Method Article

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم واسع المجال وثنائي الفوتون من فأر باستخدام نافذة جمجمة كبيرة

DOI:

10.3791/64224

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi, 2Department of Neuropharmacology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi, 3Yamanashi GLIA center, Interdisciplinary Graduate School of Medicine, University of Yamanashi, 4Department of Neurochemistry, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول الحالي صنع نافذة جمجمة كبيرة (6 × 3 مم2) باستخدام غلاف الطعام والسيليكون الشفاف وغطاء زجاجي. تسمح هذه النافذة القحفية في الجسم الحي بإجراء تجارب تصوير الكالسيوم واسعة المجال وثنائية الفوتون في نفس الفأر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح تصوير الكالسيوم واسع المجال من القشرة المخية الحديثة للفأر بمراقبة النشاط العصبي على مستوى القشرة المتعلقة بوظائف الدماغ المختلفة. من ناحية أخرى ، يمكن للتصوير ثنائي الفوتون حل نشاط الدوائر العصبية المحلية على مستوى الخلية الواحدة. من الأهمية بمكان إنشاء نافذة جمجمة كبيرة لإجراء تحليل متعدد النطاقات باستخدام تقنيتي التصوير في نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يجب على المرء إزالة جزء كبير من الجمجمة وتغطية السطح القشري المكشوف بمواد شفافة. في السابق ، تم تطوير الجماجم الزجاجية ونوافذ الجمجمة القائمة على البوليمر لهذا الغرض ، ولكن هذه المواد لا يتم تصنيعها بسهولة. يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لصنع نافذة جمجمة كبيرة تتكون من فيلم تغليف كلوريد البولي فينيليدين (PVDC) المتاح تجاريا ، وسدادة سيليكون شفافة ، وغطاء زجاجي. لتصوير السطح الظهري لنصف الكرة بأكمله ، كان حجم النافذة حوالي 6 × 3 مم2. لم تلاحظ اهتزازات الدماغ الشديدة بغض النظر عن هذه النافذة الكبيرة. الأهم من ذلك ، أن حالة سطح الدماغ لم تتدهور لأكثر من شهر واحد. كشف التصوير واسع المجال لفأر يعبر عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GECI) ، GCaMP6f ، وتحديدا في الخلايا النجمية ، عن استجابات متزامنة في بضعة ملليمترات. أظهر التصوير ثنائي الفوتون لنفس الفأر استجابات بارزة للكالسيوم في الخلايا النجمية الفردية على مدى عدة ثوان. علاوة على ذلك ، تم تطبيق طبقة رقيقة من فيروس مرتبط بالغدي على فيلم PVDC وعبر بنجاح عن GECI في الخلايا العصبية القشرية فوق نافذة الجمجمة. هذه التقنية موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لصنع نافذة جمجمة كبيرة وتسهل التحقيق في الديناميات العصبية والدبقية وتفاعلاتها أثناء السلوك على المستويين العياني والمجهري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبحث تصوير الكالسيوم واسع المجال بشكل فعال في نمط النشاط الزماني المكاني على مساحة كبيرة من دماغ الحيوان1،2،3. تم استخدام التصوير واسع المجال على نطاق واسع لمراقبة السطح القشري الكامل للقوارض نظرا لأن قشرتها مسطحة نسبيا2،3،4،5،6،7،8،9،10. يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الفئران المحقونة بالفيروس المرتبط بالغدي (AAV) ، والتي تعبر على وجه التحديد عن GECIs في خلايا مختلفة مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، لتصوير الكالسيوم واسع المجال11،12،13. ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية لهذه التقنية عادة لا تكفي لحل نشاط الخلايا الفردية في الجسم الحي14. كما أنها ليست مناسبة لتصوير الخلايا الموجودة في طبقات أعمق.

من ناحية أخرى ، يمكن لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون مراقبة نشاط خلايا متعددة في وقت واحد مع الدقة المكانية تحت الخلوية ، مما يسمح بمراقبة نشاط الخلايا الفردية حتى في التشعبات العصبية والعمليات الدبقية 15،16،17،18،19،20،21،22. يمكنه أيضا مراقبة الخلايا في الطبقات العميقة من القشرة الدماغية23,24. على الرغم من أن التطورات التكنولوجية الحديثة في الفحص المجهري ثنائي الفوتون تمكن من التصوير من المناطق القشرية بعرض ملليمتر25،26،27،28،29 ، إلا أنه لا يزال من الصعب مراقبة منطقة مماثلة للتصوير واسع المجال عن طريق التصوير ثنائي الفوتون.

لفهم الأهمية الفسيولوجية لنشاط الدماغ من خلية واحدة إلى الدماغ بأكمله ، من الأهمية بمكان سد الفجوة بين نشاط المناطق القشرية على القشرة بأكملها وذلك عند دقة الخلية الواحدة في الدوائر العصبية المحلية. لذلك ، فإن الجمع بين تصوير الكالسيوم واسع المجال والفوتون الذي يتم إجراؤه في نفس الماوس فعال بشكل خاص. لتحقيق ذلك ، يجب إنشاء نافذة جمجمة واسعة ومستقرة ، من الناحية المثالية على مدى فترة طويلة.

في السابق ، تم تطوير العديد من التقنيات لصنع نوافذ الجمجمة للسماح بإجراء تصوير واسع المجال وفوتونين في نفس الماوس30,31. تسمح النوافذ الزجاجية ذات الغطاء شبه المنحرف (الجمجمة البلورية) ، والتي يتم تشكيلها على شكل السطح القشري لتحل محل العظم الذي تمت إزالته ، بالوصول البصري عبر القشرة32 بأكملها. بدلا من ذلك ، يمكن صنع نوافذ الجمجمة القائمة على البوليمر باستخدام البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET)33 أو البوليمرات النانوية غير المتبلورة المطلية بأكسيد البولي إيثيلين34. وقد ثبت أن كل طريقة تحافظ على نافذة مستقرة لأكثر من 1 شهر. ومع ذلك ، فإن إنتاج هذه النوافذ ليس بالأمر السهل ، وغالبا ما تكون المواد والمعدات المستخدمة باهظة الثمن.

تصف الدراسة الحالية طريقة جديدة لصنع نافذة جمجمة كبيرة باستخدام فيلم PVDC (غلاف طعام بلاستيكي) (الشكل 1). باستخدام هذه النافذة ، يمكن إجراء تجارب التصوير واسعة المجال والفوتون في الجسم الحي في نفس الفئران. وقد تبين أيضا أنه يمكن التعبير عن GECIs في الخلايا العصبية على مساحة واسعة من قشرة الفئران عن طريق تشكيل طبقة رقيقة من الفيلم تحتوي على جزيئات AAV على الغلاف.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة التجارب على الحيوانات بجامعة ياماناشي. تم استخدام النوع البري (C57BL / 6J ، اليابان SLC) والفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن GECI المثبت بالغشاء (Lck-GCaMP6f) في الخلايا النجمية في هذه الدراسة. تم الحصول على الفئران المعدلة وراثيا عن طريق تهجين الفئران AldH1l1-CreERT2 [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J، تم الحصول عليها تجاريا، انظر جدول المواد] وفئران Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor/J، تم الحصول عليها تجاريا] الفئران. عولجت الفئران المحورة وراثيا بعقار تاموكسيفين (20 ملغم/مل) لمدة 5 أيام (0.05 مل/10 غ من وزن الجسم) للتعبير عن GCaMP6f. كانت جميع الفئران المستخدمة من الذكور والإناث بعمر 4 أسابيع على الأقل. يظهر مخطط النافذة في الشكل 1 أ ، ويتم تلخيص الإجراء الجراحي في الشكل 1 ب.

