Summary
Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för att underlätta exakta knock-in-redigeringar i zebrafiskembryon med CRISPR-Cas9-teknik. En fenotypningspipeline presenteras för att demonstrera tillämpligheten av dessa tekniker för att modellera en lång QT-syndromassocierad genvariant.
Abstract
Grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR) i djurmodeller möjliggör exakt genmanipulation för studier av fysiologiska fenomen. Zebrafisk har använts som en effektiv genetisk modell för att studera många frågor relaterade till ärftlig sjukdom, utveckling och toxikologi på helorgan- och -organismnivå. På grund av det väl kommenterade och kartlagda zebrafiskgenomet har många verktyg för genredigering utvecklats. Effektiviteten av att generera och underlätta att upptäcka exakta knock-in-redigeringar med CRISPR är dock en begränsande faktor. Här beskrivs en CRISPR-Cas9-baserad knock-in-metod med enkel detektering av exakta redigeringar i en gen som är ansvarig för hjärtrepolarisering och associerad med den elektriska störningen, Long QT Syndrome (LQTS). Detta två-en-guide-RNA (sgRNA) tillvägagångssätt skär ut och ersätter målsekvensen och länkar en genetiskt kodad reportergen. Nyttan av detta tillvägagångssätt demonstreras genom att beskriva icke-invasiva fenotypiska mätningar av hjärtats elektriska funktion i vildtyp och genredigerade zebrafisklarver. Detta tillvägagångssätt möjliggör effektiv studie av sjukdomsassocierade varianter i en hel organism. Dessutom erbjuder denna strategi möjligheter för införande av exogena sekvenser av val, såsom reportergener, ortologer eller genredigerare.
Introduction
CRISPR-baserade genredigeringsstrategier i djurmodeller möjliggör studier av genetiskt ärftlig sjukdom, utveckling och toxikologi på helorganismnivå 1,2,3. Zebrafiskar ger en kraftfull modell som i många fysiologiska aspekter är närmare människor än murina eller mänskliga härledda cellmodeller4. Ett omfattande utbud av genetiska verktyg och strategier har använts i zebrafisk för både framåt5 och omvänd genetisk screening6. Omfattande genetisk kartläggning och annotering hos zebrafisk har underlättat genredigeringsmetoder som en primär teknik för att konstruera riktade genknockouts (KO) och exakta knock-ins (KIs)7.
Trots detta begränsas genereringen av exakta KI-redigeringar i zebrafisk av låg effektivitet och svårigheten att exakt upptäcka. Även om transkriptionsfaktorliknande effektornukleaser (TALENs) framgångsrikt har använts och optimerats för KIs8, ger CRISPR en förbättrad genredigeringsstrategi med enklare sgRNA-inriktning. Många studier har använt CRISPR för att generera exakta KI i zebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, även om dessa redigeringar som genereras genom CRISPR-medierad homologistyrd reparation (HDR) tenderar att vara ineffektiva med låg inneboende framgång priser som kräver genotypning som primär skärm 9,10,14,21. Detta visar på behovet av ett effektivt KI CRISPR-system inom zebrafisk, samt ett pålitligt system med hög genomströmning för att upptäcka exakta redigeringar.
Målet med denna studie var att beskriva en plattform för att generera en exakt hjärtgen KI i zebrafiskhjärtan med enkel och hög genomströmningsdetektering av framgångsrika redigeringar. En CRISPR-Cas9-baserad två-sgRNA exon-ersättningsmetod beskrivs, som är baserad på en TALEN-metod8. Detta tillvägagångssätt involverar excision av målsekvensen med hjälp av två-sgRNA-guider och ersättning med en exogen mallsekvens som innehåller KI av intresse samt en genetiskt kodad intronic reportergen (figur 1). Integrationen av en genetiskt kodad fluorescerande reporter i målgenens introniska sekvens möjliggör effektiv detektion av positiva redigeringar. En fenotypningsplattform beskrivs sedan för att bedöma hjärtats elektriska funktion hos zebrafisklarver för icke-invasiv karakterisering av genvarianterna associerade med ärftlig LQTS, en hjärtelektrisk störning som predisponerar individer för plötslig hjärtdöd.
