromkretsar kan kräva en högre volym antikroppslösning. Om så önskas, täck provet med en liten kvadrat parafilm (se anmärkningen nedan steg 3.1.8).
    6. Överför försiktigt bilden till den fuktiga kammaren och se till att lösningen förblir innesluten i den hydrofoba barriären och att bilden vilar helt jämn. Sätt tillbaka locket på den fuktiga kammaren för att hålla bilden i mörkret.
    7. Upprepa steg 3.3.1–3.3.6 under resten av bilderna.
    8. Inkubera i mörkret i 4 timmar vid RT.
      OBS: Beroende på antikroppen kan detta steg förkortas till 2 timmar eller förlängas till 6 timmar. Om den fuktiga kammaren inte är mörk, placera den i en låda eller täck den med en kartong. Alternativt kan den fuktiga kammaren förpackas i aluminiumfolie för att hålla bilderna i mörkret.
  4. Tvätta bilderna i Coplin-burkar som innehåller ~ 40 ml PBS-T tre gånger i 5 minuter vardera vid RT. Använd färsk PBS-T för varje tvätt.

4. Montering och avbildning

  1. Förbered för montering av provet genom att ha monteringsmedium + DAPI (2 μg / ml), 18 mm x 18 mm glasskydd och nagellack inom räckhåll.
  2. Ta bort bilden från den slutliga tvätten och torka med en vikt torkvävnad. Undvik att torka området som finns i den hydrofoba barriären.
  3. Använd hörnet av den vikta torkvävnaden och transportera försiktigt bort vätska från provet inuti barriären. Ta bort mest vätska i detta steg, men utan att låta slaktkropparna torka ut helt.
  4. Arbeta snabbt, tillsätt 8 μL av monteringsmediet till provet. Pipett försiktigt och i vinkel för att förhindra att slaktkropparna störs. Undvik pipettering direkt på slaktkropparna.
  5. Arbeta fortfarande snabbt, sänk försiktigt ett glasskydd på provet.
    1. Luftbubblor kan störa avbildning och leda till nedbrytning av provet. För att minimera luftbubblor vilar du ena kanten av täckglaset på bilden bredvid provet, så att det hålls diagonalt över provet. Det kan hjälpa till att vila den högre kanten på täckglaset på en penna eller pincett. Sänk sedan långsamt den högre kanten av täcket nedåt - denna rörelse gör att monteringsmediet kan skapa en vätsketätning som går från ena kanten till motsatt kant.
  6. Upprepa steg 4.2–4.5 för resten av bilderna.
  7. Försegla täckglasen med nagellack. Var noga med att undvika att trycka ner täckglaset (som krossar provet) eller lossar täckglaset horisontellt (vilket smetar provet).
    1. Lägg till en liten prick nagellack i varje hörn av en täckglas (~ 1 mm bred). Dessa hjälper till att hålla täckglaset på plats. Låt prickarna torka helt.
    2. När hörnen är helt torra, försegla kanterna med nagellack. Se till att polermedlet helt fyller gapet mellan täckglaset och bilden, men undvik att täcka täckglaset provet för mycket. Det är bäst att behålla en överlappning på 1 mm på täckglaset. Använd bara så mycket nagellack som behövs. Undvik att använda för mycket eller ha överflödigt polermedel, vilket kan ta lång tid att torka och riskerar att skada mikroskopmålet.
      OBS: Det är att föredra att använda färgat nagellack istället för klart, vilket gör det lättare att se tätningens gräns och hjälper till att förhindra avbildning av djur som ligger under nagellacksgränsen.
    3. Låt nagellacket torka helt innan du bildsätter. Detta steg är viktigt, eftersom vått nagellack allvarligt kan skada mikroskopmål.
      OBS: Slides bör hållas i mörkret så mycket som möjligt härifrån och ut. Använd en platt kartong för att täcka dem när de torkar på bänken.
  8. Förvara bilderna i mörker vid 4 °C i 1–2 veckor innan de bildas. Förvara vid behov bilderna vid -20 °C under en längre tid.
  9. Bild med standard fluorescensföreningsljusmikroskopi.
    1. För varje bild, undersök först hela provet vid 10x i DAPI-kanalen för att identifiera väl extruderade gonader och notera deras placering. För de flesta applikationer, undvik att avbilda gonader som är avskurna, ofullständiga eller delvis täckta av en annan del av djuret. För de flesta djur kommer endast en gonadarm att vara helt extruderad och synlig.
      OBS: Det kan vara bra att ta en bild med lägre förstoring vid 10x av hela gonaden i DAPI-kanalen för att använda för senare orientering eller identifiera platsen för specifika kärnor.
    2. Beroende på applikation kan bilder tas vid 40x, 63x eller 100x. Om hela gonaden ska fångas skapar du ett montage med överlappande gränser. När du bildar, kom ihåg att gonaden är ett ihåligt rör, med kärnor som är tätast på toppen och botten.