1. التحضير لجراحة نافذة الجمجمة

  1. تخدير الفئران باستخدام إيزوفلوران (التحريض: 3٪ ، الجراحة: 1٪ -1.5٪ ، معدل التدفق: 0.2-0.3 لتر / دقيقة). تأكد من عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس قرصة الذيل أو إصبع القدم. الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة (36-38 درجة مئوية). ضع مرهم العين بقطعة قطن لمنع عيون الفئران من الجفاف تحت التخدير.
  2. حقن 15٪ محلول مانيتول (انظر جدول المواد) داخل الصفاق (3 مل / 100 غرام من وزن الجسم). ثبت رأس الماوس على إطار مجسم مع قضبان الأذن. قم بإزالة الشعر من رأس الماوس باستخدام ماكينة حلاقة وكريم إزالة الشعر.
  3. تطهير سطح الجلد مع البوفيدون اليود والكحول ثلاث مرات. تطبيق يدوكائين موضعيا لتوفير تسكين وقائي. إزالة الجلد فوق المنطقة محل الاهتمام بمقص جراحي وفضح الجمجمة (الحجم: 15 × 15 مم). في حالة وجود نزيف ، استخدم قطعة قطن لوقف النزيف.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تمت إزالة الجلد لمراقبة قشرة الفص الجبهي إلى القشرة البصرية.
  4. قم بإزالة السمحاق فوق الجمجمة المكشوفة باستخدام مكشطة دقيقة وجفف سطح الجمجمة لربط لوحة الرأس بالجمجمة بإحكام بأسمنت الأسنان (انظر جدول المواد) (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: يتم إنشاء لوحة الرأس حسب الطلب باستخدام طابعة 3D. يتم إيداع ملف التصميم في مستودع Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).
  5. قم بتوصيل لوحة الرأس باستخدام الأسمنت السني (الشكل 2C). انتظر 20 دقيقة على الأقل حتى يتصلب الأسمنت. قم بتأمين لوحة الرأس بحامل لوحة الرأس35.

2. جعل نافذة الجمجمة

  1. قم بإزالة الأسمنت الزائد فوق الجمجمة باستخدام مثقاب الأسنان (انظر جدول المواد). احرص على عدم الحفر من خلال العظام وتلف الدماغ عن طريق الحفر.
  2. ضع علامة على المنطقة المراد قطعها بقلم وتقطيعها إلى العظم بمشرط. اجعل طرف المشرط غير مخترق الجمجمة (الشكل التكميلي 1). قم بالرجوع إلى أطلس الدماغ لتحديد مكان عمل النافذة.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم إنشاء نافذة بين -2 مم و +4 مم من bregma في المحور الأمامي الخلفي ومن الخيط السهمي إلى +3 مم في المحور المتوسط الجانبي ، بما في ذلك القشرة الحركية والحسية الجسدية والبصرية.
  3. كشط العظم بشكل متكرر باستخدام مشرط لتعميق الأخدود حتى يتحرك العظم في المنطقة المراد قصها جيدا عند لمسه برفق.
  4. قم بإزالة العظم المقطوع بملاقط دقيقة. لا تدفع رفرف العظم إلى الدماغ ، مما قد يؤدي إلى تلف الدماغ (الشكل 1 بأ).
    ملاحظة: إذا لوحظ نزيف بعد إزالة العظم ، فقم بتطبيق وشفط السائل النخاعي الاصطناعي على الفور (ACSF ، انظر جدول المواد) وكرر هذه العملية حتى يتوقف النزيف. بدلا من ذلك ، ضع إسفنجة جيلاتينية مرقئ (حوالي 3 مم مكعبات مربعة) منقوعة في ACSF على نقطة النزيف.
  5. إذا لم تتم إزالة الجافية ، فانتقل إلى الخطوة 2.7.
  6. قم بإزالة الأم الجافية باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بإزالة dura، على سبيل المثال، في الحالات التالية؛ النقل باستخدام طريقة فيلم fibroin-AAV36 ومراقبة الهياكل الصغيرة مثل العمود الفقري التغصني.
    2. قطع الجافية باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة مع طرف مدبب من حوالي 10 ميكرومتر. لتوسيع هذا القطع على النافذة بأكملها ، استخدم إبرة على شكل حرف U.
    3. اضبط تكبير المجهر المجسم على 60-100x وقم بإزالة الأم الجافية المقطوعة بملاقط متناهية الصغر. إذا كانت إزالة الأم الجافية تسبب النزيف ، اشطفها باستخدام ACSF أو استخدم إسفنجة جيلاتينية لوقف النزيف.
  7. قطع التفاف PVDC.
    1. تعقيم قطعة كبيرة (على سبيل المثال ، 10 × 15 مم) من غلاف PVDC (حوالي 11 ميكرومتر ، انظر جدول المواد ، الشكل 2 أ أ) عن طريق التعقيم والإيثانول بنسبة 70٪.
    2. تحت المجهر المجسم ، استخدم ملاقط ومشرط لقطع غلاف بالحجم المطلوب.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم الغلاف أكبر بحوالي 10 مم من حجم نافذة الجمجمة ولكن أصغر من فتحة لوحة الرأس. للحصول على نافذة جمجمة 6 × 3 مم 2 ، قم بإعداد غلاف 15 × 10 مم2.
  8. ضع الغلاف بدقة باتباع الخطوات أدناه.
    1. ضع الغلاف على سطح الدماغ ، تاركا ACSF على السطح. قم بامتصاص ACSF من حافة الغلاف ، مما يسمح للغلاف بالالتصاق بقوة بسطح الدماغ (الشكل 1Bب ، ج).
      ملاحظة: الغلاف المستخدم مقاوم للتجاعيد ، لذا فإن مجرد وضعه على سطح الدماغ لا ينتج عنه أي تجاعيد تقريبا.
    2. قم بقص الغلاف بمشرط وملاقط بحيث يكون هناك هامش 1 مم تقريبا بين حافة نافذة الجمجمة والتفاف (الشكل 1Bد).
    3. بمجرد وضع الغلاف في مكانه ، قم بلصق حافة الغلاف على الجمجمة بمادة لاصقة بيولوجية (انظر جدول المواد ، الشكل 2 د). اترك المادة اللاصقة تجف لمدة 30 دقيقة.
  9. ضع المطاط الصناعي السيليكوني الشفاف.
    1. ضع المطاط الصناعي السيليكوني الشفاف المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) أعلى الغلاف باستخدام موزع بطرف خلط (الشكل 1B e ، 2Ab-d) وضع زجاج الغطاء (سمك 0.12-0.17 مم) في الأعلى (الشكل 2E).
    2. أغلق محيط زجاج الغطاء بغشاء مقاوم للماء أو غراء فائق أو أسمنت أسنان (الشكل 1 بو).
  10. بعد الجراحة ، راقب الفأر حتى يستعيد وعيه للحفاظ على رقد القص. بعد ذلك ، احتفظ بالفئران بشكل فردي ، واسمح لها بالتعافي في قفصها المنزلي لمدة 7 أيام على الأقل.
    1. لتقليل التوتر والألم، يتم تطبيق العوامل المضادة للالتهابات والمسكنات (على سبيل المثال، ديكساميثازون وكيتوبروفين، 5 ملغ/كغ لكل منهما).
  11. مراقبة الفئران بانتظام للعدوى. إذا تم تأكيد العدوى، يجب إعطاء دواء مضاد للميكروبات (على سبيل المثال، 10٪ إنروفلوكساسين، 1.7 ميكرولتر/مل) في مياه الشرب حتى يتم القضاء على العدوى (عادة أقل من 4 أسابيع).