Dessa tillvägagångssätt kommer att förbättra tillgången till och användningen av zebrafisk-KI-genredigeringar för att modellera ärftliga sjukdomar och ta itu med biologiska och fysiologiska frågor, såsom kartläggning av genuttrycksmönster och utvecklingsreglering. Eftersom zebrafiskhjärtan bättre parallella mänskliga hjärtelektrofysiologiska egenskaper än murina modeller, kan de vara särskilt attraktiva som ett genetiskt lätthanterligt system för hjärtsjukdomsmodellering 7,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier med zebrafisk genomfördes i enlighet med policyerna och förfarandena för Simon Fraser University Animal Care Committee och Canadian Council of Animal Care och slutfördes enligt protokoll # 1264K-18.
1. Design av CRISPR-komponenter för exakta redigeringar
- För att utforma de två-sgRNA-guider som kommer att användas för att skära ut sekvensen som innehåller KI-målstället, identifiera först zebrafiskortologen för genen av intresse.
Figur 2 ger en sammanfattande översikt över stegen för att konstruera exakta redigeringar med hjälp av två-sgRNA CRISPR-Cas9-metoden. - Använd sedan ett designprogramverktyg, till exempel CRISPOR24, som inkluderar urval för Danio rerio som art och av Cas-enzymet som ska användas.
OBS: Genen av intresse för denna studie var zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), och målmutationen var aminosyra, R56Q.- För två-sgRNA-metoden, välj en sgRNA-plats som föregår målexonen och en andra sgRNA som ligger inom den omedelbara nedströmsintronen.
- Se till att de valda sgRNA:erna har hög specificitet och låg förutsagd bindning utanför målet. Använd CRISPOR-rankningar för att identifiera stödlinjer med minimal bindning utanför målet. Tänk inte på guider utan avvikelser i frösekvensen för potentiella off-targets.
- Identifiera de mest troliga potentiella off-target-platserna (baserat på CRISPOR-poäng, välj de tre bästa exon-potentiella off-target-platserna) för PCR-baserad Sanger-sekvensering av genotypning i steg 6.1.3.
- När de två sgRNA har valts, erhålla det omvända komplementet för varje, så att det finns fyra oligonukleotider som ska användas: två komplementära oligos som föregår mutationen och två komplementära oligos som är nedströms.
- På var och en av de fyra oligosna, lägg till kompatibla begränsningsställen för införlivande i en valfri guideplasmid; för integration i DR274-plasmiden, använd en 5 'BsaI-begränsningsplats för att skapa ett överhäng. Se till att Bsa1-igenkänningsplatsen är konstruerad i slutet av 5' av guiden som valts från CRISPOR och att Bsa1-igenkänningsplatsen är konstruerad i 5'-änden av de kompletterande strängarna för att säkerställa korrekt orientering av guiderna i DR274-plasmiden (se figur 3).
- För att designa den exogena mallen som används för HDR i zebrafisk (figur 1), välj två sekvensfragment som kommer att flankera mVenus YFP-reportergenen som finns i pKHR5-plasmiden.
Den avsedda ändringen/redigeringen kan inkluderas i antingen uppströms- eller nedströmsfragmentet.- Använd Ensembl för att lokalisera målplatsen inom gensekvensen av intresse, inklusive ungefär 2 kb flankerande sekvens (homologiarm), som kommer att användas för att skapa mallen.
OBS: Homologiarmar kan vara symmetriska eller asymmetriska25,26 och cirka 1 kb vardera, uppströms och nedströms målplatsen. - Dela upp mallen i två segment som kommer att infogas på vardera sidan av mVenus YFP-reportergenen (se figur 4). Se till att den delade platsen är i en intron så att kodningssekvensen inte avbryts.
OBS: Om genen är väl karakteriserad, kontrollera om det finns funktionella roller i intronen, såsom skarvningsställen eller reglerande regioner. Regioner nära 5 'eller 3' ändarna är oftare involverade i mRNA-skarvning. - Inkorporera modifieringar i mallsekvensen som inkluderar i) tysta mutationer i guideprotospacer intilliggande motiv (PAM) eller frösekvens (var medveten om alternativa PAM-platser som Cas-enzymet kan rikta in sig på) för att förhindra Cas-enzymrecutting; ii) ändring av ränta; iii) skapandet av restriktionsendonukleasställen för att underlätta kloning i pKHR5-plasmiden, som innehåller mVenus YFP-reportergenen (se figur 3).
