Summary
Este método quantifica a abundância microbiana usando um formato de placa de 96 poços para unidades formadoras de colônias de placas (UFCs) e é aplicado ao microbioma Drosophila em amostras inteiras de homogeneização de moscas. As CFUs são contadas com um software automatizado de análise de imagens fornecido aqui.
Abstract
Os intestinos dos animais são colonizados por micróbios comensais, que afetam o desenvolvimento, a saúde e o comportamento do hospedeiro. A quantificação precisa da colonização é essencial para estudar as complexas interações entre hospedeiro e micróbio, tanto para validar a composição microbiana quanto para estudar seus efeitos. Drosophila melanogaster, que tem uma baixa diversidade microbiana nativa e é econômica para trás com composição microbiana definida, emergiu como um organismo modelo para o estudo do microbioma intestinal. A análise do microbioma de um organismo individual requer a identificação de quais espécies microbianas estão presentes e a quantificação de sua abundância absoluta. Este artigo apresenta um método para a análise de um grande número de microbiomas individuais de moscas. As moscas são preparadas em placas de 96 poços, permitindo o manuseio de um grande número de amostras de uma só vez. A abundância microbiana é quantificada pelo revestimento de até 96 homogeneizados de moscas inteiras em uma única placa de ágar em uma matriz de pontos e, em seguida, contando as unidades formadoras de colônias (UFCs) que crescem em cada ponto. Este sistema de chapeamento é emparelhado com uma plataforma automatizada de quantificação de UFC, que incorpora fotografia das placas, diferenciação de colônias fluorescentes e contagem automatizada das colônias usando um plugin ImageJ. As vantagens são que (i) este método é sensível o suficiente para detectar diferenças entre os tratamentos, (ii) o método de chapeamento pontual é tão preciso quanto os métodos tradicionais de chapeamento e (iii) o processo de contagem automatizado é preciso e mais rápido do que a contagem manual. O fluxo de trabalho apresentado aqui permite a quantificação de CFUs de alto rendimento em um grande número de replicações e pode ser aplicado a outros sistemas de estudo de microbiologia, incluindo modelos in vitro e outros modelos de pequenos animais.
Introduction
A relação entre a microbiota intestinal e seu hospedeiro animal está cada vez mais na vanguarda dos estudos biológicos1, que mostram que a composição da cepa do microbioma é importante para a fisiologia do hospedeiro 2,3,4. O ritmo de descoberta tem sido limitado por fatores de confusão, como alta variação natural interindividual e alta diversidade de bactérias colonizadoras 5,6,7. A mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster, emergiu como um modelo promissor devido ao seu microbioma naturalmente de baixa diversidade, facilidade de manuseio e genética robusta do hospedeiro 8,9,10,11. As moscas podem ser livres de germes e reassociadas a uma microbiota definida12, e tem sido demonstrado que a flora influencia características fisiológicas da mosca13,14. A flora inata consiste em um conjunto limitado de bactérias que são todas cultiváveis, e parentes próximos delas também são endógenos ao intestino dos mamíferos, incluindo lactobacilos, proteobactérias e enterococos15.
Estudar a influência do microbioma nas características do hospedeiro requer a quantificação do microbioma em termos de quais espécies estão presentes e suas abundâncias absolutas16. As formas predominantes de análise do microbioma da mosca são as contagens de unidade formadora de colônias (UFC)17, o sequenciamento do amplificador do gene rRNA 16S9 e a qPCR do gene 16S rRNA18. As contagens de UFC podem ser obtidas sem reagentes caros, e confirmam a viabilidade das células bacterianas19. As técnicas 16S, incluindo a qPCR, têm vantagens na medida em que as identidades taxonômicas dos micróbios podem ser determinadas sem levar em conta suas necessidades de crescimento ou morfologias das colônias20.