3. صنع فيلم AAV على غلاف بلاستيكي باستخدام محلول فيبروين

ملاحظة: الخطوة 3 اختيارية.

  1. تحضير محلول فيبروين من شرانق دودة القز باتباع طريقة منشورة مسبقا37.
    1. باختصار ، قم بغلي شرانق دودة القز العادية المتاحة تجاريا (5 جم ، انظر جدول المواد) في محلول كربونات الصوديوم (0.02 م ، 2 لتر). اغسل الشرانق في ماء عالي النقاء وجففها طوال الليل.
    2. قم بإذابة الشرانق المجففة في محلول بروميد الليثيوم (9.3 م ، 20٪ وزن / وزن فيبروين) أثناء تسخينها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قم بغسيل محلول الشرنقة المذاب ، جهاز الطرد المركزي (مرتين عند 12700 × جم ، عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة)37 ، واجمع المادة الطافية.
  2. قم بإعداد فيلم fibroin-AAV باتباع الخطوات أدناه.
    1. امزج محاليل الفبروين و AAV20 بنسبة 1: 4 في أنبوب عينة صغير باستخدام ماصة دقيقة. قم بإسقاط حصة من محلول fibroin-AAV المختلط على الغلاف البلاستيكي لنافذة الجمجمة ، وجففه لمدة 3 ساعات على الأقل.
      ملاحظة: للتعبير في منطقة قطرها 3 مم ، ضع قطرة 5 ميكرولتر من محلول fibroin-AAV. تحدد هذه النسبة مقدار الحل لمنطقة معينة.
    2. بعد التجفيف ، قم بقص الغلاف البلاستيكي بالحجم المطلوب للنافذة (على سبيل المثال ، 10 × 15 مم) وضعه على سطح الدماغ. ثم اتبع الطريقة المذكورة أعلاه من الخطوة 2.8.1 فصاعدا.
      ملاحظة: قبل وضع الغلاف على سطح الدماغ ، قم بإزالة ACSF على سطح الدماغ قدر الإمكان. وذلك لأنه من المتوقع أن يقوم ACSF بإذابة فيلم fibroin-AAV وتقليل تركيز جزيئات AAV.
    3. انتظر حوالي 2-4 أسابيع بعد إنشاء النافذة المعالجة ب AAV حتى يتم التعبير عن GECIs بشكل كاف. خلال هذه العملية ، تحقق من حالة الفئران والنوافذ بانتظام.

4. تصوير وتحليل الكالسيوم

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول التصوير والتحليل ، يرجى الاطلاع على التقارير المنشورة مسبقا1،2،38.

  1. قم بإجراء تصوير واسع المجال باتباع الخطوات أدناه.
    1. شل حركة الماوس باستخدام جهاز تثبيت الرأس تحت مجهر مضان العدسة الترادفية (انظر جدول المواد).
    2. قم بإضاءة القشرة الدماغية للفئران بضوء الإثارة من مصدر ضوء LED 465 نانومتر من خلال مرشح الإثارة ومرآة ثنائية اللون وعدسة موضوعية.
    3. اجمع صور مضان القشرة الدماغية بواسطة كاميرا CCD من خلال عدسة موضوعية (1.0x) ومرآة ثنائية اللون ومرشح انبعاث وعدسة تصوير (2.0x). مزيج من هذه العدسات يعطي تكبير إجمالي يبلغ حوالي 0.5x.
    4. الحصول على صور بتردد أخذ عينات يبلغ 50 هرتز. بعد الحصول على البيانات ، قم بتحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ. حدد منطقة الاهتمام (ROI) يدويا. احسب التغير الفلوري في كل عائد استثمار ك ΔF / F = (Ft - F0) / F0 ، حيث Ft هي قيمة التألق الخام لكل إطار و F0 هي متوسط قيمة التألق التي تم الحصول عليها من صورة متوسطة لجميع الإطارات.
      ملاحظة: يتم إيداع برنامج ماكرو ل ImageJ إلى GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro) ، الذي يحسب صور ΔF / F من بيانات تصوير الكالسيوم.
  2. قم بإجراء تصوير ثنائي الفوتون باتباع الخطوات أدناه.
    1. شل حركة الماوس تحت مجهر ثنائي الفوتون باستخدام جهاز تثبيت الرأس. حدد المنطقة المراد تصويرها باستخدام المجهر في وضع المجال الساطع باستخدام عدسة موضوعية منخفضة التكبير (5x).
    2. قم بالتبديل إلى التصوير ثنائي الفوتون. استخدم عدسة موضوعية عالية التكبير (16x أو 25x) وقم بإضاءة الليزر لإثارة فوتونين.
      ملاحظة: تم إثارة Lck-GCaMP6f22 الأخضر والأحمر XCaMP-R36 بواسطة ليزر فائق السرعة بأطوال موجية إثارة تبلغ 920 نانومتر و 1070 نانومتر على التوالي.
    3. الحصول على صور مضان عند 30 هرتز. بعد الحصول على البيانات ، قم بتصحيح القطع الأثرية للحركة من خلال وظيفة التسجيل لبرنامج suite2p39. احصل على عائد استثمار و ΔF / F من الصور باستخدام نفس الطريقة للتصوير واسع المجال.
  3. ارسم البيانات باستخدام python باستخدام المكتبات التالية: NumPy و Matplotlib و Pandas (انظر جدول المواد).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم نافذة الجمجمة الكبيرة المصنوعة باستخدام طرق التفاف PVDC
مباشرة بعد الجراحة ، يمكن التحقق من النجاح أو الفشل في لمحة من خلال حالة السطح القشري ، مثل النزيف وتغير اللون بسبب التلف أو نقص التروية. بعد فترة طويلة من الجراحة ، قد يتم تغطية السطح القشري بغشاء أبيض معتم بسبب العدوى ، أو قد يغطي الدم النافذة بسبب النزيف (الشكل 2G). في هذه الحالات ، قد لا تكون القشرة في حالة صحية ، وقد لا يكون التصوير ممكنا. يمكن أن يكون سبب ذلك اللفائف المقطوعة جزئيا أو التثبيت غير الكافي للغلاف بواسطة المادة اللاصقة. إذا لوحظت العدوى بشكل متكرر ، فقد يكون من الفعال تطبيق المضادات الحيوية ، على سبيل المثال ، كبريتات الجنتاميسين (10 ميكرولتر ، 50 مجم / مل) ، على سطح الدماغ عند وضع النافذة. يظهر تجديد السحايا أو العظام أيضا عندما تكون الفجوة الرأسية بين السطح القشري والتفاف كبيرة. لمنع ذلك ، يعد تطبيق الغلاف بإحكام قدر الإمكان على سطح الدماغ أثناء إعداد النافذة أمرا بالغ الأهمية. يمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع غلاف بلاستيكي على سطح الدماغ وامتصاص أكبر قدر ممكن من ACSF. في حالة عدم وجود ACSF ، يمكن القيام بذلك ببساطة عن طريق وضع الغلاف البلاستيكي على سطح الدماغ. يتم تحديد الدماغ والأوعية الدموية على أنها غير تالفة بسبب حقيقة أن لون الدماغ لا يتغير لونه ولا يتم قطع الأوعية الدموية.