Representative Results

DAPI binder starkt till DNA, och dess färgning är robust även under en mängd olika förhållanden (figur 3A, B). Det bör vara närvarande i alla kärnor och gör därför en effektiv positiv kontroll för närvaron av någon maskvävnad på bilden och förmågan att detektera fluorescens på mikroskopet. Färgning är effektiv när antikroppen finns i meiotiska kärnor (figur 3A, B). Till exempel visar figur 3A,B mid-pachytenkärnor färgade med DAPI och en antikropp riktad mot RAD-51, en markör för dubbelsträngsbrott. KLE-2 är en komponent i kondensin, ett mycket konserverat proteinkomplex som strukturerar kromosomer som förberedelse för mitos och meios. kle-2/+ mutanter har mindre defekter i kromosomstrukturen, vilket visas av något oordnad DAPI-färgning och en ökning av dubbelsträngsbrytningsantalet som återspeglas i det högre antalet RAD-51-foci (figur 3B). Ett vanligt misstag för immunofluorescens är att lämna provet i fixlösningen för länge. Överfixering kan leda till misslyckad färgning eftersom det vanligtvis förhindrar att antikroppar diffunderar i kärnor. Detta misstag kan identifieras när antikroppen diffunderas i gonadens cytoplasmatiska regioner, men verkar vara utesluten från kärnor.

I bakterien (figur 1) sprider sig kärnor mitotiskt vid distal spets, går in i meios under övergångszonen och fortskrider genom pachyten (som ofta delas in i tre lika stora steg med ett antal kärnor) innan de går in i diploten och slutligen diakinesis. Oocyter i diakinesis numreras baserat på deras närhet till spermatheca, med -1-äggcellen som är mest proximal till spermatheca, -2-äggcellen är nästa distala och så vidare. C. elegans har sex kromosomer, som manifesterar sig som kompakta ovaler i diakinesikärnor. Var och en av dessa representerar ett homologt par av två systerkromatider som hålls ihop av en chiasma, även kallad bivalent (figur 3C). Mutanter, som spo-11, som stör crossover-bildning kommer inte att bilda chiasmata; Därför kommer diakinesikärnor att ha 12 separata DAPI-kroppar (även kallade univalenter), en för varje systerkromatid (figur 3D).