OBS: I den här studien innehöll det första mallsegmentet XhoI uppströms R56Q-mutationsplatsen och SalI nedströms, medan det andra mallsegmentet hade EcoRI uppströms styrmålsekvensen och BamHI nedströms. Om någon av de valda begränsningsplatserna finns i mallsekvensen krävs mutationer för att tysta dessa, eller så kan alternativa metoder som Gibson Assembly användas.
- Använd Ensembl för att lokalisera målplatsen inom gensekvensen av intresse, inklusive ungefär 2 kb flankerande sekvens (homologiarm), som kommer att användas för att skapa mallen.
2. Beredning av CRISPR-komponenter för embryomikroinjektion
- Förbered Cas9 för mikroinjektion 1 vecka före mikroinjektionerna. Använd Cas9-protein eller förbered Cas9 mRNA via in vitro-transkription.
OBS: I denna studie användes Cas9 mRNA, eftersom effektiviteten tenderade att vara högre.- Förstärk bakteriekulturer av kommersiellt tillgänglig XL1 Blue bakteriell agar stab (innehållande Cas9-plasmid) med hjälp av ett lämpligt antibiotikum såsom ampicillin. Använd 675 μl flytande kultur (med 325 μl glycerol) för att skapa en reservglycerolstam för långtidsförvaring vid −80 °C.
- Använd resten av vätskekulturen för en miniprep-rening, enligt protokollet som medföljer miniprep-satsen. Återsuspendera det slutliga renade DNA:t i 50 μl av den tillhandahållna elueringsbufferten. Kvantifiera produkten via en spektrofotometer för att undersöka utbytet och renheten.
- Linarisera 2 μg av det renade DNA:t via restriktionsuppslutning med hjälp av ett lämpligt restriktionsenzym och med användning av lämplig buffert och inkubationstid enligt vad som anges för det enzym som är av intresse.
- Rena den linjäriserade plasmiden med hjälp av ett PCR-reningssats och återsuspendera den i 30 μL av den medföljande elueringsbufferten.
- Efter att ha kvantifierat produkten, använd detta som en mall för in vitro-transkription med hjälp av lämpligt transkriptionssats för den intressanta promotorn. Följ det angivna protokollet och rena via litiumkloridutfällning27. Återsuspendera det renade RNA i 10 μl nukleasfrittH2Ooch kvantifiera det innan det förvaras vid −20 °C för användning i mikroinjektionsblandningen.
- Förbered de två sgRNA-guiderna.
- Bered sgRNA-plasmiden med en byggnadsställning genom att förstärka bakteriekulturer från den kommersiellt tillgängliga XL1 Blue bacterial agar stab (se materialförteckningen för detaljer) på samma sätt som MLM3613 ovan (steg 2.1.1), förutom att använda kanamycin istället för ampicillin.
- Glödga de två paren av komplementära enkelsträngade oligonukleotider (ssODN) för sgRNA-styrningarna utformade ovan genom att först återsuspendera ssODN i 1x glödgningsbuffert till en koncentration av 100 μM.
- I separata reaktioner för var och en av de två sgRNA: erna, glödga paret av komplementära ssODN med hjälp av en termisk cykler. Blanda 2 μg av varje komplementärt ssODN-par med 50 μl glödgningsbuffert och inkubera vid 95 °C i 2 minuter och svalna sedan till 25 °C under 45 minuter.
- Smälta en kommersiellt tillgänglig plasmid som innehåller en gRNA-ställning. Röta 2 μg DR274-plasmiden med användning av 1 μl BsaI, 2 μl lämplig buffert och ddH 2O–20μl vid 37 °C i 1 timme. Bekräfta linjärisering (valfritt: rena med ett PCR-reningssats) med gelelektrofores28.