يعتمد طول عمر النافذة إلى حد كبير على جودة الجراحة. عندما تكون الحالة جيدة ، لا توجد علامة على الإصابة أو النزيف أو التجديد بعد أكثر من شهر واحد من الجراحة (الشكل 2F والشكل 3B). في 8 من 10 فئران ، يمكن الحفاظ على النافذة خالية لمدة تصل إلى 10 أسابيع أو أكثر. لا يمكن صيانة النوافذ في اثنين من الفئران بشكل صحيح بسبب العدوى أو النزيف. على الرغم من أن النافذة الكبيرة قد تكون عرضة للإجهاد الميكانيكي أو التأثير ، إلا أنه لم يتم ملاحظة النوافذ المكسورة أو المتشققة.

لتقييم جودة التصوير لنافذة الجمجمة الجديدة مع الغلاف والسيليكون والزجاج ، تمت مقارنة وظيفة انتشار النقطة تحت النافذة الجديدة مع تلك الموجودة أسفل النافذة الزجاجية التقليدية عن طريق تصوير حبات فلورية 0.1 ميكرومتر في أجار (انظر الملف التكميلي 1). أظهرت النتائج عدم وجود فرق في العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لكلا الحالتين. [المحور X (ميكرومتر): زجاج فقط ، 1.99 ± 0.07 ، التفاف ، 1.76 ± 0.13 ، المحور Y (ميكرومتر): زجاج فقط ، 2.11 ± 0.27 ، التفاف ، 1.90 ± 0.15 ، المحور Z (ميكرومتر): زجاج فقط ، 25.29 ± 0.71 ، التفاف ، 26.64 ± 1.02 ، N = 7 خرز ، p > 0.05 ، اختبار Mann-Whitney U ، الشكل التكميلي 2A ، B]. لذلك ، فإن العناصر الجديدة المضافة (التفاف والسيليكون) لم تتدهور جودة التصوير.

توجد القطع الأثرية الاهتزازية الناتجة عن التنفس ونبضات القلب وحركة الجسم في التصوير واسع المجال والفوتون. لتحديد مقدار اهتزاز نافذة الجمجمة الجديدة ، تم اختيار جسيم فلوري صغير من بيانات التصوير ثنائية الفوتون في الجسم الحي وفحص مقدار تحرك صورته خلال 60 ثانية. وقد وجد أن الانحراف المعياري للسنترويد لهذا الجسيم الفلوري كان حوالي 0.3 ميكرومتر ، وهو ما يمكن مقارنته بالانحراف الموجود تحت نافذة زجاجية تقليدية (الشكل التكميلي 2C). يشير هذا إلى أنه نظرا لأن الدماغ كان مضغوطا بواسطة سدادة سيليكون شفافة وغطاء زجاجي ، فإن الاهتزازات كانت مماثلة لتلك التي لوحظت في النوافذ الصغيرة التقليدية ، وكان تسجيل الصور في وضع عدم الاتصال كافيا للقضاء على القطع الأثرية للاهتزاز.

في تصوير الكالسيوم واسع المجال ، يمكن ملاحظة النشاط القشري ينتشر عبر القشرة الناجم عن التحفيز الحسي (الشكل 3A-D ، K-N). سمح التصوير ثنائي الفوتون بمراقبة صور مضان الخلية الواحدة الخاصة بالخلايا العصبية والخلايا الدبقية (الشكل 3E ، O). يمكن ملاحظة التغيرات الفلورية الناجمة عن التحفيز الحسي في الخلايا الفردية (الشكل 3E-J ، O-T).

التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) في منطقة واسعة من القشرة الدماغية باستخدام غلاف PVDC و AAV
يمكن تطبيق غلاف PVDC للنافذة للتعبير عن البروتينات الوظيفية في منطقة واسعة من القشرة. يتم تحقيق ذلك باستخدام AAV و fibroin ، وهو بروتين مكون من شرانق دودة القز التي تم تطبيقها على نطاق واسع كمواد حيوية37. أظهرت دراسة سابقة أنه يمكن خلط الفبروين مع AAVs ، وتشكيل أفلام مزروعة في الدماغ للتعبير عن البروتينات الوظيفية مثل opsins القابلة للتنشيط الضوئي أو GECIs36. في الدراسة الحالية ، تم خلط AAV الذي يعبر عن GECI و fibroin وتجفيفه على الغلاف ، وتم استخدام غلاف مطلي ب AAV لنافذة الجمجمة. أدى ذلك إلى التعبير عن GECI على مساحة واسعة من القشرة بعد 2-4 أسابيع من الجراحة (الشكل 3K-M). نظرا لأن النافذة كانت كبيرة ، يمكن تصوير مناطق قشرية مختلفة من نفس الماوس (الشكل 3M-T).

لتأكيد كفاءة التعبير لهذه الطريقة ، تم حساب عدد الخلايا التي تعبر عن GECI في الدماغ الثابت (الشكل التكميلي 2D). وجد أن الاستراتيجية الحالية باستخدام الغلاف مع fibroin-AAV أدت إلى التعبير عن GECI بكفاءة تقارب 20٪ في كل من الطبقات السطحية والعميقة (L2 / 3: 20.78٪ ، XCaMP-R خلية تعبير: 32 خلية ، DAPI: 154 موقعا ، L5: 20.08٪ ، XCaMP-R خلية تعبير: 51 خلية ، DAPI: 254 موقعا). وهكذا ، عبرت هذه الطريقة عن GECIs في الخلايا ليس فقط في الطبقات السطحية ولكن أيضا في الطبقات الأعمق.