Figure 1
Figur 1: Germlinekärnor är uppställda på ett rumsligt-tidsmässigt sätt som representerar deras progression genom meios . (A) Helmonterad ung vuxen hermafrodit färgad med DAPI. Gonad och meiotiska stadier beskrivs, från den distala spetsen (asterisk) till den proximala regionen (-1-oocyten, indikerad med en pil), som innehåller spermatheca (triangel). Skalstrecket representerar 100 μm. (B) Projicerad fluorescensbild av en dissekerad hermafroditgonad färgad med DAPI. Meiotiska stadier betecknas, med representativa kärnor som visas i infällningar (alla infällningar visas för att skala med varandra). Kärnor kan enkelt iscensättas baserat på deras placering i bakterien och karakteristisk kromosommorfologi, som utvecklas från den mitotiska zonen vid distal spets (asterisk), till övergångszonen, genom pachyten, diploten och diakinesis. Spermatheca är markerad av en triangel. Denna siffra har anpassats från Hillers m.fl. under licens CC BY 3.028. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Demonstration av dissektionsinställning. (A) Mikroskopsteg under dissektion. Djuren dissekeras i 4 μl dissektionslösning på ett täckglas som placeras på fasthållningsglaset, vilket används för att flytta täckglaset i sikte. Diagrammet visar idealisk nålplacering. Nålar hålls med en fasad kant nedåt, korsad över struphuvudet. Rosa pilar visar en saxliknande rörelse för nålar. Den rosa streckade linjen visar den perfekta klippplatsen. (B) Bilder av dissekerade djur, med ett exempel på en fullständig extrudering och en ofullständig extrudering. Sektioner av extruderade gonader och tarmar är märkta. (C) Bild som visar frysspricka-steget. Bilden ska hållas fast i ena handen, med täcksidan vänd bort från kroppen. Den motsatta kanten är spänd mot bänken. Rakhyveln ska hållas i andra handen. Den rosa pilen indikerar rörelseriktningen för rakhyveln att knäppa täckglaset från bilden, med en liten sväng så att täckglaset snärtar bort från kroppen. Observera att täckglaset har placerats så att ett hörn hänger över bildens långa kant. (D) Bild av upplägget för dissektionsövning i en glasembryonfärgningsskål. Djur placeras i 50-200 μl dissektionslösning, vilket förnekar problemet med avdunstning och förlänger tiden för dissektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa fluorescensresultat av bakteriekärnor. (A,B) Z-stack-projektioner av sena pachytenkärnor färgade med RAD-51-antikropp (grön) och DAPI (röd) i (A) vildtyp och (B) kle-2/+ heterozygoter. (C,D) Z-stack-projektioner av en enda diakineskärna färgad med DAPI i (C) vildtyp (med sex DAPI-färgningskroppar) och (D) spo-11-mutanter (med 12 DAPI-färgningskroppar). Skalstrecken representerar 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Sexuell reproduktion kräver skapandet av haploida könsceller, som produceras via den specialiserade celldelningen av meios. C. elegans har blivit en populär modell för cytologisk studie av meios på grund av dess optiska transparens, praktiska bakterieanatomi och kraftfulla genetik28. Enkla organismexperiment som bedömer fertilitet och embryonal dödlighet kan kombineras med molekylär genetik för att ta itu med många frågor i labbet eller klassrummet. Till exempel, eftersom crossovers är väsentliga för korrekt kromosomsegregering, kommer processer som stör deras bildning eller upplösning att generera aneuploida könsceller. I sin tur leder aneuploidi till oföränderlig avkomma, som lätt kan bedömas genom att räkna avkomma, eller genom den något mer komplicerade metoden för att bestämma embryonal dödlighet. Cytologiskt kommer brist på crossovers att påverka antalet DAPI-färgningskroppar som observerats under diakinesi. Robustheten i DAPI-färgning och den enkla poängsättningen gör detta till ett idealiskt experiment för att lära ut cytologiska tekniker. Den tidsmässiga rumsliga layouten av kärnor i hermafroditgrodden ger en ögonblicksbild av varje stadium av meios vid ett enda ögonblick. Kärnor tar cirka 54 timmar att fortsätta från den distala mitotiska änden av bakterien till den proximala änden (för exempel, se Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 och Libuda et al.35). Denna väletablerade tidpunkt för meiotiska framsteg möjliggör pulsjaktmärkning eller DNA-skadliga experiment.

Eftersom DAPI-färgning nästan alltid fungerar, fungerar den som en användbar teknisk kontroll för fluorescensmikroskopi (och kan ge tillfredsställelse för mikroskopister under utbildning). Antikroppsfärgning kan vara mer variabel och är ett bra mått på reproducerbarhet mellan replikat. C.elegans gonader kan vara svåra att fixa konsekvent, eftersom detta steg kräver en balans mellan att bevara kromosomal struktur samtidigt som det tillåter tillräckligt med antikroppsdiffusion. Fixering med formaldehyd bevarar bäst kromosomal morfologi, och beredning av formaldehyd färsk från paraformaldehydampuller har gett de mest reproducerbara resultaten. Det är också möjligt att använda formaldehyd framställd av formalin (37% vattenhaltig formaldehyd och metanol). Fixeringsstyrka och timing kan behöva bestämmas empiriskt för varje antikropp. Alternativa metoder innebär att man hoppar över formaldehydfixeringen i steg 2.4 och, efter fryssprickor, nedsänkning i 100% etanol vid -20 ° C, eller nedsänkning i 100% metanol i 10 minuter följt av nedsänkning i 100% aceton i 10 minuter vid -20 ° C. Dessa fixförhållanden möjliggör bättre antikroppspenetration men kommer att påverka vävnadsmorfologin negativt (kromosomer kommer att se utblåsta och puffigare ut).