No caso em que os experimentos usam moscas com um microbioma definido de bactérias conhecidas (moscas gnotobióticas), as contagens de UFC têm vantagens particulares sobre o sequenciamento21. O sequenciamento é caro, exigindo extração de DNA, preparação de biblioteca baseada em PCR e sequenciamento de alto rendimento para obter abundâncias relativas22. Devido ao alto custo, os métodos de sequenciamento de alto rendimento normalmente precisam ser executados em massa para reduzir o preço por amostra23. Outros métodos, como qPCR, são necessários para obter abundâncias absolutas16. Em contraste, as contagens de UFC são rápidas e baratas e fornecem o número absoluto de células viáveis. Drosophila8 e outros pequenos modelos de microbioma24, incluindo o verme, Caenorhabditis elegans 25,26, e o peixe-zebra larval, Danio rerio, cultivado gnotobioticamente27, têm uma gama limitada de bactérias, que têm características de crescimento conhecidas 28. Nesses casos, particularmente com animais gnotobióticos, a contagem de UFC pode diferenciar todas as espécies de bactérias dentro das comunidades intestinais multiespécies21,27,29. Métodos de contagem de UFC de maior rendimento melhorariam ainda mais a relação custo-benefício e a velocidade de medir a composição do microbioma e poderiam ser aplicados a muitos outros experimentos de microbiologia.
A contagem de UFCs por revestimento por diluição em série de uma suspensão bacteriana em meios de crescimento à base de ágar é um método padrão em todo o campo da microbiologia. As colônias que crescem nas placas são então contadas manualmente. As diluições permitem que o pesquisador selecione uma densidade de colônias que seja contável (por exemplo, ~ 100 UFCs por placa), o que significa que as colônias não estão crescendo umas nas outras e podem ser contadas em um período razoável de tempo. A maioria dos microbiologistas usa essencialmente o mesmo método de contagem de UFC desenvolvido há 140 anos no laboratório de Robert Koch e, para muitas aplicações, esse método ainda é adequado. No entanto, surge um problema quando se procura quantificar um grande número de amostras. Uma única amostra pode exigir o chapeamento de 1 a 10 diluições seriais da amostra para obter UFCs contáveis, de modo que experimentos envolvendo mais de algumas dúzias de amostras se tornam desgastantes. Vários métodos foram desenvolvidos para aumentar a eficiência da enumeração de UFC. O revestimento espiral automatizado elimina a necessidade de diluições em série30, tornando necessária apenas uma placa para a contagem de UFC, mas aumentando o tempo para chapear a amostra. A mancha de diluição em série de placa única (SP-SDS) permite estimativas de UFC a partir de menos placas por amostra31. Esses métodos são uma melhoria em relação ao método tradicional de espalhamento, mas ainda exigem manuseio e revestimento de amostras bacterianas isoladamente e, portanto, não são ideais para alto rendimento. O manuseio de amostras em placas de 96 poços e o revestimento pontual dessas 96 amostras em placas de ágar retangulares melhoram muito o rendimento das amostras19.
Os microbiomas são tipicamente compostos de múltiplas cepas e espécies. Embora as espécies possam muitas vezes ser distinguidas pela morfologia da colônia ou meios de crescimento, a fluorescência pode ser empregada para distinguir ainda mais diferentes tipos de bactérias e suas características de crescimento32. Por exemplo, diferentes genótipos da mesma espécie podem ser marcados com diferentes proteínas fluorescentes codificadas geneticamente. Métodos de imagem de placas que incorporam fluorescência permitem que os pesquisadores aproveitem essas técnicas genéticas em ensaios baseados em UFC32. A incorporação de fluorescência em métodos de contagem de CFU de alto rendimento aumentaria ainda mais sua utilidade.
Contar CFUs manualmente torna-se complicado quando há um grande número de amostras. A contagem automatizada de UFCs pode ser realizada fotografando a placa e processando a imagem usando um software especializado33. Sieuwerts et al. combinaram a eficiência aprimorada de chapeamento de pontos com a contagem automatizada de colônias usando fotografia digital convencional e o software ImageJ19.
Um método de alto rendimento para rastrear os fenótipos de associações específicas de micróbios e hospedeiros ajudaria a estudar a montagem da comunidade do microbioma e o impacto na saúde e aptidão do hospedeiro. Para estudos do microbioma Drosophila, uma plataforma de microbiologia de alto rendimento incorporaria o manuseio de amostras de moscas no formato de placa de 96 poços, lise de mosca sem lise bacteriana, a eficiência do spot-plating, a capacidade de usar fluorescência e distinguir múltiplos fluoróforos, um ambiente de luz controlada para imagens reprodutíveis de placas de UFC e um software confiável de contagem automatizada de colônias. Este artigo descreve um método otimizado para o ensaio de UFCs em moscas gnotobióticas, que é simples, rápido e automatizado. Este protocolo descreve um novo fluxo de trabalho que combina o melhor dos métodos publicados anteriormente e otimizado para explorar o microbioma intestinal em Drosophila.
