Summary
传统上，小鼠胚胎瓣原基的心内膜已使用横向、冠状或矢状切片进行分析。我们在瓣膜生成区域对心内膜进行 面对面二维成像的新方法允许在瓣膜发育过程中对心内膜进行平面极性和细胞重排分析。
Abstract
研究哺乳动物心脏发育的细胞和分子机制对于解决人类先天性心脏病至关重要。原始心脏瓣膜的发展涉及心内膜细胞从心室管（AVC）和心脏流出道（OFT）区域的上皮到间充质转化（EMT），以响应局部诱导性心肌和心内膜信号。一旦细胞分层并侵入位于心内膜和心肌之间的细胞外基质（心果冻），就会形成原始心内膜垫（EC）。这个过程意味着心内膜必须填充分层细胞留下的间隙，并且必须重组自身以沿轴收敛（狭窄）或延伸（延长）。目前的研究已经暗示平面细胞极性（PCP）途径调节该过程所涉及的因素的亚细胞定位。传统上，心脏瓣膜发育的初始阶段已经在胚胎心脏的横截面或在胶原凝胶上培养的 离体 AVC或OFT外植体中进行了研究。这些方法允许分析顶端基底极性，但不允许分析上皮平面内的细胞行为或迁移细胞的形态变化。在这里，我们展示了一种实验方法，该方法允许将瓣膜生成区域的心内膜可视化为细胞的平面视野。这种实验方法提供了在瓣膜发育过程中研究 OFT 和 AVC 心内膜内的 PCP、平面拓扑和细胞间通讯的机会。破译涉及心脏瓣膜形态发生的新细胞机制可能有助于了解与心内膜垫缺陷相关的先天性心脏病。
Introduction
心脏是哺乳动物胚胎的第一个功能器官。在小鼠胚胎日（E）7.5左右，双侧心前中胚层细胞在腹侧形成心新月形1。心新月形包含两个心前细胞群，包括心肌和心内膜的祖细胞2。在E8.0左右，心脏前体在中线融合，形成由两个上皮组织组成的原始心脏管，即外部心肌和内部心内膜，内部心内膜是由称为心果冻的细胞外基质分离的特殊内皮。后来，在E8.5，心脏管经历右旋。环状心脏具有具有特定分子特征的不同解剖区域，例如流出道 （OFT）、心室和动脉-心室管 （AVC）3。虽然最初心脏管通过添加细胞4在其流入侧扩张，但在E9.5处，强烈的心脏增殖导致腔室气球膨胀和小梁网络建立5。瓣膜形成发生在AVC（未来的二尖瓣和三尖瓣）和OFT（未来的主动脉瓣和肺动脉瓣）中。
心内膜在瓣膜发育中起着至关重要的作用。心内膜细胞在AVC和OFT中经历上皮-间充质转化（EMT）以形成心内膜垫，这种结构出现在瓣膜发育开始时。不同的信号通路激活这一过程;在小鼠的E9.5处，响应心肌来源的BMP2在心内膜中激活的NOTCH通过激活TGFβ2和SNAIL（SNAI1）促进AVC和OFT区域中心内膜细胞的侵袭性EMT，其直接抑制血管内皮钙粘蛋白（VE-钙粘蛋白）的表达，这是粘附连接（AJ）的跨膜成分6，7，8.在OFT中，心内膜激活以启动EMT由FGF8和BMP4介导，其表达由NOTCH9，10，11，12激活。
EMT的进展涉及细胞动力学，因为细胞改变形状，与邻居断开和重建连接，分层并开始迁移13。这些变化包括AJ重塑和逐渐拆卸14，15，平面细胞极性（PCP）信号传导，顶端基底极性（ABP）丧失，顶端收缩和细胞骨架组织16，17。ABP是指蛋白质沿细胞前后轴的分布。在发育中的心脏中，心室发育需要心肌细胞中的ABP调节18。PCP是指细胞内蛋白质在组织平面上的极化分布，并调节细胞分布;具有稳定几何形状的上皮由六边形细胞组成，其中只有三个细胞在顶点19、20、21、22 处汇聚。不同的细胞过程，例如细胞分裂、邻居交换或在上皮形态发生过程中发生的分层，导致汇聚在顶点上的细胞数量增加，而给定细胞具有的相邻细胞数量增加22。这些与PCP相关的细胞行为可以通过不同的信号通路，肌动蛋白动力学或细胞内运输来调节23。
研究小鼠瓣膜发育产生的数据是从E8.5和E9.5胚胎心脏的横向，冠状或矢状面获得的，其中心内膜显示为细胞线而不是细胞场 - 心内膜覆盖心脏管的整个内表面24。胚胎切片不允许分析小鼠胚胎心内膜中的PCP。我们的新实验方法可以分析心内膜细胞分布，AJ各向异性和单细胞形状分析，如代表性结果所示。这种类型的数据是PCP分析所必需的，以及与PCP相关的其他分子的描述，本报告中未显示。全安装免疫荧光、特异性样品制备和使用转基因小鼠可在小鼠瓣膜发育开始时对心内膜进行平面极性分析。