مخطط نافذة الجمجمة للفئران ، يوضح الإعداد لتصوير القشرة الدماغية بالسيليكون وزجاج الغطاء.
الشكل 1: مخطط مفاهيمي لنافذة الجمجمة الكبيرة. (أ) رسم تخطيطي على اليسار لنافذة الجمجمة الجديدة. إنه أكبر من النافذة التقليدية (قطر 3 مم). يمين ، عرض مقطعي. تستخدم طريقة صنع نافذة كبيرة في الجمجمة غلاف الطعام ، ومطاط السيليكون الشفاف ، وغطاء الزجاج ، مما يسمح بالتصوير واسع المجال والفوتونين من نفس الماوس. (ب) إجراء تصنيع نوافذ الجمجمة: (أ) إزالة العظام. (ب) إزالة ACSF تحت الغلاف. (ج) التصاق الغلاف بسطح الدماغ عن طريق إزالة ACSF. (د) قطع الغلاف الزائد. (ه) تطبيق السيليكون الشفاف. (و) لصق غطاء زجاجي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يظهر إعداد الإجراء الجراحي لزراعة نافذة الجمجمة مع المعدات التجريبية والنتائج.
الشكل 2: نظرة عامة على جراحة نافذة الجمجمة. (أ) المواد والمعدات اللازمة لنافذة الجمجمة. (أ) فيلم تغليف كلوريد البوليفينيليدين (PVDC). (ب) موزع من المطاط الصناعي السيليكوني الشفاف مع طرف خلط. (ج) غطاء زجاجي. (د) سيليكون شفاف يوضع بين قطعتين من زجاج الغطاء. (ب) صورة فوتوغرافية لجلد رأس فأر محفور لكشف الجمجمة. تم تخدير الفأر ، وتم تجميد رأس الفأر باستخدام قضبان الأذن. ثم تم نزع شعر الرأس ، وعولج بتسكين موضعي ، وتم شق الجلد. (ج) صورة فوتوغرافية بعد تركيب لوحة الرأس. تم إرفاق لوحة رأس (مصنوعة من الراتنج من طابعة 3D) برأس الماوس بأسمنت الأسنان. د: صورة لنافذة في الجمجمة. تم إنشاء نافذة الجمجمة في قشرة نصف الكرة الأيمن من دماغ الفأر. تمت إزالة الأم الجافية ، وتم لصق الغلاف في مكانه. (ه) صورة للنافذة المصنوعة من الغلاف مع السيليكون الشفاف وغطاء الزجاج في الأعلى. (F) مثال نموذجي لنافذة ناجحة (نصف الكرة الأيمن ، بعد 7 أسابيع من الجراحة). (ز) مثال على النافذة الفاشلة (نصفي الكرة الأرضية ، بعد 5 أسابيع من الجراحة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تصوير الكالسيوم بفأر TG يظهر استجابة لنفخة الهواء. الرسوم البيانية والرسوم البيانية لتحليل بيانات ΔF / F.
الشكل 3: تسمح النافذة الكبيرة بتصوير الكالسيوم واسع المجال والفوتونين من نفس الماوس. (أ) تم إجراء تصوير الكالسيوم في فأر معدل وراثيا يعبر عن GECI مثبت بالغشاء (Lck-GCaMP6f) في الخلايا النجمية40. (ب) على اليسار، تم إنشاء نافذة كبيرة بغلاف بلاستيكي وسيليكون شفاف وغطاء زجاجي. تم إجراء التصوير واسع المجال من خلال هذه النافذة. على اليمين ، تم التقاط صورة بعد 79 يوما من تثبيت نافذة الجمجمة. (ج) عند تطبيق تحفيز نفخة الهواء على الشعيرات المقابلة، لوحظت تغيرات مضانة. (د) تم رسم المسار الزمني لتغير التألق في القشرة الحسية الجسدية (المربع الأحمر في C). تشير الأشرطة الحمراء والزرقاء إلى توقيت نفخة الهواء وتوقيت "قبل" و "أثناء" و "بعد" في (C) ، على التوالي. ه: مجال الرؤية (FOV 1 في C) لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون. نظرا لأنه تم التعبير عن GCaMP6f للتوطين في الغشاء ، فقد تم وضع مناطق الاهتمام (المربعات البيضاء) يدويا للكشف عن الاستجابة المحلية في عمليات الخلايا النجمية. (و) تغيرات التألق في المربعات الملونة في (ه) مرسومة. (ز) تم رسم تغيرات التألق في جميع مربعات (ه). تشير المحاور الأفقية والرأسية إلى الوقت ورقم الخلية ، على التوالي. (ح-ج) يتم عرض بيانات FOV 2 (في القشرة البصرية) في (C). تم تصوير FOV 2 بعد التصوير في FOV 1. (ك) تم التعبير عن GECI الأحمر ، XCaMP-R ، في الخلايا العصبية بطريقة fibroin-AAV في الفأر من النوع البري. (L) صورة تم التقاطها بعد أسبوعين من الجراحة حيث تم إنشاء النافذة باستخدام فيلم fibroin. (M) تم إجراء تصوير الكالسيوم واسع المجال على هذا الماوس. (N) تم رسم التغير الفلوري الناتج عن تحفيز الشارب من الموقع الأبرز (القشرة الحسية الجسدية ، المربع الأحمر في (M)). تشير الخطوط الحمراء والزرقاء إلى توقيت نفخة الهواء وتوقيت "قبل" و "أثناء" في (M) ، على التوالي. (O) مجال الرؤية (القشرة الحسية الجسدية ، FOV 1 في (M)) لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون على عمق 300 ميكرومتر. تم وضع عائد الاستثمار يدويا في سوماتا العصبية. (P) يتم رسم تغيرات التألق في المربعات الملونة في (O). (س) تغيرات التألق في جميع مربعات (O) مرسومة بالألوان. (ر-ت) يتم عرض بيانات FOV 2 في (M) الموجودة في القشرة الجدارية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: نصائح للمشارط. طرف المشرط الجديد (أعلى) مقارنة بالمشرط المستخدم لقطع الجمجمة بطرف حاد (أسفل). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: التحقق من صحة نافذة الجمجمة الجديدة وطريقة التعبير عن fibroin-AAV. (أ) ملف شدة التألق لحبيبات الفلورسنت 0.1 ميكرومتر في أجار. يعرض الصف العلوي بيانات من حالة تم فيها وضع غطاء زجاجي فقط فوق حبات الفلورسنت الممزوجة بالآجار ، ويعرض الصف السفلي بيانات من حالة تم فيها وضع غلاف وسيليكون شفاف وغطاء زجاجي. تظهر الآثار الرمادية ملاءمة Gaussian لملف تعريف شدة التألق لكل حبة ، وتظهر الآثار الحمراء متوسط قيمها (n = 7). (ب) ملخص البيانات الواردة في الفقرة (أ). يظهر كل رسم بياني العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لدالة انتشار النقطة على محور XYZ. يظهر الرسم الرمادي بيانات كل حبة ، ويظهر اللون الأحمر متوسط الخطأ والقياسي. (ج) من 2000 إطار (تسجيل 60 ثانية) لبيانات التصوير في الجسم الحي ، تم اختيار جسيم فلوري صغير وفحص مقدار تحرك الصورة خلال 60 ثانية. تمثل صورة الفلورسنت في المركز متوسط 2000 إطار. تم عرض الصور من خلال حساب المتوسط في اتجاهات المحور X و Y. توضح الرسوم البيانية توزيع النقطه الوسطى في كل إطار. كانت الانحرافات المعيارية للسنترويد X: 0.36 و Y: 0.315 ميكرومتر. (د) مثال على تعبير GECI بطريقة fibroin-AAV. إلى اليسار: طبقت شريحة من القشرة الدماغية طريقة التعبير عن fibroin-AAV. يشير اللونان الأحمر والأزرق إلى مضان من XCaMP-R و DAPI ، على التوالي ؛ تم التعبير عن XCaMP-R ليس فقط في خلايا الطبقة 2/3 ولكن أيضا في خلايا الطبقة 5. الوسط واليمين. مناظر مكبرة للطبقات 2/3 و 5 في الشكل الأيسر (المربعات السماوية) ، على التوالي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: (أ) كفاءة التعبير عن الغلاف باستخدام طريقة فيلم fibroin-AAV و (B) تقييم وظيفة انتشار النقطة أثناء التصوير ثنائي الفوتون. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة غير مكلفة لإنشاء نافذة جمجمة كبيرة باستخدام غلاف بلاستيكي PVDC وسيليكون شفاف وغطاء زجاجي. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا أنه يمكن إجراء تصوير الكالسيوم واسع المجال على مساحة واسعة من القشرة الدماغية. يمكن إجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون من عدة مناطق قشرية مختلفة في نفس الفأر الذي خضع لتصوير واسع المجال. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن فيلم fibroin-AAV على الغلاف البلاستيكي المستخدم للنافذة يمكن أن يعبر عن GECI على مساحة واسعة من القشرة.

خطوات حاسمة
من المهم تجنب العدوى وتلف الدماغ عند صنع نوافذ الجمجمة باستخدام غلاف بلاستيكي. في هذه الظروف ، لا يمكن ملاحظة النشاط العصبي والدبقي ، وتصوير المناطق العميقة أمر مستحيل. تؤدي إصابة الأوعية الدموية أيضا إلى النزيف ، مما يجعل التصوير مستحيلا بسبب الدم. لتجنب العدوى ، فإن جعل سطح الدماغ والالتفاف متصلا بإحكام قدر الإمكان أمر بالغ الأهمية عن طريق امتصاص ACSF. إدارة مانيتول مهمة لتجنب تلف الدماغ والأوعية الدموية عن طريق منع زيادة ضغط الدماغ أثناء الجراحة. هذا يحافظ على المسافة بين سطح الدماغ والأم الجافية ويمنع لمس الدماغ والأوعية الدموية أثناء إزالة الجمجمة والأم الجافية. مجهر ستيريو ذو تكبير عالي وملاقط ذات أطراف حادة فعالة أيضا لإجراء جراحة دقيقة.