Protocol
1. Colonização de moscas
NOTA: Este método é adequado para análise quantitativa de moscas com um microbioma intestinal cultivável por plaqueamento de crescimento de UFCs. Um protocolo detalhado para a criação de moscas gnotobióticas foi publicado anteriormente12.
- Estabelecer colonização estável por uma espécie bacteriana comensal.
- Preparar uma cultura bacteriana fresca, pellet por centrifugação a 400 x g durante 3 min à temperatura ambiente, e ressuspender o pellet celular em PBS para um OD600 de 1,0. Para este protocolo, Lactiplantibacillus plantarum (anteriormente conhecido como Lactobacillus plantarum) foi cultivado durante a noite para um OD600 de 2,0.
- Pipetar 100 μL para o alimento num frasco para injetáveis de mosca (ver Tabela de Materiais). Espalhe uniformemente e deixe o líquido absorver por 15-30 min.
- Transfira 20 moscas livres de germes para este frasco para injetáveis utilizando a técnica padrão de viragem de frasco para frasco para injetáveis34. Cada mosca comerá uma quantidade aproximadamente igual da dose bacteriana35. Alternativamente, ovos livres de germes podem ser adicionados.
- Transfira as moscas para alimentos frescos estéreis diariamente por 3 dias. Faça tudo isso em um armário de biossegurança e use a técnica estéril (Figura 1A-1).
- Antes de medir a carga de UFC, transfira as moscas para um frasco contendo água de ágar estéril por 4 h para limpar as bactérias transitórias do intestino. Os frascos de água de ágar fornecem uma fonte de umidade para a mosca, mas nenhuma nutrição para a mosca ou bactérias na superfície. Eles são preparados nos mesmos frascos de moscas estéreis que com alimentos padrão, mas contêm apenas água deionizada e ágar a 1,5%.
2. Homogeneização de moscas individualmente em uma placa de PCR de 96 poços
- Prepare as placas de batedor de contas com antecedência.
- Despeje contas de vidro de 0,5 μm (consulte Tabela de materiais) na bandeja de medição de contas (impressa em 3D com a ajuda do Arquivo de Codificação Suplementar 1 S1-bead-measurer.stl). Espalhe as contas na bandeja para que todos os poços estejam cheios e nivelados e, em seguida, escove o excesso de contas em um tubo cônico para recuperá-las.
- Coloque uma placa de PCR semi-rodapé (consulte Tabela de Materiais) de cabeça para baixo na bandeja de medição e alinhe-a com os poços, encaixando-a no recuo na bandeja de medição. Em seguida, vire-o rapidamente para transferir as contas.
- Remova o excesso de contas da superfície da placa de PCR e cubra-a com papel alumínio. Inspecione a placa de PCR para garantir que todos os poços contenham contas. Use uma colher de pesagem, se necessário, para adicionar contas a um único poço. Se a eletricidade estática estiver fazendo com que as contas grudem nas superfícies da placa, limpe ou pulverize a parte de trás da bandeja de medição e da placa de PCR com etanol a 70%.
- Cubra com papel alumínio. Muitas placas podem ser preparadas dessa maneira e, em seguida, autoclavadas e armazenadas para uso posterior. Quando estiver pronto para uso, adicione 100 μL de PBS a cada poço usando o pipetador de 96 canais (consulte Tabela de materiais).
- Esterilizar superficialmente as moscas colonizadas por micróbios (ver passo 1) com etanol a 70% antes da homogeneização.
- Anestesiar as moscas com 100% de CO2 por 5 s. Transfira moscas anestesiadas do frasco para injetáveis para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando um pequeno funil (Figura 1A-2). Neste estudo, 25 moscas foram tipicamente adicionadas por tubo.