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Protocol
动物研究得到了国家心血管研究中心（CNIC）动物实验伦理委员会和马德里共同体的批准（参考PROEX 155.7/20）。所有动物程序均符合欧盟指令 2010/63EU 和关于保护用于实验和其他科学目的的动物的建议 2007/526/EC，根据 Real Decreto 1201/2005 在西班牙法律中颁布。
1. 获得AVC和/或OFT（改编自Xiao等人）。25）
- 下午在雌性 mTmG 和雄性 VE-Cadherin-Cre-ERT/+之间设置杂交。
- 第二天早上，检查阴道塞。如果有阴道栓，则算作半天（E0.5）。根据感兴趣的实验，计数8天或9天。
- 解剖前24小时，用50μL在玉米油中稀释的5mg / mL 4-OH-他莫昔芬口服管饲孕妇。
注意：该剂量将诱导有限量的CRE介导的重组，由GFP阳性克隆的存在揭示。每批新批次的4-OH-他莫昔芬必须确定适当的剂量。 - 在E8.5或E9.5处通过颈椎脱位处死怀孕的女性。
- 用剪刀打开怀孕小鼠的腹部，用剪刀和细镊子取出含有胚胎的子宫。
- 将子宫放入含有冰冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）和0.1%吐温-20（PBT）的培养皿中。
- 在解剖显微镜下并使用细镊子从子宫中取出单个蜕蜕。
- 使用细镊子，在蜕膜的白色部分（即胚胎所在的位置）切开一个切口，轻轻将其取出，避免拉扯，并使用P1000将胚胎转移到带有新鲜PBT的新培养皿中，尖端被切断，留下足够大的直径以使胚胎通过而不会破裂。
- 对于基因分型，取一小块卵黄囊（0.5 mm2）或一块尾巴（从后端开始，向头部计数 5 至 10 个体细胞），并将其在 100 μL 适当的缓冲液中消化。
- 在通风橱下，将胚胎转移到4°C的微量离心机（2mL）管中无菌过滤PBS中的冰冷的4%多聚甲醛（4%PFA）中。 将胚胎在4°C下固定在章动器上2小时至过夜（O / N）。
- 在通风橱下，从微量离心管中取出4%PFA固定剂，而不接触胚胎。将 PFA 丢弃在适当的容器中。
- 在室温（RT）下在冷PBT中洗涤胚胎5次10分钟。
- 使用细镊子取出心脏并将其转移到带有新鲜 PBT 的新 1.5 mL 微量离心管中。
2. 小鼠胚胎心脏的全支架免疫荧光
- 用PBSTr（PBS中的0.4%Triton X-100）替换PBT，并在轨道振荡器上的室温下洗涤样品3x，每次5分钟。
- 用封闭溶液代替PBSTr（PBSTr与10%热灭活牛血清）。在轨道振荡器上于4°C孵育2小时至O / N。
- 用含有所需浓度的一抗的封闭溶液替换封闭溶液（对于抗GFP或抗VE-钙粘蛋白抗体，使用1：1000稀释度）。在4°C的轨道振荡器上孵育O / N。
- O / N在4°C孵育后，在轨道振荡器上在室温下孵育1.5小时。此步骤对于提高信噪比非常重要。
- 取出并将一抗溶液保持在4°C，用于最多三个未来的实验（加入叠氮化钠至终浓度为0.02%以获得最佳保存）。
- 用PBSTr洗涤胚胎3次，每次3分钟。
- 用PBSTr 3x在4°C的轨道振荡器上洗涤胚胎30分钟。
- 最后一次洗涤后，加入 1 mL 含有 1：1000 荧光偶联二抗的封闭溶液，对抗一抗宿主物种。向溶液中加入1：3000DAPI，并在4°C的轨道振荡器上孵育胚胎O / N。
- O / N在4°C孵育后，在轨道振荡器上在室温下孵育1.5小时。此步骤对于提高信噪比非常重要。
- 用PBSTr洗涤胚胎3次，每次3分钟。
- 用PBSTr 3x-5x在室温的轨道振荡器上洗涤胚胎30分钟。
3. 安装小鼠胚胎AVC或OFT
- 将心脏放在含有PBS的培养皿（35毫米）上。
- 使用钨丝和细镊子，隔离AVC或OFT并纵向切割它们26.
- 准备盖玻片 （22 mm x 22 mm）、载玻片 （60 mm x 24 mm）、镊子、带有适当吸头的 P200 移液器、纸巾和任何用于荧光的甘油水性封片剂，无需 DAPI。
- 使用与Xiao，C.等人25类似的方法，将两条胶带粘在载玻片上，间隔0.3-0.6厘米，以创建一个3D房间空间，使样品能够保持其原始形状而不会挤压它们。
- 小心地，并使用最小体积的缓冲液，使用切割的P200吸头移液器将样品滴到胶带条纹之间的载玻片上。使用解剖显微镜提高精度。
- 使用细镊子，将样品放在心内膜朝上（心肌向下放在载玻片上）。
- 用纸巾去除多余的PBS（避免接触样品），然后在室温下干燥样品1-2分钟，使样品粘在载玻片上。
- 在纸巾上加入 40 μL 水基封片剂。
- 将盖玻片放在两张胶带上，然后用针或镊子将其缓慢降低到纸巾上。避免产生气泡。
- 在盖玻片的每个顶点上用一滴指甲油密封盖玻片。
- 指甲油干燥后，使用吸水纸巾清洁盖玻片侧面多余的镶片介质。避免移动盖玻片。
- 沿着盖玻片边缘添加指甲油以完全密封，防止安装介质蒸发。
- 使用正置或倒置共聚焦显微镜，以 10 倍拍摄图像以获得一般视图，以 63 倍拍摄图像，以 3 倍变焦拍摄详细图像。
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Representative Results
使用该协议生成的数据显示，可以对AVC的心内膜进行面部成像。第一个目标是以细胞分辨率分析瓣膜形成过程中心内膜的细胞形状（图1）。为了突出E9.5处的单个心内膜细胞，我们使用了两种转基因小鼠品系。（1）ROSA mT/mG是一种双色荧光Cre报告等位基因（tdTomato/mT和EGFP/mG），其荧光在细胞膜处检测到。在没有Cre介导的激活的情况下，转基因表达tdTomato（mT）。在Cre介导的激活后，tdTomato表达被特定细胞和克隆衍生物中的EGFP荧光表达（mG）取代27。（2）Cdh5CreERT2 / +小鼠系在血管内皮钙粘蛋白启动子（Cdh5）的调节下表达他莫昔芬诱导的CRE-重组酶（CreERT2），其在胚胎阶段的血管内皮和心内膜中表达28。我们杂交了每种基因型的男性和女性，以获得携带两个转基因的胚胎，以激活GFP在心内膜单个细胞中的表达。为了实现这一目标，我们接种了低剂量的他莫昔芬，以激活减少细胞数量的CRE表达。结果，单个细胞或少数细胞的克隆在心内膜中表达GFP（图1A）。GFP表达（图1A，B）与VE-钙粘蛋白亚细胞定位（图1C）相结合是研究前EMT细胞中AJ动力学与丝状伪足形成之间关系的有效方法，因为这些细胞在AJ溶解时会产生膜突起29。PCP信号可以赋予AJ各向异性收缩力，产生促进上皮30极化形态发生的细胞力。我们发现心内膜中VE-钙粘蛋白染色强度存在差异（图2），表明我们不能在瓣膜前阶段丢弃AVC胚胎心内膜中的各向异性收缩力。
第二个目标是分析瓣膜发育过程中心内膜的平面拓扑结构（图2）。为了确定在单个顶点中会聚的细胞数量，我们用 VE-钙粘蛋白抗体在 E8.5 和 E9.5 处染色整个心脏（图 2A，B）。位于心内膜细胞的细胞-细胞接触处的其他分子也可用于该目的（例如，β-连环蛋白）。在E8.5，AVC的心内膜往往具有稳定的上皮组织，我们无法检测到由四个以上细胞形成的顶点（图2A，C）。后来在E9.5，我们发现由多达六个细胞组成的顶点形成玫瑰花状结构（图2B，D），类似于先前描述的上皮经历活性细胞重排31的细胞组织，表明AVC心内膜在瓣膜发育过程中正在经历活跃的细胞重排。
图1：瓣膜前心内膜的单细胞形状分析。 （A）来自E9.5小鼠胚胎的AVC纵向打开，显示分散的GFP阳性细胞。（B）单细胞中的GFP表达在细胞分辨率下定义细胞形状。（C） VE-钙粘蛋白的全安装染色突出显示 AJ。丝状伪足在不定位VE-钙粘蛋白（紫色箭头）的细胞结构域中产生，反之亦然，VE-钙粘蛋白定位在光滑且不形成丝状伪足（蓝色箭头）的细胞结构域中。V，腹侧;d，背侧。A 中的比例尺为 100 μm;在B和C中为10μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：平面定位蛋白质的平面拓扑和各向异性可以在房室管心内膜的 面部 图像中定义。 VE-钙粘蛋白位于心内膜的细胞 - 细胞接触处。（A）胚胎的E8.5和（B）E9.5 AVC纵向打开。（C）和（D）中的放大倍数使我们能够观察在顶点中收敛的细胞数量。此外，我们可以区分VE-钙粘蛋白染色中的不同强度，表明其在AVC中的位置是各向异性的。 A 和 B 的比例尺为 100 μm;在 C 和 D 中为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
心内膜是覆盖胚胎心脏管整个内表面的上皮单层。在瓣膜发育过程中，预期瓣膜区域的心内膜细胞经历EMT，因此心内膜细胞转换并重新排列其细胞骨架，从心内膜向心果冻分层。我们和其他人通过分析E8.5和E9.5胚胎心脏的横向切片获得了有关小鼠胚胎瓣膜发育的相关数据，其中心内膜显示为一排细胞6，8，24，32。这种方法允许分析信号通路和参与瓣膜发育的其他分子的表达，但不可能分析瓣膜前心内膜的空间方面。
AVC或OFT外植体主要用于研究3D胶原凝胶上的EC转化。外植体可用于EMT定量，转化能力分析或在培养物6，7，11，33中几天后测试药物。这些离体实验还允许胶原凝胶顶部的心内膜作为单层膨胀，但离体心脏外植体生长的环境条件与子宫条件不同。例如，单向血流对于适当的瓣膜发育至关重要34，35，并且仅在子宫内实现，而不是在体外外植体中实现。
这种新颖的方法使我们能够在瓣膜发育开始时观察完整的瓣膜心内膜，而无需任何环境操作。它允许分析瓣膜心内膜的细胞分布，以及在子宫内EMT之前和期间进行单细胞形状分析。我们还可以观察和分析EMT过程中细胞-细胞接触的强度和组织以及相关分子的亚细胞分布。该技术还提供了分析心内膜亚细胞结构，使用报告基因激活信号通路，基因失活可能对细胞行为产生的影响以及它如何影响野生型邻近细胞的可能性。
为了获得高质量的样品，在处理它们时必须非常小心，因为粘附在组织的杂质（例如，微纤维）会在图像捕获过程中导致伪影。此外，由于它们是非常小的样品，破裂的风险很高，因此必须在慢速摇床中清洗纸巾（步骤1.和步骤2）。在使用移液器更换培养基期间，我们建议切断吸头，以防止组织在通过吸头时塌陷，以防被意外吸收。要成为这项技术的专家，学习曲线是必要的，根据研究人员以前在显微操作方面的经验，学习曲线会更长或更短。
在使用表达荧光蛋白的转基因的情况下，选择正确的固定剂和固定时间可能很重要。解剖结构不受乙醇70%、甲醇、PFA 4%或福尔马林10%等不同固定剂的影响。
对于细胞核复染，我们建议用DAPI孵育样品，因为渗透比使用DAPI封片剂更有效。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了MCIN/AEI/10.13039/501100011033到J. L. P. J.G.-B.的PID2019-104776RB-I00和CB16/11/00399（CIBER CV）的支持。由马德里市人才计划资助（2020-5ª/BMD-19729）。T.G.-C.由大学教授学院资助（FPU18/01054）。我们感谢CNIC显微镜和动态成像部门，CNIC，ICTS-ReDib，由MCIN/AEI / 10.13039 / 501100011033和FEDER“创造欧洲的方式”（#ICTS-2018-04-CNIC-16）共同资助。我们还要感谢A.加利西亚和L.门德斯的老鼠饲养。该出版物的费用部分由欧洲区域发展基金提供的资金支付。CNIC得到了ISCIII，MCIN和Pro CNIC基金会的支持，是由MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033资助的Severo Ochoa卓越中心（授予CEX2020-001041-S）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
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