- I två separata ligeringsreaktioner (en för varje sgRNA) ligerar de glödgade ssODN: erna med den linjäriserade DR274-plasmiden. Använd ett molart insert: vector-förhållande på 3: 1, beräkna lämplig massa genom en online-ligeringskalkylator. Blanda den erforderliga massan av insatsen och vektorn med 1 μL T4 DNA-ligas, 2 μL ligeringsbuffert och ddH2O-12μL och inkubera vid rumstemperatur i 12 timmar.
- Omvandla 2 μl av den ligerade produkten till lämpliga kompetenta celler (t.ex. 10β-celler) med hjälp av standardmetoder och förstärk och rena sedan produkten med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt Miniprep Kit. Valfritt: skapa ett glycerollager av denna produkt.
- Transkribera de två sgRNA genom att linjärisera 2 μg av varje guide med hjälp av en 3 'nedströms begränsningsplats som är så nära slutet av rymdsekvensen som möjligt. För DR274-plasmiden, linjärisera med HindIII och rena sedan RNA-mallen med hjälp av ett PCR-reningssats och återsuspendera i 30 μL av elueringsbufferten.
- Transkribera de två guiderna med hjälp av ett RNA-transkriptionssats. Följ tillverkarens protokoll och rena via litiumkloridutfällning27. Återsuspendera de två renade sgRNA-styrningarna i 10 μl nukleasfritt H2O, kvantifiera och förvara vid −20°C för användning i mikroinjektionsblandningen.
NOTERA: RNA-transkriptionssatsen kan inte innehålla en 5'-keps eller poly-A-svans.
- Förbered den dubbelsträngade, exogena HDR-reportermallen.
OBS: Mallen syntetiseras i två delar, en uppströms och en nedströms om mVenus YFP-reportergenen. Dessa två segment är syntetiska konstruktioner som beställs via en kommersiell leverantör och sedan ligeras in i pKHR5 (som innehåller mVenus YFP) plasmid sekventiellt.- Bered pKHR5-plasmiden genom att förstärka bakteriekulturer från den kommersiellt tillgängliga DH5α-bakteriestammen (se materialförteckningen för detaljer) på samma sätt som MLM3613 ovan (steg 2.1.1).
OBS: pKHR5-plasmiden innehåller gensekvensen mVenus YFP-reporter. - Återuppfinna de två mallsegmenten som utformats ovan till 100 μM i TE-buffert och omvandlas sedan till 10β-celler.
- Smält det första mallsegmentet (det uppströms mVenus YFP-reportergenen) och pKHR5-plasmiden med hjälp av restriktionsenzymerna som valdes i steg 1.3.3.
OBS: Sekventiell nedbrytning av pKHR5 är nödvändig på grund av närheten till de valda restriktionsställena i MCS. - För att förbereda pKHR5-plasmiden för uppströms mallsegmentet, smält 4 μg pKHR5 (enligt steg 2.2.4) med SalI och rena sedan med hjälp av ett PCR-reningssats. Återsuspendera i 30 μL ddH2O och använd detta som en mall för den andra matsmältningsreaktionen med XhoI. Rena produkten med PCR-reningssatsen.
- Förbered det första mallsegmentet genom att smälta 2 μg av mallsegmentet (steg 2.3.2), 1 μL XhoI, 1 μL SalI, 2 μL lämplig buffert och ddH2O till 20 μL i 1 timme vid 37 °C och gelrena produkten.
- Lima uppströmsmallsegmentet från steg 2.3.5 in i den förberedda pKHR5 med hjälp av de reaktionsbetingelser som beskrivs i steg 2.2.5. Omvandla den ligerade produkten till kompetenta 10β-celler, förstärka och rena med hjälp av en miniprep (valfritt: skapa ett glycerollager av denna produkt).
- Använd den ligerade produkten från steg 2.3.6 (som innehåller det första mallsegmentet ligerat i pKHR5-plasmid uppströms mVenus YFP-reportergenen) och smält för att förbereda dig för det andra (nedströms mVenus reporter) mallsegmentet. Röta 4 μg av den ligerade produkten (från steg 2.3.6, som i steg 2.2.4) med BamHI, och rena sedan med hjälp av en PCR-reningssats. Återsuspendera i 30 μlddH2Ooch använd detta som mall för den andra rötreaktionen med EcoRI. Rena produkten med PCR-reningssatsen.