- Imediatamente pulverize ~ 1 mL de etanol a 70% no tubo, feche o tubo e misture por inversão por 10 s. Em seguida, aspirar o etanol com uma pipeta P1000, tomando cuidado para não aspirar moscas. Repetir novamente com etanol e, em seguida, duas vezes com PBS estéril (Figura 1A-3).
- Após a lavagem final do PBS, feche o tubo e, com o lado da tampa para baixo, bata com força algumas vezes no banco para que as moscas entrem na tampa.
- Abra o tubo e dispense moscas nos poços usando pinça (Figura 1A-4). Coloque uma mosca em cada poço (Figura 1A-5). Mantenha a placa no gelo durante o carregamento para manter as moscas anestesiadas.
- Sele a placa usando a folha de vedação térmica de ligação térmica (consulte Tabela de materiais).
- Primeiro, remova quaisquer contas perdidas que estejam perto dos poços, pois elas podem causar vazamento na vedação da folha. Certifique-se de que o lado opaco da folha esteja orientado para baixo na placa e o lado brilhante para cima em direção ao selador térmico. Pressione a seladora térmica (consulte Tabela de materiais) firmemente para baixo por 5 s (Figura 1A-6). Polir com o aplicador manual (ver Tabela de Materiais) para fixar a folha.
NOTA: A má vedação é uma causa de perda de amostra.
- Primeiro, remova quaisquer contas perdidas que estejam perto dos poços, pois elas podem causar vazamento na vedação da folha. Certifique-se de que o lado opaco da folha esteja orientado para baixo na placa e o lado brilhante para cima em direção ao selador térmico. Pressione a seladora térmica (consulte Tabela de materiais) firmemente para baixo por 5 s (Figura 1A-6). Polir com o aplicador manual (ver Tabela de Materiais) para fixar a folha.
- Prenda a placa no agitador de placas. Homogeneizar por 5 min (Figura 1A-7). Gire a placa do talão por 30 s em um mini-girador de placa (consulte Tabela de Materiais) a 350 x g para remover o líquido da folha de vedação.
- Remova a folha enquanto segura a placa para não espirrar gotículas de homogeneizado de mosca para fora dos poços.
3. Diluição em série do homogeneizado da mosca e mancha nas placas CFU
- Coloque quatro placas retangulares de crescimento de ágar MRS (consulte Tabela de Materiais) no armário de biossegurança e remova suas tampas. Neste protocolo, o ágar MRS foi utilizado para o crescimento de L. plantarum. Deixe estas placas secar por pelo menos 10 min (20 min se forem recém-derramadas ou frias do armazenamento).
NOTA: Se as placas estiverem molhadas, as gotículas da placa de 96 poços correrão juntas e arruinarão as contagens. - Prepare três placas de diluição adicionando 100 μL de PBS a cada poço de uma placa estéril de 96 poços usando um pipettor de 96 canais. Carregue um rack de pontas P20 no pipetador de 96 canais.
- Efectuar uma diluição a 1:10 aspirando 11,1 μL de homogeneizado da placa de amostra preparada no ponto 2 (figura 1A-8). Certifique-se de desenhar do meio dos poços em vez do fundo dos poços, porque a mosca homogeneizada e as contas de vidro entopirão as pipetas. As contas afundam e as partículas da mosca flutuam, deixando a camada intermediária mais clara.
- Dispensar os 11,1 μL na primeira placa de diluição, que já contém 100 μL de PBS estéril por alvéolo. Mantenha a placa de diluição no agitador de placas por 10 s a 600 rpm. Misture novamente pipetando para cima e para baixo por cinco ciclos. Transferir 11,1 μL da primeira placa de diluição para a segunda placa de diluição e repetir as etapas de mistura para as duas placas de diluição seguintes.
- Efectuar a chapeamento em série de diluição, conforme descrito a seguir.
- Recupere as placas de crescimento do gabinete de biossegurança.
- Começando com a placa mais diluída, coloque 2 μL de cada poço nas placas de ágar usando o pipetador de 96 poços (Figura 1A-9).
- Abaixe a cabeça do pipetador lentamente sobre a placa, tomando cuidado para não esfaquear o ágar. Examine a placa cuidadosamente e certifique-se de que todas as manchas foram dispensadas; caso contrário, adicionar manualmente 2 μL à posição adequada. Verifique se as manchas líquidas mergulham rapidamente no ágar e não correm juntas.