في طريقة fibroin-AAV ، من الضروري استخدام شرانق دودة القز اللحمية ، وليس تجميد محلول الفبروين ، وتجفيف محلول fibroin-AAV بشكل كاف ، وتطبيق حجم كاف من المحلول (5 ميكرولتر لكل قطر 3 مم). عندما تم استخدام الشرانق القديمة ، كانت كفاءة التعبير أقل. وذلك لأن الفبروين من الشرانق القديمة قد يتم تغيير طبيعته بسهولة. عندما تم تجميد محلول الفبروين عند -80 درجة مئوية وإذابته في وقت الاستخدام ، كانت كفاءة التعبير ضعيفة. قد يكون هذا بسبب تمسخ البروتين بسبب التجميد والذوبان. نظرا لأنه يمكن استخدام محاليل الفبروين المخزنة عند 4 درجات مئوية بشكل فعال حتى الهلام ، فمن المستحسن أن يتم تبريد محاليل الفبروين وتنقيتها من الشرانق مرة أخرى بعد التبلور. يجب تجفيف محلول fibroin-AAV لمدة 3 ساعات على الأقل ، لأن التعبير ضعيف بعد أقل من 3 ساعات. أخيرا ، تعتمد منطقة التعبير على كمية محلول fibroin-AAV المستخدم. في المثال في الشكل 3M ، كانت الكمية صغيرة (5 ميكرولتر) ؛ وهكذا ، غطى فيلم fibroin-AAV النصف العلوي فقط من النافذة ، مما أدى إلى تعبير غير موحد فوق النافذة. إذا تم استخدام كمية كافية من fibroin-AAV ، فسيكون التعبير موحدا على النافذة بأكملها.

تعديلات على التقنية
تسمح تقنية نافذة الجمجمة الجديدة للمرء بفحص النشاط العياني للدوائر القشرية ونشاطها الأساسي على مستوى الخلية الواحدة في نفس الفأر. وبالتالي ، يمكن تطبيق الطريقة على مجموعة متنوعة من دراسات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لمراقبة النشاط القشري أثناء مهام صنع القرار ، والتعلم الحركي ، وفي نماذج الفئران لإصابات الدماغ والمرض. نعتقد أيضا أنه يمكن تطبيق الطريقة ليس فقط على القوارض ولكن أيضا على الرئيسيات غير البشرية.

توضح هذه الورقة أن نافذة الجمجمة الكبيرة فعالة لتصوير الفئران المعدلة وراثيا والفئران المحقونة ب AAV التي تعبر عن البروتينات الوظيفية. على وجه الخصوص ، تبين أن فيلم fibroin-AAV الموجود على الغلاف أسهل بكثير من طريقة حقن AAV التقليدية للتعبير عن GECIs عبر المنطقة الواسعة من القشرة. باستخدام مزيج من اثنين من AAVs ترميز GECIs بألوان مختلفة41 ، يمكن تصوير العلاقة بين نشاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد على مساحة واسعة من القشرة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق طريقة فيلم fibroin-AAV على أجهزة استشعار حيوية أخرى مشفرة وراثيا42،43،44،45،46،47.

نافذة الجمجمة الأكبر ، والتي يمكنها تصوير نصفي الكرة الأرضية ، ممكنة أيضا. تم مؤخرا تطوير مجاهر ثنائية الفوتون ذات مجال رؤية أوسع بكثير (~ 25 مم2)25،26،27،28،29. إن الجمع بين تقنية التصوير ثنائية الفوتون هذه والتصوير واسع المجال لفوتون واحد باستخدام نافذة الجمجمة الواسعة الموصوفة هنا سيسمح لنا بفحص العلاقة بين النشاط السكاني ونشاط الخلية الواحدة من مقاييس غير مسبوقة.

القيود
لا يسمح غلاف الطعام بمرور أي مواد. هذا يجعل من الصعب استخدام الطريقة للتجارب الدوائية. من الصعب أيضا إزالة الغلاف ، مما يجعل من المستحيل إدخال ماصة زجاجية أو قطب كهربائي. لذلك ، من الصعب تنفيذ التجارب جنبا إلى جنب مع طرق أخرى مثل تصوير الكالسيوم في وقت واحد والتسجيلات الكهربية ، والإدارة المحلية للأدوية باستخدام ماصة زجاجية. الحل المحتمل لهذه القيود هو استخدام الغلاف والنافذة الزجاجية مع فتحة. هذا يسمح بالوصول إلى الدماغ عبر ماصة زجاجية أو قطب تسجيل مع الحفاظ على نافذة الجمجمة معقمة لفترة طويلة48.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلية (أ) "فك التشفير الدبقي" (JP21H05621 إلى SM) ، JSPS KAKENHI (JP19K06883 إلى SM ، 15KK0340 إلى ES ، JP22H00432 ، JP22H05160 ، JP17H06312 إلى HB ، و JP17H06313 إلى KK) ، منحة في المعونة لرسم خرائط الدماغ بواسطة التقنيات العصبية المتكاملة لدراسات الأمراض (الدماغ / العقول) (JP19dm0207079h0002 إلى SM ، JP19dm0207079 إلى HB ، و JP19dm0207080 إلى KK) ، مؤسسة ناريشيج لأبحاث علم الأعصاب (إلى SM) ، منحة للباحثين الشباب من محافظة ياماناشي (إلى SM) ، ومؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى SM) وبدعم جزئي من منحة أبحاث الدماغ الحدودية من جامعة ياماناشي.