Timing är mycket viktigt för dissektions- och fixstegen som beskrivs i steg 2. Eftersom volymen av dissektionslösning är så liten kan avdunstning påverka den slutliga fixkoncentrationen, vilket kommer att orsaka variabel antikroppsfärgning. En erfaren C. elegans-hanterare kan förbereda en bild på mindre än 2 minuter från början (steg 2.3) för att fixa (steg 2.4 ). Det viktigaste tekniska hindret är förmågan att plocka djur i droppen av dissektionslösning och snabbt dissekera dem. Det kan vara lättare att lära sig att dissekera i större volymer. Nya praktikanter börjar först med att plocka djur i 50-200 μl dissektionslösning i en glasfärgningsskål (figur 2D); Den bredare ytan ger mer handlingsutrymme när man identifierar en idealisk nålposition för bra Gonad-profiler, medan den större vätskevolymen gör avdunstningen mindre av ett problem. När de är bekväma med dissekeringsrörelserna börjar praktikanterna dissekera med endast 50 μL i skålen och växlar sedan till dissekering i 20 μL på en bild. När de har dissekerats på glasrutschkanor kan praktikanter snabbt börja minska mängden lösning tills de är tillräckligt snabba med att arbeta i 4 μL för att göra avdunstningen försumbar.

Om tidpunkten för dissektion fortfarande är ett problem kan praktikanter dissekera i 8 μl av dissektionslösningen under steg 2.3. Under steg 2.4 kan de sedan tillsätta 8 μl av fixlösningen, försiktigt pipettera för att blanda noggrant (noga övervaka att slaktkropparna inte störs eller pipetteras bort) och avlägsna 8 μl från den blandade lösningen. Detta alternativa tillvägagångssätt kommer att resultera i samma slutliga volym på 8 μl och samma slutliga fixkoncentration. Denna volym är viktig för att säkerställa att stommen kommer i kontakt med både täckglaset och glidytan under fryssprickan i steg 2.5. Om tidpunkten för att förbereda varje bild förblir ett problem även i större dissektionsvolymer, beskrivs en suspensionsmetod för germline immunofluorescensprotokoll av Gervaise och Arur26.

Den största begränsningen med att använda immunofluorescens för att visualisera proteiner in situ är tillgången på primära antikroppar riktade mot ett visst protein av intresse. Men om en taggad version av proteinet har konstruerats kan detta protokoll anpassas för att visualisera proteintaggen. Antikroppar som riktar sig mot vanliga taggar, som FLAG, HA eller GFP, är allmänt tillgängliga. Fluorescerande taggar som GFP kan ofta släckas genom fixeringssteg, så det rekommenderas att använda en primär antikropp riktad mot GFP, snarare än att förlita sig på själva den inbyggda fluorescenssignalen. En annan begränsning av detta protokoll är att det fångar bakterielinjen inom en enda tidsram (även om alla stadier av oogenes kommer att representeras inom bakterielinjen). Därför kan denna teknik missa dynamiska förändringar som kan uppstå när en oocyt fortskrider genom oogenes. Tidpunkten för gametogenes har dock studerats väl i C. elegans; Hos en ung vuxen av vild typ tar en oocyt cirka 60 timmar att utvecklas från den distala spetsen av bakterien (den mitotiska zonen) till diakinesis33. Därför skulle en pulsjakt eller specifikt ingrepp som bestrålning följt av en tidskurs möjliggöra observation av effekter i olika stadier av meios.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll C. elegans gonaddissektion följt av DAPI och antikroppsfärgning för fluorescensmikroskopi. Dissektion och fixering (steg 2) tar 60-90 minuter, beroende på antalet genererade bilder. Antikroppsfärgning (steg 3) är mestadels hands-off och kan variera från 7 timmar minst till 1,5 dagar, beroende på antikroppsinkubationstider. Montering (steg 4.1-4.7) tar ca 15 min. Detta allmänna tillvägagångssätt för att visualisera könskromosomer och gonaden kan användas för cytologiska studier av vilket protein som helst om det finns en antikropp eller fluorescerande taggreagens. I sin enklaste form kan DAPI-färgning av diakineskärnor användas för att screena för faktorer som påverkar meiotisk rekombination. I kombination med organismanalyser av avkommaantal, förekomsten av män (Him fenotyp) och embryonal dödlighet, ger detta cytologiska tillvägagångssätt en encells kontrapunkt till populationsbaserade analyser.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja. Innehållet i detta manuskript är enbart författarnas ansvar. Det representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller National Science Foundation.