- Förbered det andra mallsegmentet genom att smälta 2 μg av mallsegmentet (steg 2.3.2), 1 μL BamHI, 1 μL EcoRI, 2 μL lämplig buffert och ddH2O till 20 μL i 1 timme vid 37 °C och gelrena produkten.
- Ligera nedströmsmallsegmentet i den förberedda pKHR5 (från steg 2.3.7) med hjälp av de reaktionsbetingelser som beskrivs i steg 2.2.5. Omvandla den ligerade produkten till kompetenta celler, förstärka och rena med hjälp av ett miniprep-kit. Skapa ett glycerollager av denna slutprodukt, som innehåller båda mallsegmenten ligerade på vardera sidan av mVenus YFP-reportergenen inom pKHR5.
- Bered pKHR5-plasmiden genom att förstärka bakteriekulturer från den kommersiellt tillgängliga DH5α-bakteriestammen (se materialförteckningen för detaljer) på samma sätt som MLM3613 ovan (steg 2.1.1).
- Förbered mikroinjektionsblandningen med Cas9 mRNA, två sgRNA och den exogena HDR-reportermallen.
- Blanda 200 ng/μL Cas9 mRNA, 100 ng/μL av varje sgRNA och 200 ng/μL exogen HDR-reportermall i 1x injektionsbuffert till en slutlig volym på 20 μL.
- Förvara mikroinjektionsblandningen vid −20 °C och kassera den oanvända blandningen efter tre frys- och upptiningscykler.
OBS: Använd 4 nL av denna mikroinjektionsblandning för mikroinjektion i äggula sac av varje embryo.
3. Uppfödning av zebrafisk och embryomikroinjektion
OBS: Protokoll för zebrafiskuppfödning och mikroinjektion av encelliga embryon har beskrivits tidigare 29,30,31.
- För avel, använd zebrafisk av AB-stammen och som är 6-12 månaders ålder. Injicera embryona i encellsstadiet vid cirka 40 minuters efterbefruktning (se figur 5).
OBS: Det biologiska könet hos de injicerade embryona var inte känt. sexuell dimorfism är inte uppenbar förrän vid ungefär 3 månaders ålder32.
4. Reportergenscreening av CRISPR-Cas9-redigerad larvzebrafisk
- Visualisera YFP-integration i zebrafisklarver efter mikroinjektion av CRISPR-Cas9-komponenter för att screena för framgångsrika HDR-redigeringar.
- I en 25 mm petriskål, bedöva 24 zebrafisklarver vid 3 dagar efter befruktning (dpf) i 0,3% tricainmetansulfonat (MS-222, buffrat till pH 7,0-7,4 med HEPES och natriumhydroxid) tills de förlorar sin självrätande reflex (vanligtvis 1-2 min). När du är bedövad, överför varje larva till en enskild brunn av en 24-brunnsplatta.
- Med hjälp av ett mikroskop som kan detektera GFP/YFP, screena för reportergenfluorescens i ögonen på varje enskild larv.
- Ta bilder av varje larva och dokumentera närvaron eller frånvaron av reportergenuttryck.
5. Fenotypning av CRISPR-Cas9-redigerad larvzebrafisk
- Efter reportergenscreening, utför hjärtfenotypning (hjärtfrekvens, perikardiella dimensioner, EKG) på varje larva. Fenotyp lika många reportergenpositiva och -negativa larver.
- Använd en CCD-kamera (t.ex. blackfly USB3) och programvara för video- och bildinspelning (t.ex. Micromanager för ImageJ) för att mäta hjärtfrekvens och perikardiella dimensioner medan larverna bedövas.
- För att mäta hjärtfrekvensen, med hjälp av Micromanager, skapa en region av intresse (ROI) för att fånga hjärtat och utesluta andra strukturer.
- Importera videon till ImageJ som en bildsekvens och se till att rätt antal bildrutor anges under antal bilder.