- Se as manchas correrem juntas, seque um novo conjunto de placas de ágar fresco por um período mais longo e refaça a mancha. Se houver vários tipos de placas (por exemplo, meios diferentes ou com antibióticos), localize-os também. Dispensar qualquer solução restante de volta para a placa de diluição e proceder à concentração imediatamente mais elevada.
NOTA: Ao detectar diluições, misture a diluição seguinte cinco vezes para garantir que o conteúdo das pontas da pipeta está limpo da diluição anterior. As placas de diluição podem ser armazenadas >8 h a 4 °C sem afetar a contagem de colônias35.
- Repetir o processo de chapeamento descrito na etapa 3.5 para as restantes placas de diluição, progredindo da mais diluída para a mais concentrada até à placa com o homogeneizado original.
- Quando todo o líquido tiver sido absorvido pelo ágar, inverta as placas e coloque-as na incubadora (Figura 1A-10). Para Lactiplantibacillus e Acetobacter de Drosophila, a temperatura ideal é de 30 °C em meio MRS. Incubar até que as colônias tenham atingido o tamanho ideal: as colônias são grandes o suficiente para vê-las claramente, mas não tão grandes que se fundam ou interfiram no crescimento umas das outras (veja os resultados representativos para quantificação do tamanho ideal).
NOTA: As condições ideais de crescimento são dependentes da deformação e devem ser determinadas empiricamente. Para Lactiplantibacillus de Drosophila, o tempo ideal de incubação é de 26 h a 30 h em ágar MRS. Para Acetobacter de Drosophila, o tempo ideal de incubação é de 30 h a 48 h em MRS, dependendo da cepa. - Após a incubação, conservar as placas a 4 °C, se necessário, até estarem prontas para a contagem.
4. Quantificação das UFC
- Quantifique as UFCs fotografando as placas e, em seguida, contando as colônias usando software automatizado, conforme detalhado abaixo. Se as placas foram armazenadas a 4 °C, primeiro permita que elas atinjam a temperatura ambiente para que não haja condensação nas placas, o que produz brilho.
- Organize as placas em uma sequência lógica e mantenha-as nessa ordem durante a fotografia - isso facilita o nome dos arquivos. Oriente todas as placas de modo que A1 esteja no canto superior esquerdo para todas as placas. Recomenda-se rotular o canto A1 com um ID exclusivo para garantir que não haja confusão nas fotos. Empilhe cada série de diluição por ordem.
- Retire a tampa da placa e coloque a placa no palco com A1 orientado no canto correto. Os desenhos estão incluídos para a caixa de fotos da placa (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2), que é otimizada para fotografar essas placas da bandeja e inclui opções de iluminação e filtro para colônias fluorescentes de imagem.
- Imagine as placas. Use a câmera (consulte Tabela de materiais) com configurações manuais para obter um nível de exposição consistente entre as placas. Uma configuração de longa distância focal é recomendada para minimizar a distorção da perspectiva. Capture a foto usando um obturador remoto para minimizar o desfoque da trepidação da câmera.
- Transfira as imagens para um computador e renomeie-as, incluindo o nome do experimento, o tipo de mídia, o fator de diluição e quaisquer outros detalhes pertinentes. Alguns sistemas operacionais (consulte Tabela de materiais) têm um recurso útil de renomeação em lote no Finder clicando com o botão direito do mouse em uma seleção de arquivos.
5. Contagem automatizada de colônias usando o pacote Count-On-It (Arquivo Suplementar 3)
- Recorte as imagens usando o plug-in Croptacular fornecido (Arquivo de Codificação Suplementar 2) para o ImageJ. Este plugin ajuda a dividir a imagem em uma matriz ordenada de sub-regiões (por exemplo, 8 x 12 para uma placa de 96 poços). As sub-regiões serão contadas individualmente.
NOTA: Um plugin separado para contar placas circulares chamado Circus é descrito no Arquivo de Codificação Suplementar 3 Circus_.ijm.- Organize as imagens a serem processadas para quantificação em uma pasta. Escolha nomes de arquivos que distingam as placas, pois esses nomes de arquivos se tornam títulos de coluna para cada conjunto de contagens. Dentro desta pasta, faça subpastas chamadas "cropped" e "recibos".
- Inicie o Croptacular, e clique em OK para começar a cortar.
NOTA:As configurações padrão são exibidas e geralmente são suficientes. Dependendo da resolução da imagem, da iluminação, do tamanho do ponto, etc., pode ser útil ajustar os parâmetros de base. - Se a imagem já estiver reta, basta pressionar Espaço. Caso contrário, endireite a imagem desenhando uma linha ao longo de uma borda que deve se tornar horizontal. Redesenhe a linha quantas vezes forem necessárias se a imagem ainda não aparecer endireitada.
- Em seguida, desenhe uma caixa de limite da área para a qual a contagem deve ser feita. Ajuste o tamanho e a proporção até que todas as manchas estejam dentro de suas células. Arraste o cursor para fora da caixa de limite para atualizar a grade. Quando a grade estiver boa, pressione Espaço.
- Certifique-se de que a próxima imagem gire automaticamente para o mesmo ângulo que a primeira; o plugin assume que todas as fotos estão alinhadas da mesma forma. Se isso for preciso, pressione Espaço para continuar. Caso contrário, endireite a imagem como antes. A grade também lembra a mesma posição da imagem anterior; ajuste, se necessário, e pressione Espaço.
- Enumere as colônias nas placas usando o plug-in Count-On-It: Gridiron fornecido para ImageJ (Arquivo de Codificação Suplementar 4). Instruções detalhadas para instalar e usar o plugin estão incluídas no Arquivo Suplementar 3.
- Lançamento Count-On-It > Gridiron. Use as mesmas configurações de grade que com Croptacular. Os usuários podem agrupar em lote uma pasta inteira, analisar uma única imagem ou iniciar a partir da imagem atual.
- Defina o limite com base em um valor de intensidade de pixel superior e inferior. Torne o limiar o mais rigoroso possível enquanto ainda seleciona todas as colônias. Idealmente, haverá algum espaço entre as colônias selecionadas, mas o software é capaz de segmentar as bolhas até certo ponto. Clique em OK na caixa de diálogo "Ação necessária" quando o limite for satisfatório.
- Para inspecionar os resultados, amplie e observe mais de perto as contagens de colônias. Clicar em cancelar abortará o plugin. Clique em OK para continuar.
- Na primeira imagem, certifique-se de que a opção é dada para prosseguir ou retornar ao menu de configuração, por exemplo, para alterar o tamanho mínimo da colônia. Para prosseguir com o processo em lote, clique em OK. Em seguida, selecione uma pasta para manter a tabela de recibos e resultados. Use a pasta "recibos" ou crie uma nova pasta.
- Após a primeira imagem, as próximas imagens terão como padrão o mesmo limite das configurações anteriores. Clique em OK para usar essas configurações ou ajustar as configurações. Se as fotos forem consistentes e a configuração for precisa, clique em OK na caixa de diálogo "Ação necessária".
Observação : uma vez que todas as imagens no lote são concluídas, a tabela de resultados salva automaticamente na mesma pasta que os recibos. - Revise os recibos de contagem que são produzidos pelo software e corrija manualmente quaisquer erros de contagem. O plug-in ImageJ é estatisticamente preciso, mas ocorrem erros. Comprove os recibos para examinar valores atípicos e identificar erros de contagem. O software salva os dados da CFU como um arquivo de .csv na mesma pasta que os recibos.
- Analise os dados usando o software preferido pelo usuário.
Representative Results
Enumeração de UFCs em centenas de moscas individuais no formato de placa de 96 poços usando ensaio de colonização
Para entender a composição de muitos microbiomas individuais de moscas, as UFCs foram medidas usando o protocolo que as acompanha, que permitiu a identificação das espécies presentes, a porcentagem de moscas colonizadas e a abundância absoluta de bactérias em cada mosca. As razões para a grande variação observada de indivíduo para indivíduo na composição do microbioma são pouco compreendidas, e quantificar a distribuição estatística da colonização pode ajudar a estudar essa variação36,37. Para obter um número significativo de replicações biológicas, um pipeline de alto rendimento foi desenvolvido para a quantificação da abundância de micróbios em muitas moscas individuais usando contagens de UFC (Figura 1A).