Acknowledgments

Arbetet i Lee-labbet stöddes av National Institute of General Medical Sciences under prisnummer 1R15GM144861 och National Institute for Child and Human Development under prisnummer 1R15HD104115, båda National Institutes of Health. DA stöddes av UML Kennedy College of Sciences Science Scholars-programmet. NW stöddes av ett UML Honors College Fellowship och ett UMLSAMP-stipendium (finansierat av National Science Foundation under bidragsnummer HRD-1712771). Vi tackar A. Gartner för RAD-51-antikroppen. Alla C. elegans-stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av Office of Research Infrastructure Programs vid National Institutes of Health under prisnummerP40 OD010440.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody Molecular Probes 711-545-152
Aluminum heating/cooling block Millipore Sigma Z743497
Bacto Peptone Gibco DF0118 17 0
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches Fisherbrand 13 678 20B Used to make worm picks
BSA, Bovine Serum Albumin VWR 97061 420
C. elegans wild type (ancestral) Caenorhabditis Genetics Center N2 (ancestral)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants Caenorhabditis Genetics Center VC768 The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants.
C. elegans spo-11 (me44) mutants Caenorhabditis Genetics Center TY4342 The full genotype of this strains is: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants.
Calcium Chloride Anhydrous VWR 97062 590
Cholesterol Sigma Aldrich 501848300
DAPI Life Technologies D1306
EDTA, Disodium Dihydrate Salt Apex Bioresearch Products 20 147
Embryo Dish, glass, 30mm cavity Electron Microscopy Services 100492-980 Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic
Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
Food storage container, plastic various n/a Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred
Glass Coplin Jar DWK Life Sciences Wheaton 08-813E
Hydrophobic Barrier PAP Pen ImmEdge NC9545623
Kimwipes Kimtech Science 06 666A
Levamisole Hydrochloride Sigma Aldrich L0380000
Magnesium Sulfate Anhydrous Fisher Chemical M65 500
Needles, Single-use, 25 G BD PrecisionGlide 14 821 13D blue, 1 inch
NGM Agar, Granulated Apex Bioresearch Products 20 249NGM
Parafilm Bemis 16 101
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 50 980 487
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) Fisher BioReagents BP399500
Petri Dishes, 60-mm Tritech Research NC9321999 Non-vented, sharp edge
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) Tritech Research PT 9010 Used to make worm picks
Potassium Chloride Fisher BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH Chemicals BDH9266 500G
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH Chemicals BDH9268 500G
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm Fisherbrand 12-548-AP 0.13–0.17 mm thickness
Razor Blades, Single Edge VWR 55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant Molecular Probes S36937 Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging.
Sodium Azide Fisher BioReagents BP922I 500
Sodium Chloride Fisher Chemical S271 500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Sigma Aldrich 7558 79 4
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate Sigma Aldrich S9390
Styrofoam box various n/a Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 22 037 246
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 500
Tryptone Apex Bioresearch Products 20 251
Tween 20 Fisher Chemical BP337 500
Yeast Extract Apex Bioresearch Products 20 254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. L., Wright, L. K. Meiosis: A play in three acts, starring DNA sequence. CourseSource. 4, (2017).
  2. Ohkura, H. Meiosis: An overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), 015859 (2015).
  3. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  4. Keeney, S., Giroux, C. N., Kleckner, N. Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11, a member of a widely conserved protein family. Cell. 88 (3), 375-384 (1997).
  5. Rabitsch, K. P., et al. Kinetochore recruitment of two nucleolar proteins is required for homolog segregation in meiosis I. Developmental Cell. 4 (4), 535-548 (2003).
  6. Brown, C. R. Some misconceptions in meiosis shown by students responding to an advanced level practical examination question in biology. Journal of Biological Education. 24 (3), 182-186 (1990).
  7. Kalas, P., O'Neill, A., Pollock, C., Birol, G. Development of a meiosis concept inventory. CBE-Life Sciences Education. 12 (4), 655-664 (2013).