نشكر N. Yaguchi و K. Okazaki على رعاية الحيوانات والمساعدة الفنية وأعضاء مختبر Kitamura على المناقشات المفيدة.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4٪ محلول عازلة للفوسفات بارافورمالديهايدNACALAI TESQUE ، كيوتو ، اليابانTritonXكفاءة التعبير عن الغلاف باستخدام طريقة فيلم fibroin-AAV
دورق
برنامج الاستحواذرؤيةالدماغ BV_Anaلتصوير الكالسيوم واسع المجال لبرنامج الاستحواذ GCaMP6f
Hamamatsu الضوئياتبرنامج تسجيل عالي السرعةHSRلتصوير الكالسيوم واسع المجال لبرنامج اكتساب XCaMP-R
مسح Vibrio TechnologiesImageلتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون
ACSF (السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي)150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد الهيدروجين ، 10 ملي هيبيس ، 2 ملي كالوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي> ، 1 ملي مولار MgCl 2< / sub> ، الرقم الهيدروجيني = 7.4 بإبرة
شفط 1M NaOH ACSFالفيروسات المرتبطة بالغدةVectorBuilderمخصصة AAV-DJ / 8-Syn1-XCaMP-R
للاستخدام البيولوجيالتخدير Daiichi SankyoAron Alpha-A
التخديرShinano seisakushoSN-487
التخديرKyoritsu Seiyaku CorporationPentobarbitalكفاءة التعبير عن الغلاف باستخدام طريقة فيلم fibroin-AAV
المساعدة شريط الأذنNarishigeEB-5N
CCD كاميرارؤية الدماغMiCAM02-HRلتصوير الكالسيوم واسع المجال ل GCaMP6f
شفاف من الفينيل بولي سيلوكسانGCExaclear
CMOS كاميراHamamatsu الضوئياتORCA-sparkلتصوير الكالسيوم واسع المجال لزجاج
غطاء مسحة
القطن XCaMP-Rماتسونامي18 × 18 رقم 1الحجم: 18 × 18 مم ، السماكة: 0.13-0.17 مم ، زجاج البورسليكات
DAPIThermo FisherD1306كفاءة التعبير عن الغلاف باستخدام طريقة فيلم fibroin-AAV
كاسيت غسيل الكلى3.5K MWCO ، Slide-A-LyzerThermoFisher
أسمنت راتنج لاصقللأسنان SUN MEDICALSuper-Bond
Dental DrillNakanishiVOLVERE Vmax
مقياس رقميDretecKS-243
مرشحاترؤيةEM: BP466 / 40-25 ، DM: DM506 ، EX: BP520 / 36-50
مرشحاتأوليمبوسU-MRFPHQ ، EM: BP535-555HQ ، DM: DM565HQ ، على سبيل المثال: BA570-625HQ
مجهر مضانKeyenceBZ-X810كفاءة التعبير عن الغلاف بطريقة فيلم fibroin-AAV
حبات الفلورسنتالفلورسبرايت YG كربوكسيل المجهرية0.1 & متقييم وظيفة انتشار النقطة تحت النوافذ التقليدية والجديدة في التصوير ثنائي الفوتون
ملقطFSTرقم 11252-20رقيقة الرأس ، لإزالة الأم الجافية
ملقطKFIK-7 ، رقم J 18-8للاستخدام العام
الجيلاتين للإرقاءجونسون & جونسونإسبونجستان
جنتاميسين كبريتاتإيواكي سياكو
ماصة زجاجية
ريكيت اليابانجهاز
حج القحف المصنوعخصيصا لتصوير الصبغة الحساس للجهد القشري في الفئران. سوزوكي ، ت. ، وموراياما ، م. البروتوكول الحيوي 2016 6: e1722.
لوحة الرأسالألومنيوم أو الراتنج المصنوع حسب الطلب ، الحجم: 40 × 25 مم ، السماكة: 1.5 مم أو 2 مم ، ثقب في المنتصف: 15 × 10 مم (head_plate_06 v3.f3d)
LA-HDF108AA
مصدر الضوءرؤية الدماغLEX2-LZ4-Bلتصوير الكالسيوم واسع المجال لمصدر الضوء GCaMP6f
أوليمبوسU-HGLGPSلتصوير الكالسيوم واسع المجال لمحلول المانيتول XCaMP-R
(15٪ مع محلول ملحي)Sigma-Aldrich (Merck)M4125
Micro CuretteFSTرقم 10080-05
المجهررؤيةلتصوير الكالسيوم واسع المجال لمجهر GCaMP6f
OlympusMVX10لتصوير الكالسيوم واسع المجال لمجهر XCaMP-R
أدوات SutterMOMلتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون
آلة تقطيعدقيق Dosaka EMDTK-1000Nكفاءة التعبير عن الغلاف بطريقة فيلم fibroin-AAV
طرف الخلطGC
إبرة (30 جم)
بولي إيثيلين SPOIDSAS ONE1-4656-01
فيلم كلوريد البولي فينيلدين (PVDC)Asahi KaseiAsahi Wrap (أو Saran Wrap)
MundipharmaIsodine
Python libraliesحزمة NumPyللحوسبة العلمية ، https://numpy.org/doc/stable/index.html#
Matplotlibللتصورات ، https://matplotlib.org/stable/index.html #
أداة تحليل البيانات ومعالجتها ، https://pandas.pydata.org
ماكينة حلاقة ScalpelKaiرقم 11
لموزعات
GC
شرنقة دودة القزSatoyama Craft Newshttps://sato-yama.jp/
المجهر المجسمLEICAMZ6عدسة موضوعية: 0.63x ، العدسة: 25x
الفاعل بالسطحNACALAI TESQUETritonXكفاءة التعبير عن الغلاف بطريقة فيلم fibroin-AAV
مقص جراحيFSTرقم 91460-11
حقنة للمانيتول حقنTerumo1mL
مخدر عبر الجلدAstraZenecaLidocaine
الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة في تصوير الكالسيوم للخلاياالنجمية تم الحصول على الفئران بالطريقة التالية.
AldH1l1-CreERT2 الفئران: B6N. FVB-Tg (Aldh1l1-cre / ERT2) 1Khakh / J (مختبر جاكسون ، سلالة #: 031008)
تعبير Cre المحفز للتاموكسيفين الموجه بمستويات عالية إلى الغالبية العظمى من الخلايا النجمية
Flx-Lck-GCaMP6f الفئران: C57BL / 6N-GT (ROSA) 26SOR [tm1 (CAG-GCaMP6f) Khak] / J (مختبر جاكسون ، سلالة #: 029626)
تعبير معتمد على Cre لغشاء البلازما GCaMP6f.
الفأر المولود من التهجين ، عولجت هذه الفئران بتاموكسيفين (20 مجم / مل) لمدة 5 أيام ( 0.05 مل / 10 جم وزن الجسم، IP) للتعبير عن GCaMP6f.
ليزر فائق السرعة قابل للضبطSpectra-PhysicsInSight X3لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون
فيلم مقاوم للماءNichibanBFR5
الفئران من النوع البرياليابان SLCC57BL / 6Jذكر وأنثى ، >4 أسابيع
50 مل مواد لاصقة آلة آلة الدماغ مزيل شعر مخصص تثبيت رأس Veet وسادة تسخين برنامج معالجة الصور (لتحليل بيانات تصوير الكالسيوم)ImageJ https://imagej.net Isoflurane Pfizer مصدر الضوء Hayashi-repic الدماغ Povidone-iodine مكتبة السيليكون للحيوانات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wide-field calcium imaging of cortex-wide activity in awake, head-fixed mice. STAR Protocols. 2 (4), 100973(2021).">Ren, C., Komiyama, T. Wide-field calcium imaging of cortex-wide activity in awake, head-fixed mice. STAR Protocols. 2 (4), 100973(2021).
  2. Chronic, cortex-wide imaging of specific cell populations during behavior. Nature Protocols. 16 (7), 3241-3263 (2021).">Couto, J., et al. Chronic, cortex-wide imaging of specific cell populations during behavior. Nature Protocols. 16 (7), 3241-3263 (2021).
  3. Cortical Observation by Synchronous Multifocal Optical Sampling Reveals Widespread Population Encoding of Actions. Neuron. 107 (2), 351-367 (2020).">Kauvar, I. V., et al. Cortical Observation by Synchronous Multifocal Optical Sampling Reveals Widespread Population Encoding of Actions. Neuron. 107 (2), 351-367 (2020).
  4. Locomotion-dependent remapping of distributed cortical networks. Nature Neuroscience. 22 (5), 778-786 (2019).">Clancy, K. B., Orsolic, I., Mrsic-Flogel, T. D. Locomotion-dependent remapping of distributed cortical networks. Nature Neuroscience. 22 (5), 778-786 (2019).
  5. Low-dimensional spatiotemporal dynamics underlie cortex-wide neural activity. Current Biology. 30 (14), 2665-2680 (2020).">MacDowell, C. J., Buschman, T. J. Low-dimensional spatiotemporal dynamics underlie cortex-wide neural activity. Current Biology. 30 (14), 2665-2680 (2020).
  6. Transformation of cortex-wide emergent properties during motor learning. Neuron. 94 (4), 880-890 (2017).">Makino, H., et al. Transformation of cortex-wide emergent properties during motor learning. Neuron. 94 (4), 880-890 (2017).
  7. Automated task training and longitudinal monitoring of mouse mesoscale cortical circuits using home cages. eLife. 9, 559654(2020).">Murphy, T. H., et al. Automated task training and longitudinal monitoring of mouse mesoscale cortical circuits using home cages. eLife. 9, 559654(2020).
  8. Miniaturized head-mounted microscope for whole-cortex mesoscale imaging in freely behaving mice. Nature Methods. 18 (4), 417-425 (2021).">Rynes, M. L., et al. Miniaturized head-mounted microscope for whole-cortex mesoscale imaging in freely behaving mice. Nature Methods. 18 (4), 417-425 (2021).
  9. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).">Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  10. Characterizing cortex-wide dynamics with wide-field calcium imaging. The Journal of Neuroscience. 41 (19), 4160-4168 (2021).">Ren, C., Komiyama, T. Characterizing cortex-wide dynamics with wide-field calcium imaging. The Journal of Neuroscience. 41 (19), 4160-4168 (2021).
  11. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. eLife. 9, 53639(2020).">Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. eLife. 9, 53639(2020).
  12. Comparison between transgenic and AAV-PHP.eB-mediated expression of GCaMP6s using in vivo wide-field functional imaging of brain activity. Neurophotonics. 6 (2), 025014(2019).">Michelson, N. J., Vanni, M. P., Murphy, T. H. Comparison between transgenic and AAV-PHP.eB-mediated expression of GCaMP6s using in vivo wide-field functional imaging of brain activity. Neurophotonics. 6 (2), 025014(2019).
  13. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).">Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).
  14. Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution. Nature Photonics. 13 (11), 809-816 (2019).">Fan, J. T., et al. Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution. Nature Photonics. 13 (11), 809-816 (2019).
  15. Dendritic integration: 60 years of progress. Nature Neuroscience. 18 (12), 1713-1721 (2015).">Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nature Neuroscience. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  16. Dendritic function in vivo. Trends in Neurosciences. 38 (1), 45-54 (2015).">Grienberger, C., Chen, X., Konnerth, A. Dendritic function in vivo. Trends in Neurosciences. 38 (1), 45-54 (2015).
  17. Locally synchronized synaptic inputs. Science. 335 (6066), 353-356 (2012).">Takahashi, N., et al. Locally synchronized synaptic inputs. Science. 335 (6066), 353-356 (2012).
  18. Dendritic calcium signaling triggered by spontaneous and sensory-evoked climbing fiber input to cerebellar Purkinje cells in vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (30), 10847-10858 (2011).">Kitamura, K., Hausser, M. Dendritic calcium signaling triggered by spontaneous and sensory-evoked climbing fiber input to cerebellar Purkinje cells in vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (30), 10847-10858 (2011).
  19. A top-down cortical circuit for accurate sensory perception. Neuron. 86 (5), 1304-1316 (2015).">Manita, S., et al. A top-down cortical circuit for accurate sensory perception. Neuron. 86 (5), 1304-1316 (2015).
  20. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).">Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  21. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).">Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  22. Probing the complexities of astrocyte calcium signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).">Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the complexities of astrocyte calcium signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  23. Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11377-11382 (2015).">Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11377-11382 (2015).
  24. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839(2017).">Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839(2017).
  25. cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nature Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).">Demas, J., et al. cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nature Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).
  26. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).">Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  27. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. eLife. 5, 14472(2016).">Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. eLife. 5, 14472(2016).
  28. Wide field-of-view, multi-region, two-photon imaging of neuronal activity in the mammalian brain. Nature Biotechnology. 34 (8), 857-862 (2016).">Stirman, J. N., Smith, I. T., Kudenov, M. W., Smith, S. L. Wide field-of-view, multi-region, two-photon imaging of neuronal activity in the mammalian brain. Nature Biotechnology. 34 (8), 857-862 (2016).
  29. Diesel2p mesoscope with dual independent scan engines for flexible capture of dynamics in distributed neural circuitry. Nature Communications. 12 (1), 6639(2021).">Yu, C. H., Stirman, J. N., Yu, Y., Hira, R., Smith, S. L. Diesel2p mesoscope with dual independent scan engines for flexible capture of dynamics in distributed neural circuitry. Nature Communications. 12 (1), 6639(2021).
  30. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nature Methods. 17 (1), 107-113 (2020).">Barson, D., et al. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nature Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
  31. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 2852-2866 (2016).">Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 2852-2866 (2016).
  32. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Reports. 17 (12), 3385-3394 (2016).">Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Reports. 17 (12), 3385-3394 (2016).
  33. Cortex-wide neural interfacing via transparent polymer skulls. Nature Communications. 10 (1), 1500(2019).">Ghanbari, L., et al. Cortex-wide neural interfacing via transparent polymer skulls. Nature Communications. 10 (1), 1500(2019).
  34. Protocol for constructing an extensive cranial window utilizing a PEO-CYTOP nanosheet for in vivo wide-field imaging of the mouse brain. STAR Protocols. 2 (2), 100542(2021).">Takahashi, T., Zhang, H., Otomo, K., Okamura, Y., Nemoto, T. Protocol for constructing an extensive cranial window utilizing a PEO-CYTOP nanosheet for in vivo wide-field imaging of the mouse brain. STAR Protocols. 2 (2), 100542(2021).
  35. Craniotomy for cortical voltage-sensitive dye imaging in mice. Bio-Protocol. 6 (3), 1722(2016).">Suzuki, T., Murayama, M. Craniotomy for cortical voltage-sensitive dye imaging in mice. Bio-Protocol. 6 (3), 1722(2016).
  36. Silk fibroin films facilitate single-step targeted expression of optogenetic proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).">Jackman, S. L., et al. Silk fibroin films facilitate single-step targeted expression of optogenetic proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
  37. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).">Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
  38. In vivo two-photon imaging of sensory-evoked dendritic calcium signals in cortical neurons. Nature Protocols. 6 (1), 28-35 (2011).">Jia, H., Rochefort, N. L., Chen, X., Konnerth, A. In vivo two-photon imaging of sensory-evoked dendritic calcium signals in cortical neurons. Nature Protocols. 6 (1), 28-35 (2011).
  39. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , 061507(2017).">Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , 061507(2017).
  40. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).">Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  41. Rational engineering of XCaMPs, a multicolor GECI suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics. Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).">Inoue, M., et al. Rational engineering of XCaMPs, a multicolor GECI suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics. Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).
  42. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).">Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
  43. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).">Sun, F., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  44. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).">Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  45. A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).">Feng, J., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
  46. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).">Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
  47. Imaging neurotransmitter and neuromodulator dynamics in vivo with genetically encoded indicators. Neuron. 108 (1), 17-32 (2020).">Sabatini, B. L., Tian, L. Imaging neurotransmitter and neuromodulator dynamics in vivo with genetically encoded indicators. Neuron. 108 (1), 17-32 (2020).
  48. Chronic cranial window with access port for repeated cellular manipulations, drug application, and electrophysiology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 379(2014).">Roome, C. J., Kuhn, B. Chronic cranial window with access port for repeated cellular manipulations, drug application, and electrophysiology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 379(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Wide Field Calcium ImagingTwo Photon ImagingLarge Cranial WindowMouse NeocortexGenetically Encoded Calcium IndicatorAstrocyte ImagingCortical ActivityAAV ExpressionSilicone ElastomerCover Glass

Related Articles