- När filen är öppen använder du rektangelmarkeringsverktyget för att rita en ROI i hjärtat men exklusive andra rörliga element och spara ROI i ROI-hanteraren (analysera | verktyg | ROI-chef).
- Klicka på plugins | installera och välj pulsalgoritmen för att installera koden i standardmappen och välj sedan plugin längst ner på fliken plugins . Spela in slag per minut (bpm) från popup-fönstret.
OBS: Bilddetekteringsalgoritmer skrevs för att upptäcka hjärtfrekvens genom att mäta individuella pixeldensitetsförändringar associerade med ventrikulär systolisk sammandragning. Koden finns på https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Mät perikardiella dimensioner med ett gratis verktyg som ImageJ för att fritt rita ROI runt perikardialsäcken och ett av ögonen. Öppna bilden i ImageJ och använd polygonvalsverktyget för att rita en ROI först runt perikardialsäcken, spara den i ROI-hanteraren som i steg 5.1.2 och upprepa för ögat. Välj dessa två ROI:er i ROI-hanteringenr och klicka sedan på mät. Registrera området för var och en för att senare beräkna arean av perikardiell säck normaliserad till ögonområdet i varje larva.
- Efter hjärtfrekvens- och perikardiella mätningar, registrera EKG från enskilda larver.
OBS: Protokoll för registrering av zebrafisk-EKG har beskrivits tidigare33,34,35,36.
6. Genotypning av CRISPR-Cas9-redigerad larvzebrafisk
- Efter fenotypiska analyser, genomföra on- och potentiell off-target genotypning för att bekräfta korrekt och exakt HDR-genredigering.
- Bedöva varje 3 dpf larva i 0,3% MS-222 och svansklämma för att isolera gDNA med HOTShot-metoden37. Inkubera varje utskuren svansklämma i 15 μl 25 mM NaOH vid 95 °C i 20 minuter. Neutralisera sedan med 1,5 μL Tris-HCl och centrifugera vid 13 800 x g i 30 s. Behåll supernatanten, som innehåller extraherad gDNA.
- Återställ larverna i E3-media och återför dem till bostadssystemet om ytterligare utveckling eller studie är avsedd.
- Använd det extraherade gDNA som mall för att utföra PCR-baserad Sanger-sekvensering av mål- och potentiella off-target-platser.
OBS: Valfritt: en kapslad PCR-metod kan vara fördelaktig för vissa genregioner. - Se till att primerdesignen på målet fångar mutationsstället och närmaste sgRNA-bindningsställe. Designa en separat sekvenseringsprimer för att detektera övergången från den infogade homologiarmen och målgenen för att bekräfta integrationen i genen av intresse. Utforma primers för att sekvensera de tre bästa potentiella off-target-platserna som identifierades i steg 1.2.3.
OBS: Guide-design program föreslår ofta primers att använda, men anpassning kan vara nödvändigt för att uppnå optimala resultat. - Kompilera genotypning på och utanför målet, hjärtfrekvens, perikardiella dimensioner, EKG-fenotypning och reportergendata som kan identifieras för varje zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den framgångsrika användningen av denna två-sgRNA exon-ersättnings-CRISPR-metod framhävs av introduktionen och enkel detektion av en exakt redigering för att konstruera den LQTS-associerade varianten, R56Q, i zkcnh6a-genen i zebrafisk. Figur 6 visar representativa 3 dpf-larver injicerade i encellsembryostadiet med CRISPR-komponenter enligt beskrivningen ovan. Figur 6A visar närvaron av YFP mVenus reportergenuttryck i ögonlinsen som en positiv reporter för framgångsrik mallintegration. Figur 6B,C visar Sanger-sekvenseringskromatogram erhållna från genomiskt DNA isolerat från svansklippprover av vildtyp respektive reportergenpositiv fisk. Reportergenpositiva fiskar visade sig ha den exakta redigeringen, G till A, som introducerar R56Q-varianten i zkcnh6a. Genotypning visade en 100% korrelation mellan YFP-reportergenuttryck och närvaron av den exakta R56Q-genredigeringen, vilket validerade detta fluorescensscreeningsverktyg.
Fenotypning av genredigerade zebrafisklarver utfördes vid 3 dpf. Figur 7 visar representativa resultat från vildtyps- och R56Q-genredigerade larver. Hjärtfrekvensen upptäcktes genom videoinspelning enligt beskrivningen ovan. Ett exempel på mätning av perikardiella dimensioner som ett förhållande mellan ögonområdet visas (figur 7A). Figur 7B plottar hjärtfrekvensen mot normaliserade perikardiella dimensioner, vilket belyser en trend av bradykardi med ökande perikardiellt ödem, vilket är förknippat med störningar i hjärtrepolarisering hos zebrafisk 8,38,39,40. Figur 7C visar ett representativt exempel på EKG-inspelningar från 3 dpf larver. Standardintervall (QT, QRS) mättes från genomsnittliga EKG-signaler.
Figur 1: Integrering av HDR-mall i zebrafiskgenomet. Mörkgrå, homologi armar; gröna, sgRNA-guidemål med tyst mutation för att förhindra Cas9-omskärning; ljusgrå, målexon av intresse; röd linje, punktmutation; gul, mVenus YFP-reportergen under en α-kristallinpromotor; streckade linjer indikerar homologi. Här var den riktade exakta redigeringen R56Q i exon 2 av zkcnh6a-genen . Förkortningar: HDR = homologi-riktad reparation; sgRNA = enstyrt RNA; YFP = gult fluorescerande protein; DSB = dubbelsträngad brytning; WT = vild typ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Sammanfattning av steg för att konstruera exakta redigeringar av zebrafiskgener med hjälp av två-sgRNA CRISPR-Cas9-metoden (relaterade protokollstegnummer anges inom parentes). Förkortningar: sgRNA = enstyrt RNA; YFP = gult fluorescerande protein; gDNA = genomiskt DNA; EKG = elektrokardiogram; dpf = dagar efter befruktning; MS-222 = tritainmetansulfonat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beredning av exogena mallfragment och sgRNA-guider . (A) Sekventiell matsmältning och ligering av mallfragment uppströms och nedströms mVenus YFP-reportergensekvensen i pKHR5. (B) Glödgning av komplementära sgRNA-par med restriktionsöverhäng för ligering i DR274. Förkortningar: sgRNA = enstyrt RNA; YFP = gult fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Konstruktion av HDR-mall. Mörkgrå, homologi armar; gröna, sgRNA-guidemål med tyst mutation för att förhindra Cas9-omskärning; ljusgrå, målexon av intresse; röd linje, punktmutation; gul, mVenus YFP-reportergen under en α-kristallinpromotor; mörkblå linje, tillagda begränsningsplatser. De två mallfragmenten är integrerade i pKHR5-plasmiddonatorn. Förkortningar: HDR = homologi-riktad reparation; sgRNA = enstyrt RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Mikroinjektion av encelliga zebrafiskembryon med CRISPR-Cas9-komponenter. Skalstång = 0,5 mm. Förkortningar: HDR = homologi-riktad reparation; sgRNA = enstyrt RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Enkel detektion av mVenus YFP-reportergenfluorescens indikerar positiv HDR-exogen mallintegration i målgenen. (A) Exempel på mVenus YFP-uttryck i ett zebrafisköga (pil) i en redigerad zebrafisklarv. (B) Framgångsrika redigeringar bekräftas genom sekvensering av kromatogram (vänster, WT; höger, R56Q-redigering). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Fenotypisk analys av hjärtkonsekvenser hos 3 dpf zebrafisk efter den exakta R56Q-redigeringen i målgenen zkcnh6a. (A) Bilddetektering av perikardiella dimensioner i förhållande till ögonstorlek med hjälp av polygonverktyget i ImageJ. Gränserna för perikardialsäcken markerades av användaren från en enda inspelningsram baserat på förändringar i genomskinlighet och pigmentering. Exempel på normala perikardiella dimensioner och perikardiell effusion visas. Skalstreck = 0,5 mm. (B) Korrelation mellan perikardiella dimensioner (i förhållande till ögondimension) och hjärtfrekvens, R2 = 0,33. (C) Exempel på EKG-inspelning från ett 3 dpf zebrafisklarvhjärta (vänster) och genomsnittliga komplex (höger). Hjärtfrekvens, 131 slag per minut; pulskorrigerat QTc-intervall, 460 ms. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; EKG = elektrokardiogram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruktionen av exakta genredigeringar med CRISPR-Cas9 utmanas av HDR-mekanismernas låga effektivitet och deras effektiva detektering. Här beskrivs en CRISPR-Cas9-baserad två-sgRNA exon-ersättningsmetod som ger exakta redigeringar i zebrafisk med enkel visuell detektering av positiva redigeringar. Effekten av detta tillvägagångssätt demonstreras genom att generera exakta redigeringar i zkcnh6a-genen . Denna uppsats visar hur hjärtfunktionen hos genredigerade zebrafisklarver kan bedömas med hjälp av icke-invasiva fenotypiska mått på hjärtfrekvens, perikardiella dimensioner och EKG-morfologi. Detta tillvägagångssätt, från att införa en genredigering till fenotypisk utvärdering, kan slutföras från början till slut inom cirka 1 vecka.
Fördelarna med ovanstående redigerings- och fenotypningsmetod är den enkla CRISPR-modifieringsdesignen, den breda tillämpligheten i flera fysiologiska system, förmågan att infoga stora gener eller genfragment och förmågan att spåra varianteffekter longitudinellt genom utveckling och generationer. Framgången med exakta redigeringar i detta tillvägagångssätt kan relateras till kombinationen av den stora mallstorleken (på grund av reportergeninsatsen och långa homologiarmar), vilket har visat sig öka effektiviteten hos redigeringar i zebrafisk14, och två-sgRNA-guider-strategin, som har använts effektivt i zebrafisk TALEN-inducerade redigeringar8.
En särskild styrka hos det beskrivna tillvägagångssättet är förmågan att infoga stora gener eller genfragment. Detta kan till exempel vara användbart för att infoga humana ortologer41, vilket möjliggör mer kliniskt översättbar karakterisering och jämförelse mellan ortologer. Alternativt kan gener som kodar för Cas-enzymer också sättas in, vilket möjliggör en linje av zebrafiskar med in vivo CRISPR-redigeringsmekanismer, vilket ger ett inducerbart system. På samma sätt kan alternativa CRISPR-mekanismer, såsom primtalsredigering, integreras och resultera i en rad zebrafiskar som lätt kan redigeras exakt och effektivt.
Trots fördelarna med detta tillvägagångssätt finns det vissa begränsningar. För det första har endast en enda gen och locus modifierats, och ytterligare tester på andra platser eller i andra gener är nödvändiga för att utvärdera hur allmänt tillämpligt detta tillvägagångssätt är. På grund av de långa homologiarmarna som krävs är malldesignkostnaderna högre; Detta kan dock uppvägas av effektiv screening. En annan begränsning är att screeningmetoden kräver fluorescensdetekteringsförmåga. Optiska krav är dock relativt låga och kan specialbyggas eller köpas kommersiellt till en rimligt låg kostnad. Att använda en två-sgRNA-metod ökar antalet potentiella händelser utanför målet; Detta mildras dock sannolikt av den lägre sannolikheten för att de två sgRNA-guiderna båda kommer att glödgas på ett sätt som underlättar införlivandet av mallen för att ge reportergenuttryck. Slutligen kan användning av Cas9 mRNA leda till mosaik eftersom Cas9 inte är aktiv förrän senare utvecklingsstadier. Detta kan förklaras genom sekvensering av vissa vävnadstyper; Men med tanke på zebrafisklarvernas storlek är detta tekniskt utmanande.
Sammanfattningsvis möjliggör denna CRISPR-Cas9 två-sgRNA exakta redigeringsmetod i zebrafisk enkel visuell detektering av positiva redigeringar och kan anpassas för att införliva stora gener av intresse på vilken plats som helst. I kombination med fenotypiska åtgärder möjliggör detta en pålitlig och hög genomströmningsplattform för att studera kliniskt relevanta hjärtvarianter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett kanadensiskt Institutes of Health Research Project-bidrag (T.W.C.) och naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada Discovery-bidrag (T.W.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