  8. McDonnel, L. M., Klenz, J. Teaching genetic linkage and recombination through mapping with molecular markers. CourseSource. 2, (2015).
  9. Wright, L. K., Cortez, P., Franzen, M. A., Newman, D. L. Teaching meiosis with the DNA triangle framework: A classroom activity that changes how students think about chromosomes. Biochemistry and Molecular Biology Education. 50 (1), 44-54 (2021).
  10. Shortlidge, E. E., Bangera, G., Brownell, S. E. Each to their own CURE: Faculty who teach course-based undergraduate research experiences report why you too should teach a CURE. Journal of Microbiology & Biology Education. 18 (2), 18 (2017).
  11. Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE-Life Sciences Education. 13 (1), 29-40 (2014).
  12. Lee, T. W., Carpenter, B. S., Birol, O., Katz, D. J., Schmeichel, K. L. The pipeline CURE: An iterative approach to introduce all students to research throughout a biology curriculum. CourseSource. 6, (2019).
  13. Lu, F. -M., Eliceiri, K. W., Stewart, J., White, J. G. WormClassroom.org: an inquiry-rich educational web portal for research resources of Caenorhabditis elegans. CBE Life Sciences Education. 6 (2), 98-108 (2007).
  14. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  15. JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  16. JoVE. Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. C. elegans Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  17. Lee, R. Web resources for C. elegans studies. WormBook. , (2005).
  18. JoVE. Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. RNAi in C. elegans. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
  19. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
  20. Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 15 (1), 44-55 (2016).
  21. Kowalski, J. R., Hoops, G. C., Johnson, R. J. Implementation of a collaborative series of classroom-based undergraduate research experiences spanning chemical biology, biochemistry, and neurobiology. CBE-Life Sciences Education. 15 (4), 55 (2016).
  22. Mordacq, J., Drane, D., Swarat, S., Lo, S. Research and teaching: Development of course-based undergraduate research experiences using a design-based approach. Journal of College Science Teaching. 46 (4), (2017).
  23. Palmisano, N. J., et al. A laboratory module that explores RNA interference and codon optimization through fluorescence microscopy using Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 344069 (2021).
  24. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Analysis of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans. Meiosis. 557, 77-97 (2009).
  25. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis. 558, 171-195 (2009).
  26. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and temporal analysis of active ERK in the C. elegans germline. Journal of Visualized Experiments. (117), e54901 (2016).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M., Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 107, 35-66 (2012).
  28. Hillers, K. J., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. L. Meiosis. Wormbook. , ed. The C. elegans Research Community (2017).
  29. Hunter, A. -B., Seymour, E., Laursen, S., Thiry, H., Melton, G. Undergraduate Research in the Sciences: Engaging Students in Real Science. , John Wiley & Sons. (2010).
  30. Wei, C. A., Woodin, T. Undergraduate research experiences in biology: Alternatives to the apprenticeship model. CBE-Life Sciences Education. 10 (2), 123-131 (2011).
  31. Elgin, S. C. R., et al. Insights from a convocation: Integrating discovery-based research into the undergraduate curriculum. CBE-Life Sciences Education. 15 (2), (2016).
  32. Stiernagle, T. Maintenance of C. Elegant. WormBook. , ed. The C. elegans Research Community (2006).
  33. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  34. Stamper, E. L., et al. Identification of DSB-1, a protein required for initiation of meiotic recombination in Caenorhabditis elegans, illuminates a crossover assurance checkpoint. PLoS Genetics. 9 (8), 1003679 (2013).
  35. Libuda, D. E., Uzawa, S., Meyer, B. J., Villeneuve, A. M. Meiotic chromosome structures constrain and respond to designation of crossover sites. Nature. 502 (7473), 703-706 (2013).

Tags

Genetik utgåva 187
<em>C. elegans</em> Gonaddissektion och frysspricka för immunofluorescens och DAPI-färgning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ananthaswamy, D., Croft, J. C.,… More

Ananthaswamy, D., Croft, J. C., Woozencroft, N., Lee, T. W. C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining. J. Vis. Exp. (187), e64204, doi:10.3791/64204 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter