Summary
Ce protocole décrit une approche visant à faciliter des modifications précises dans les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un pipeline de phénotypage est présenté pour démontrer l’applicabilité de ces techniques à modéliser une variante génétique associée au syndrome du QT long.
Abstract
Les courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR) dans des modèles animaux permettent une manipulation génétique précise pour l’étude des phénomènes physiologiques. Le poisson zèbre a été utilisé comme modèle génétique efficace pour étudier de nombreuses questions liées aux maladies héréditaires, au développement et à la toxicologie au niveau de l’organe entier et de l’organisme. En raison du génome du poisson zèbre bien annoté et cartographié, de nombreux outils d’édition de gènes ont été développés. Cependant, l’efficacité de la génération et la facilité de détection des modifications précises à l’aide de CRISPR sont un facteur limitant. Décrit ici est une approche knock-in basée sur CRISPR-Cas9 avec la détection simple de modifications précises dans un gène responsable de la repolarisation cardiaque et associé au trouble électrique, le syndrome du QT long (LQTS). Cette approche à deux ARN à guide unique (ARNg) excise et remplace la séquence cible et relie un gène rapporteur génétiquement codé. L’utilité de cette approche est démontrée en décrivant des mesures phénotypiques non invasives de la fonction électrique cardiaque chez des larves de poisson-zèbre de type sauvage et génétiquement modifiées. Cette approche permet l’étude efficace des variantes associées à la maladie dans un organisme entier. De plus, cette stratégie offre des possibilités d’insertion de séquences exogènes de choix, telles que des gènes rapporteurs, des orthologues ou des éditeurs de gènes.
Introduction
Les stratégies d’édition de gènes basées sur CRISPR dans des modèles animaux permettent l’étude des maladies génétiquement héréditaires, du développement et de la toxicologie au niveau de l’organisme entier 1,2,3. Le poisson zèbre fournit un modèle puissant qui est plus proche de l’homme dans de nombreux aspects physiologiques que les modèles cellulaires murins ou dérivés de l’homme4. Un large éventail d’outils et de stratégies génétiques ont été utilisés chez le poisson zèbre pour le dépistage génétique avant5 et inverse6. La cartographie génétique complète et l’annotation chez le poisson-zèbre ont facilité les approches d’édition de gènes en tant que technique principale pour concevoir des knockouts de gènes ciblés (KO) et des knock-ins précis (KI)7.
Malgré cela, la génération de modifications précises du KI chez le poisson zèbre est limitée par le faible rendement et la difficulté d’une détection précise. Bien que les nucléases effectrices de type facteur de transcription (TALEN) aient été utilisées avec succès et optimisées pour les KI8, CRISPR fournit une stratégie d’édition de gènes améliorée avec un ciblage plus simple de l’ARNg. De nombreuses études ont utilisé CRISPR pour générer des KI précis chez le poisson-zèbre 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, bien que ces modifications générées par la réparation dirigée par homologie (HDR) médiée par CRISPR aient tendance à être inefficaces avec un faible succès intrinsèque Taux nécessitant le génotypage comme dépistage primaire 9,10,14,21. Cela démontre la nécessité d’un système KI CRISPR efficace chez le poisson zèbre, ainsi que d’un système fiable à haut débit pour détecter les modifications précises.
L’objectif de cette étude était de décrire une plate-forme pour générer un gène cardiaque précis KI dans les cœurs de poisson zèbre avec une détection simple et à haut débit des modifications réussies. Une approche de remplacement d’exons à deux ARNg basée sur CRISPR-Cas9 est décrite, qui est basée sur une approche TALEN8. Cette approche implique l’excision de la séquence cible à l’aide de guides à deux ARNg et son remplacement par une séquence modèle exogène contenant le KI d’intérêt ainsi qu’un gène rapporteur intronique génétiquement codé (Figure 1). L’intégration d’un rapporteur fluorescent génétiquement codé dans la séquence intronique du gène cible permet la détection efficace des modifications positives. Une plateforme de phénotypage est ensuite décrite pour évaluer la fonction électrique cardiaque chez les larves de poisson zèbre pour la caractérisation non invasive des variantes génétiques associées au LQTS héréditaire, un trouble électrique cardiaque qui prédispose les individus à la mort cardiaque subite.
Ces approches amélioreront l’accès et l’utilisation des modifications du gène KI du poisson zèbre pour modéliser les maladies héréditaires et aborder des questions biologiques et physiologiques, telles que la cartographie des profils d’expression génique et la régulation du développement. Étant donné que les cœurs de poisson-zèbre correspondent mieux aux caractéristiques électrophysiologiques cardiaques humaines que les modèles murins, ils peuvent être particulièrement attrayants en tant que système génétiquement traitable pour la modélisation des maladies cardiaques 7,22,23.
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Protocol
Les études utilisant le poisson zèbre ont été menées en accord avec les politiques et procédures du Comité de protection des animaux de l’Université Simon Fraser et du Conseil canadien de protection des animaux et ont été réalisées conformément au protocole # 1264K-18.
1. Conception de composants CRISPR pour des montages précis
- Pour concevoir les guides à deux ARNg qui seront utilisés pour exciser la séquence contenant le site cible du KI, identifiez d’abord l’orthologue du poisson zèbre pour le gène d’intérêt.
REMARQUE : La figure 2 fournit un aperçu sommaire des étapes permettant de concevoir des modifications précises à l’aide de l’approche CRISPR-Cas9 à deux sgRNA. - Ensuite, utilisez un outil logiciel de conception, tel que CRISPOR24, qui comprend la sélection de Danio rerio en tant qu’espèce et de l’enzyme Cas à utiliser.
NOTE: Le gène d’intérêt pour cette étude était zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), et la mutation cible était l’acide aminé, R56Q.- Pour l’approche à deux ARNg, choisissez un emplacement d’ARNg qui précède l’exon cible et un deuxième ARNg situé dans l’intron en aval immédiat.
- Assurez-vous que les sgRNA sélectionnés ont une spécificité élevée et une faible liaison hors cible prévue. Utilisez les classements CRISPOR pour identifier les guides avec une liaison hors cible minimale. Ne considérez pas les guides qui ne présentent pas de discordances dans la séquence de départ des cibles potentielles hors cible.
- Identifier les sites hors cible potentiels les plus probables (sur la base des scores CRISPOR, sélectionnez les trois premiers sites potentiels hors cible des exons) pour le génotypage du séquençage de Sanger basé sur la PCR à l’étape 6.1.3.
- Une fois les deux ARNg sélectionnés, obtenir le complément inverse pour chacun, de sorte qu’il y ait quatre oligonucléotides à utiliser : deux oligos complémentaires qui précèdent la mutation et deux oligos complémentaires qui sont en aval.
- Sur chacun des quatre oligos, ajouter des sites de restriction compatibles pour l’incorporation dans un plasmide guide de votre choix; pour l’intégration dans le plasmide DR274, utilisez un site de restriction BsaI 5' pour créer un surplomb. Assurez-vous que le site de reconnaissance Bsa1 est conçu à l’extrémité 5' du guide choisi dans CRISPOR et que le site de reconnaissance Bsa1 est conçu à l’extrémité 5' des brins complémentaires pour assurer une orientation correcte des guides dans le plasmide DR274 (voir Figure 3).
- Pour concevoir le modèle exogène utilisé pour le HDR chez le poisson zèbre (Figure 1), choisissez deux fragments de séquence qui flanqueront le gène rapporteur yfp mVenus logé dans le plasmide pKHR5.
REMARQUE : La modification/modification prévue peut être incluse dans le fragment en amont ou en aval.- À l’aide d’Ensembl, localisez le site cible dans la séquence de gènes d’intérêt, y compris approximativement la séquence flanquante de 2 kb (bras d’homologie), qui sera utilisée pour créer le modèle.
NOTE: Les bras d’homologie peuvent être symétriques ou asymétriques25,26 et environ 1 kb chacun, en amont et en aval du site cible. - Divisez le gabarit en deux segments qui seront insérés de chaque côté du gène rapporteur mVenus YFP (voir Figure 4). Assurez-vous que le site de division est dans un intron afin que la séquence de codage ne soit pas interrompue.
REMARQUE: Si le gène est bien caractérisé, vérifiez les rôles fonctionnels dans l’intron, tels que les sites d’épissage ou les régions régulatrices. Les régions proches des extrémités 5' ou 3' sont plus souvent impliquées dans l’épissage de l’ARNm. - Incorporer des modifications dans la séquence matrice qui comprennent i) des mutations silencieuses dans le motif adjacent du protoespaceur guide (PAM) ou la séquence de graines (soyez conscient des sites PAM alternatifs que l’enzyme Cas pourrait cibler) pour empêcher la recoupe de l’enzyme Cas ; ii) la modification de l’intérêt; iii) la création de sites endonucléases de restriction pour faciliter le clonage dans le plasmide pKHR5, qui contient le gène rapporteur yfp mVenus (voir Figure 3).
NOTE: Dans cette étude, le premier segment de modèle contenait XhoI en amont du site de mutation R56Q et SalI en aval, tandis que le deuxième segment de modèle avait EcoRI en amont de la séquence cible guide et BamHI en aval. Si l’un des sites de restriction sélectionnés est présent dans la séquence de modèles, des mutations pour les réduire au silence seront nécessaires, ou d’autres approches telles que l’assemblage Gibson peuvent être utilisées.
- À l’aide d’Ensembl, localisez le site cible dans la séquence de gènes d’intérêt, y compris approximativement la séquence flanquante de 2 kb (bras d’homologie), qui sera utilisée pour créer le modèle.
2. Préparation des composants CRISPR pour la micro-injection embryonnaire
- Préparez le Cas9 pour la micro-injection 1 semaine avant les micro-injections. Utilisez la protéine Cas9 ou préparez l’ARNm Cas9 par transcription in vitro .
REMARQUE: Dans cette étude, l’ARNm Cas9 a été utilisé, car les efficacités avaient tendance à être plus élevées.- Amplifier les cultures bactériennes de gélose bactérienne XL1 Blue disponibles dans le commerce (contenant du plasmide Cas9) à l’aide d’un antibiotique approprié tel que l’ampicilline. Utilisez 675 μL de culture liquide (avec 325 μL de glycérol) pour créer un stock de glycérol de secours pour un stockage à long terme à -80 °C.
- Utilisez le reste de la culture liquide pour une purification miniprep, selon le protocole fourni avec le kit miniprep. Resuspendre l’ADN purifié final dans 50 μL du tampon d’élution fourni. Quantifier le produit à l’aide d’un spectrophotomètre pour examiner le rendement et la pureté.
- Linéariser 2 μg de l’ADN purifié par digestion de restriction à l’aide d’une enzyme de restriction appropriée et en utilisant le tampon et le temps d’incubation appropriés indiqués pour l’enzyme d’intérêt.
- Purifier le plasmide linéarisé à l’aide d’un kit de purification PCR, en le remettant en suspension dans 30 μL du tampon d’élution fourni.
- Après avoir quantifié le produit, utilisez-le comme modèle pour la transcription in vitro en utilisant le kit de transcription approprié pour le promoteur d’intérêt. Suivez le protocole fourni et purifiez par précipitation de chlorure de lithium27. Remettez en suspension l’ARN purifié dans 10 μL deH2Osans nucléase et quantifiez-le avant de le stocker à −20 °C pour l’utiliser dans le mélange de micro-injection.
- Préparez les deux guides sgRNA.
- Préparer le plasmide d’ARNg avec un échafaudage en amplifiant les cultures bactériennes à partir de la gélose bactérienne XL1 Blue disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) de la même manière que MLM3613 ci-dessus (étape 2.1.1), sauf utiliser la kanamycine au lieu de l’ampicilline.
- Recuit les deux paires d’oligonucléotides monocaténaires complémentaires (ssODN) pour les guides sgRNA conçus ci-dessus en remettant d’abord en suspension les ssODN dans un tampon de recuit 1x à une concentration de 100 μM.
- Dans des réactions séparées pour chacun des deux sgRNA, recuit la paire de ssODN complémentaires à l’aide d’un cycleur thermique. Mélanger 2 μg de chaque paire complémentaire de ssODN avec 50 μL de tampon de recuit et incuber à 95 °C pendant 2 min, puis refroidir à 25 °C pendant 45 min.
- Digérer un plasmide disponible dans le commerce qui contient un échafaudage d’ARNg. Digérer 2 μg du plasmide DR274 en utilisant 1 μL de BsaI, 2 μL de tampon approprié et ddH2O à 20 μL à 37 °C pendant 1 h. Confirmer la linéarisation (facultatif : purifier à l’aide d’un kit de purification PCR) à l’aide de l’électrophorèsesur gel 28.
- Dans deux réactions de ligature distinctes (une pour chaque sgRNA), ligaturer les ssODN recuits avec le plasmide linéarisé DR274. Utilisez un rapport molaire:vecteur de 3:1, en calculant la masse appropriée à l’aide d’un calculateur de ligature en ligne. Mélanger la masse requise de l’insert et du vecteur avec 1 μL d’ADN ligase T4, 2 μL de tampon de ligature et ddH2Oà 12 μL et incuber à température ambiante pendant 12 h.
- Transformer 2 μL du produit ligaturé en cellules compétentes appropriées (telles que des cellules 10β) en utilisant des approches standard, puis amplifier et purifier le produit à l’aide d’un kit Miniprep disponible dans le commerce. Facultatif : créez un stock de glycérol de ce produit.
- Transcrire les deux ARNg en linéarisant 2 μg de chaque guide à l’aide d’un site de restriction en aval de 3' qui est aussi proche que possible de la fin de la séquence spatiale. Pour le plasmide DR274, linéariser avec HindIII, puis purifier le modèle d’ARN à l’aide d’un kit de purification PCR, en remettant en suspension dans 30 μL du tampon d’élution.
- Transcrire les deux guides à l’aide d’un kit de transcription d’ARN. Suivez le protocole du fabricant et purifiez par précipitation de chlorure de lithium27. Resuspendre les deux guides d’ARNg purifiés dans 10 μL deH2Oexempt de nucléase, quantifier et conserver à −20 °C pour être utilisés dans le mélange de micro-injection.
REMARQUE: Le kit de transcription de l’ARN ne peut pas incorporer une calotte de 5' ou une queue poly-A.
- Préparez le modèle de rapporteur HDR double brin et exogène.
REMARQUE: Le modèle est synthétisé en deux parties, une en amont et une en aval du gène rapporteur mVenus YFP. Ces deux segments sont des constructions synthétiques commandées par l’intermédiaire d’un fournisseur commercial, puis ligaturées séquentiellement dans le plasmide pKHR5 (qui contient mVenus YFP).- Préparer le plasmide pKHR5 en amplifiant les cultures bactériennes de la souche bactérienne DH5α disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) de la même manière que le MLM3613 ci-dessus (étape 2.1.1).
REMARQUE: Le plasmide pKHR5 contient la séquence du gène rapporteur yfp mVenus. - Resuspendez les deux segments de modèle conçus ci-dessus à 100 μM dans le tampon TE, puis transformez-les en cellules 10β.
- Digérer le premier segment modèle (celui en amont du gène rapporteur yfp mVenus) et le plasmide pKHR5 à l’aide des enzymes de restriction sélectionnées à l’étape 1.3.3.
REMARQUE : Un condensé séquentiel de pKHR5 est nécessaire en raison de la proximité des sites de restriction sélectionnés dans le MCS. - Pour préparer le plasmide pKHR5 pour le segment de matrice en amont, digérer 4 μg de pKHR5 (selon l’étape 2.2.4) avec SalI, puis purifier à l’aide d’un kit de purification PCR. Remettez en suspension dans 30 μL deddH2Oet utilisez-le comme modèle pour la deuxième réaction de digestion avec XhoI. Purifiez le produit à l’aide du kit de purification PCR.
- Préparer le premier segment de gabarit en digérant 2 μg du segment de matrice (étape 2.3.2), 1 μL de XhoI, 1 μL de SalI, 2 μL de tampon approprié et ddH2O à 20 μL pendant 1 h à 37 °C et purifier le produit sur gélifier.
- Librez le segment de gabarit en amont de l’étape 2.3.5 dans le pKHR5 préparé en utilisant les conditions de réaction décrites à l’étape 2.2.5. Transformez le produit ligaturé en cellules 10β compétentes, amplifiez et purifiez à l’aide d’une miniprep (facultatif: créez un stock de glycérol de ce produit).
- Utiliser le produit ligaturé de l’étape 2.3.6 (qui contient le premier segment de modèle ligaturé en plasmide pKHR5 en amont du gène rapporteur yfp mVenus) et le digérer pour préparer le deuxième segment de modèle (en aval du rapporteur mVenus). Digérer 4 μg du produit ligaturé (à partir de l’étape 2.3.6, comme à l’étape 2.2.4) avec BamHI, puis purifier à l’aide d’un kit de purification PCR. Remettez en suspension dans 30 μL deddH2Oet utilisez-le comme modèle pour la deuxième réaction de digestion avec EcoRI. Purifiez le produit à l’aide du kit de purification PCR.
- Préparer le deuxième segment de matrice en digérant 2 μg du segment de matrice (étape 2.3.2), 1 μL de BamHI, 1 μL d’EcoRI, 2 μL de tampon approprié et ddH2O à 20 μL pendant 1 h à 37 °C et gélifier le produit.
- Librer le segment de gabarit en aval dans le pKHR5 préparé (à partir de l’étape 2.3.7) en utilisant les conditions de réaction décrites à l’étape 2.2.5. Transformez le produit ligaturé en cellules compétentes, amplifiez et purifiez à l’aide d’un kit miniprep. Créer un stock de glycérol de ce produit final, qui contient les deux segments matriciels ligaturés de chaque côté du gène rapporteur mVenus YFP dans pKHR5.
- Préparer le plasmide pKHR5 en amplifiant les cultures bactériennes de la souche bactérienne DH5α disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) de la même manière que le MLM3613 ci-dessus (étape 2.1.1).
- Préparez le mélange de micro-injection en utilisant l’ARNm Cas9, deux ARNg et le modèle de rapporteur HDR exogène.
- Mélanger 200 ng/μL d’ARNm Cas9, 100 ng/μL de chaque ARNg et 200 ng/μL de modèle de rapporteur HDR exogène dans un tampon d’injection 1x jusqu’à un volume final de 20 μL.
- Entreposer le mélange pour microinjection à −20 °C et jeter le mélange inutilisé après trois cycles de congélation-décongélation.
REMARQUE: Utilisez 4 nL de ce mélange de micro-injection pour la micro-injection dans le sac vitellin de chaque embryon.
3. Elevage de poisson-zèbre et microinjection d’embryons
NOTE: Les protocoles pour l’élevage du poisson zèbre et la micro-injection d’embryons unicellulaires ont été décrits précédemment 29,30,31.
- Pour la reproduction, utilisez des poissons-zèbres de la souche AB âgés de 6 à 12 mois. Injecter les embryons au stade unicellulaire environ 40 minutes après la fécondation (voir Figure 5).
REMARQUE : Le sexe biologique des embryons injectés n’était pas connu; Le dimorphisme sexuel n’est pas évident avant l’âgede 32 mois environ.
4. Criblage génique rapporteur du poisson-zèbre larvaire édité par CRISPR-Cas9
- Visualisez l’intégration YFP dans les larves de poisson-zèbre après la micro-injection de composants CRISPR-Cas9 pour dépister les modifications HDR réussies.
- Dans une boîte de Petri de 25 mm, anesthésier 24 larves de poisson zèbre 3 jours après la fécondation (dpf) dans du sulfonate de méthane à 0,3 % de tricaïne (MS-222, tamponné à pH 7,0-7,4 avec HEPES et hydroxyde de sodium) jusqu’à ce qu’elles perdent leur réflexe d’auto-redressement (généralement 1-2 min). Une fois anesthésiée, transférer chaque larve dans un puits individuel d’une plaque de 24 puits.
- À l’aide d’un microscope capable de détecter la GFP/YFP, dépister la fluorescence du gène rapporteur dans les yeux de chaque larve.
- Capturez des images de chaque larve et documentez la présence ou l’absence d’expression du gène rapporteur.
5. Phénotypage de larves de poisson-zèbre édité par CRISPR-Cas9
- Après le dépistage du gène rapporteur, effectuer un phénotypage cardiaque (fréquence cardiaque, dimensions péricardiques, ECG) sur chaque larve. Phénotype un nombre égal de larves de gènes rapporteurs positifs et négatifs.
- Utilisez une caméra CCD (p. ex., blackfly USB3) et un logiciel d’enregistrement vidéo et d’images (p. ex., Micromanager for ImageJ) pour mesurer la fréquence cardiaque et les dimensions péricardiques pendant que les larves sont anesthésiées.
- Pour mesurer la fréquence cardiaque, à l’aide de Micromanager, créez une région d’intérêt (ROI) afin de capturer le cœur et d’exclure d’autres structures.
- Importez la vidéo dans ImageJ en tant que séquence d’images et assurez-vous que le nombre correct d’images est entré sous le nombre d’images.
- Une fois le fichier ouvert, utilisez l’outil de sélection de rectangle pour dessiner un retour sur investissement dans le cœur, mais à l’exclusion d’autres éléments mobiles, et enregistrez le retour sur investissement dans le gestionnaire de retour sur investissement (analysez | outils | Gestionnaire de retour sur investissement).
- Cliquez sur les plug-ins | installer, sélectionnez l’algorithme de fréquence cardiaque pour installer le code dans le dossier par défaut, puis sélectionnez le plug-in en bas de l’onglet plug-ins . Enregistrez les battements par minute (bpm) à partir de la fenêtre contextuelle.
REMARQUE: Les algorithmes de détection d’images ont été écrits sur mesure pour détecter la fréquence cardiaque en mesurant les changements de densité de pixels individuels associés à la contraction systolique ventriculaire. Le code peut être trouvé à https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Mesurez les dimensions péricardiques à l’aide d’un outil gratuit tel qu’ImageJ pour dessiner librement des ROI autour du sac péricardique et de l’un des yeux. Ouvrez l’image dans ImageJ et utilisez l’outil de sélection de polygones pour dessiner d’abord un retour sur investissement autour du sac péricardique, en l’enregistrant dans le gestionnaire de retour sur investissement comme à l’étape 5.1.2, puis répétez pour l’œil. Sélectionnez ces deux ROI dans la gestion du ROIr, puis cliquez sur mesurer. Enregistrer l’aire de chacun pour calculer plus tard la surface du sac péricardique normalisée au contour des yeux chez chaque larve.
- Après les mesures de la fréquence cardiaque et du péricarde, enregistrer l’ECG de larves individuelles.
NOTE: Les protocoles d’enregistrement de l’ECG du poisson zèbre ont été décrits précédemment33,34,35,36.
6. Génotypage de larves de poisson-zèbre édité par CRISPR-Cas9
- À la suite d’analyses phénotypiques, effectuer un génotypage hors cible et potentiel afin de confirmer l’édition exacte et précise du gène HDR.
- Anesthésier chaque larve de 3 dpf dans du MS-222 à 0,3% et un clip de queue pour isoler l’ADNg en utilisant la méthode HOTShot37. Incuber chaque pince de queue excisée dans 15 μL de NaOH 25 mM à 95 °C pendant 20 min. Ensuite, neutraliser avec 1,5 μL de Tris-HCl et centrifuger à 13 800 x g pendant 30 s. Conservez le surnageant, qui contient l’ADNg extrait.
- Récupérer les larves dans un milieu E3 et les remettre dans le système de logement si d’autres aménagements ou études sont prévus.
- En utilisant l’ADNg extrait comme modèle, effectuez un séquençage Sanger basé sur la PCR des sites cibles et potentiels hors cible.
REMARQUE: Facultatif: une approche PCR imbriquée peut être bénéfique pour certaines régions génétiques. - Assurez-vous que la conception de l’amorce sur la cible capture le site de mutation et le site de liaison de l’ARNg le plus proche. Concevoir une amorce de séquençage distincte pour détecter la transition entre le bras d’homologie inséré et le gène cible afin de confirmer l’intégration dans le gène d’intérêt. Concevoir des amorces pour séquencer les trois principaux sites potentiels hors cible identifiés à l’étape 1.2.3.
REMARQUE: Les logiciels de conception de guides suggèrent souvent des amorces à utiliser, mais une personnalisation peut être nécessaire pour obtenir des résultats optimaux. - Compiler le génotypage sur et hors cible, la fréquence cardiaque, les dimensions péricardiques, le phénotypage ECG et les données génétiques rapporteures identifiables pour chaque poisson zèbre.
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Representative Results
L’utilisation réussie de cette approche CRISPR de remplacement d’exon à deux ARNG est mise en évidence par l’introduction et la détection simple d’une modification précise pour concevoir la variante associée au LQTS, R56Q, dans le gène zkcnh6a chez le poisson zèbre. La figure 6 montre 3 larves dpf représentatives injectées au stade embryon unicellulaire avec des composants CRISPR comme décrit ci-dessus. La figure 6A montre la présence de l’expression du gène rapporteur YFP mVenus dans le cristallin en tant que rapporteur positif de l’intégration réussie du modèle. La figure 6B,C montre les chromatogrammes de séquençage de Sanger obtenus à partir d’ADN génomique isolé à partir d’échantillons de coupures de queue de poissons de type sauvage et de gènes rapporteurs positifs, respectivement. Les poissons porteurs de gènes positifs ont été trouvés pour avoir l’édition précise, G à A, qui introduit la variante R56Q dans zkcnh6a. Le génotypage a montré une corrélation de 100% entre l’expression du gène rapporteur YFP et la présence de l’édition précise du gène R56Q, validant cet outil de dépistage par fluorescence.
Le phénotypage de larves de poisson-zèbre génétiquement modifiées a été effectué à 3 dpf. La figure 7 montre des résultats représentatifs des larves de type sauvage et des larves génétiquement modifiées par le gène R56Q. La fréquence cardiaque a été détectée par capture vidéo comme décrit ci-dessus. Un exemple de mesure des dimensions péricardiques en rapport avec le contour des yeux est présenté (figure 7A). La figure 7B représente la fréquence cardiaque en fonction des dimensions péricardiques normalisées, mettant en évidence une tendance à la bradycardie avec augmentation de l’œdème péricardique, qui est associée à des troubles de la repolarisation cardiaque chez le poisson zèbre 8,38,39,40. La figure 7C montre un exemple représentatif d’enregistrements ECG de 3 larves dpf. Les intervalles standard (QT, QRS) ont été mesurés à partir de signaux ECG moyennés.
Figure 1 : Intégration du modèle HDR dans le génome du poisson zèbre. Gris foncé, bras d’homologie; vert, sgRNA guide les cibles avec mutation silencieuse pour empêcher la redécoupe de Cas9; gris clair, exon cible d’intérêt; ligne rouge, mutation ponctuelle; jaune, gène rapporteur mVenus YFP sous un promoteur de α-cristalline; Les lignes pointillées indiquent l’homologie. Ici, l’édition précise ciblée était R56Q dans l’exon 2 du gène zkcnh6a. Abréviations : HDR = réparation dirigée par homologie; sgRNA = ARN monoguide; YFP = protéine fluorescente jaune; DSB = rupture double brin; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résumé des étapes pour concevoir des modifications précises dans les gènes du poisson zèbre à l’aide de l’approche CRISPR-Cas9 à deux ARNg (les numéros d’étape du protocole connexes sont indiqués entre parenthèses). Abréviations : sgRNA = ARN monoguide; YFP = protéine fluorescente jaune; ADNg = ADN génomique; ECG = électrocardiogramme; DPF = jours après la fécondation; MS-222 = sulfonate de méthane de tricaïne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation de fragments de gabarit exogènes et de guides d’ARNg. (A) Digestion séquentielle et ligature de fragments matriciels en amont et en aval de la séquence du gène rapporteur yfp mVenus dans pKHR5. (B) Recuit de paires d’ARNg complémentaires avec surplomb de restriction pour la ligature en DR274. Abréviations : sgRNA = ARN monoguide; YFP = protéine fluorescente jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Construction du modèle HDR. Gris foncé, bras d’homologie; vert, sgRNA guide les cibles avec mutation silencieuse pour empêcher la redécoupe de Cas9; gris clair, exon cible d’intérêt; ligne rouge, mutation ponctuelle; jaune, gène rapporteur mVenus YFP sous un promoteur de α-cristalline; Ligne bleu foncé, ajout de sites de restriction. Les deux fragments de gabarit sont intégrés dans le donneur plasmidique pKHR5. Abréviations : HDR = réparation dirigée par homologie; sgRNA = ARN monoguide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Micro-injection d’embryons unicellulaires de poisson-zèbre avec des composants CRISPR-Cas9. Barre d’échelle = 0,5 mm. Abréviations : HDR = réparation dirigée par homologie; sgRNA = ARN monoguide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : La détection facile de la fluorescence du gène rapporteur YFP de mVenus indique une intégration positive du modèle exogène HDR dans le gène cible. (A) Exemple d’expression de mVénus YFP dans un œil de poisson zèbre (flèche) chez une larve de poisson zèbre éditée. (B) Les modifications réussies sont confirmées par le séquençage des chromatogrammes (gauche, WT; droite, édition R56Q). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse phénotypique des conséquences cardiaques chez 3 poissons-zèbres dpf suite à l’édition précise de R56Q dans le gène cible zkcnh6a. (A) Détection d’images des dimensions péricardiques par rapport à la taille des yeux à l’aide de l’outil polygonal dans ImageJ. Les limites du sac péricardique ont été marquées par l’utilisateur à partir d’une seule image d’enregistrement en fonction des changements de translucidité et de pigmentation. Des exemples de dimensions péricardiques normales et d’épanchement péricardique sont présentés. Barre d’échelle = 0,5 mm. (B) Corrélation entre les dimensions péricardiques (par rapport à la dimension oculaire) et la fréquence cardiaque, R2 = 0,33. (C) Exemple d’enregistrement ECG d’un cœur de larve de poisson zèbre à 3 dpf (à gauche) et de complexes moyens (à droite). Fréquence cardiaque, 131 bpm; intervalle QTc corrigé de la fréquence cardiaque, 460 ms. Abréviations : dpf = jours après la fécondation; ECG = électrocardiogramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’ingénierie de modifications génétiques précises à l’aide de CRISPR-Cas9 est remise en question par la faible efficacité des mécanismes HDR et leur détection efficace. Ici, une approche de remplacement d’exons à deux ARNg basée sur CRISPR-Cas9 est décrite qui produit des modifications précises chez le poisson zèbre avec une détection visuelle directe des modifications positives. L’efficacité de cette approche est démontrée en générant des modifications précises dans le gène zkcnh6a . Cet article montre comment la fonction cardiaque chez les larves de poisson-zèbre génétiquement modifiées peut être évaluée à l’aide de mesures phénotypiques non invasives de la fréquence cardiaque, des dimensions péricardiques et de la morphologie de l’ECG. Cette approche, de l’introduction d’une modification de gène à l’évaluation phénotypique, peut être complétée du début à la fin en environ 1 semaine.
Les avantages de l’approche d’édition et de phénotypage ci-dessus sont la facilité de conception de la modification CRISPR, la large applicabilité dans plusieurs systèmes physiologiques, la capacité d’insérer de gros gènes ou des fragments de gènes, et la capacité de suivre les effets des variantes longitudinalement à travers le développement et les générations. Le succès des modifications précises dans cette approche peut être lié à la combinaison de la grande taille du modèle (en raison de l’insertion du gène rapporteur et des longs bras d’homologie), qui a été montré pour augmenter l’efficacité des modifications dans le poisson zèbre14, et de la stratégie à deux guides d’ARNG, qui a été utilisée efficacement dans les modifications induites par TALEN8 du poisson zèbre.
Une force particulière de l’approche décrite est la capacité d’insérer de gros gènes ou des fragments de gènes. Cela peut être utile, par exemple, pour insérer des orthologues humains41, permettant une caractérisation et une comparaison plus cliniquement traduisibles entre les orthologues. Alternativement, des gènes codant pour les enzymes Cas pourraient également être insérés, permettant une lignée de poisson-zèbre avec des mécanismes d’édition CRISPR in vivo , fournissant un système inductible. De même, d’autres mécanismes CRISPR, tels que l’édition principale, pourraient être intégrés et aboutir à une ligne de poissons-zèbres facilement édités avec précision et efficacité.
Malgré les avantages de cette approche, il existe certaines limites. Tout d’abord, un seul gène et un seul locus ont été modifiés, et d’autres tests sur d’autres sites ou dans d’autres gènes sont nécessaires pour évaluer l’étendue de l’applicabilité de cette approche. En raison des longs bras d’homologie nécessaires, les coûts de conception du modèle sont plus élevés; toutefois, cela peut être compensé par un dépistage efficace. Une autre limite est que l’approche de dépistage nécessite une capacité de détection par fluorescence. Cependant, les exigences optiques sont relativement faibles et peuvent être construites sur mesure ou achetées commercialement à un coût raisonnablement bas. L’utilisation d’une approche à deux ARNg augmente le nombre d’événements potentiels hors cible; cependant, cela est probablement atténué par la probabilité plus faible que les deux guides de l’ARNg soient tous deux recuits d’une manière qui facilite l’incorporation du modèle pour produire l’expression du gène rapporteur. Enfin, l’utilisation de l’ARNm Cas9 peut conduire à des mosaïcismes car le Cas9 n’est actif qu’à des stades de développement ultérieurs. Cela pourrait s’expliquer par le séquençage de types de tissus particuliers; Cependant, étant donné la taille des larves de poisson zèbre, cela est techniquement difficile.
En résumé, cette approche d’édition précise à deux ARNg CRISPR-Cas9 chez le poisson zèbre permet la détection visuelle simple des modifications positives et peut être adaptée pour incorporer de grands gènes d’intérêt à n’importe quel locus. Combiné à des mesures phénotypiques, cela permet d’obtenir une plate-forme fiable et à haut débit pour l’étude de variantes cardiaques cliniquement pertinentes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par une subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (C.T.T.) et des subventions à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (C.T.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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