A quantificação final das UFCs pode ser afetada pela forma como as moscas são manuseadas antes da análise, por exemplo, fatores como esterilização de superfície, tempo desde o consumo de bactérias e depuração de bactérias transitórias do intestino. Primeiro, concentrando-se na espécie bacteriana comensal de Drosophila L. plantarum (Lp; ver cepa Lp WF em Obadia et al.36), as moscas foram alimentadas com uma dose de ~105 UFCs de Lp e mantidas em grupos de 25 moscas por frasco. Essas moscas foram mantidas no mesmo frasco para injetáveis por 3 dias ou transferidas diariamente (transferidas) para alimentos frescos e estéreis (Figura 1B). As moscas não transferidas foram então lavadas em etanol para remover bactérias da superfície (lavadas) ou não lavadas (não lavadas). A lavagem produziu uma redução não significativa no total de UFCs medidas (Figura 1B), indicando que, nessas condições de inoculação altamente controladas, a superfície da mosca não se torna significativamente colonizada por bactérias em 3 dias. Os outros grupos de moscas foram transferidos todos os dias para reduzir o acúmulo de bactérias do crescimento nos alimentos (Transferido); além disso, um grupo foi transferido para alimentos frescos por 4 h antes da amostragem (Pós-Transferido), ou eles foram colocados em frascos com apenas água de ágar estéril por 4 h (Limpa) para permitir que micróbios ingeridos transitoriamente se dissipassem do intestino. Cada uma dessas etapas para fornecer uma medição de colonização mais rigorosa produziu uma redução estatisticamente significativa na abundância de UFCs nas moscas, com exceção da lavagem superficial em etanol. A transferência para alimentos estéreis (Pós-Transferidos) ou água de ágar (Limpo) por 4 h antes da medição produziu efeitos indistinguíveis, indicando que a transferência para condições estéreis 4 h antes da medição reduz a carga bacteriana. Esse resultado é consistente com a interpretação de que algumas bactérias intestinais no intestino da mosca são transitórias, enquanto outras estão mais estáveisassociadas 35. A abundância de Lp variou de 1 x 10 4,3 UFCs/mosca em moscas limpas a 1 x 104,9 UFCs nas moscas não lavadas (n = 724 moscas).
Em seguida, o mesmo ensaio foi conduzido usando Acetobacter indonesiensis (Ai), uma bactéria gram-negativa que coloniza o intestino da mosca (Figura 1C; ver cepa Ai SB003 em Obadia et al.36). Tal como acontece com as moscas colonizadas por Lp, a esterilização superficial produziu uma redução não significativa nas UFC. Da mesma forma, a transferência diária para alimentos estéreis reduziu significativamente a carga bacteriana, e a transferência para condições estéreis por 4 h antes da homogeneização produziu uma redução adicional na carga bacteriana. A abundância de Ai variou de 1 x 104,7 UFCs/mosca em moscas limpas a 1 x 105,0 UFCs nas moscas não lavadas (n = 528 moscas). Assim, a quantificação precisa das bactérias intestinais depende da frequência da transferência, inclusive no dia da transferência. A remoção da carga bacteriana externa por lavagem em etanol teve um efeito não significativo, mas efeitos mais significativos podem ser observados para diferentes cepas de bactérias ou diferentes condições de cultura. Esses fatores devem ser controlados experimentalmente.
O efeito potencial do método de homogeneização sobre as contagens de UFC também foi testado. As moscas foram homogeneizadas utilizando-se um batedor de contas com contas de vidro de 0,5 μm em 100 μL de PBS, o que poderia reduzir a viabilidade de células bacterianas. Primeiro, uma suspensão de bactérias Lp da cultura foi preparada em PBS e, em seguida, banhada para contar as UFCs como um controle positivo. A mesma cultura foi colocada na placa batedora de contas e (i) homogeneizada com contas, (ii) homogeneizada com contas e mosca livre de germes, ou (iii) homogeneizada em PBS sem contas (Figura 1D). A homogeneização em contas quando uma mosca estava presente não impactou significativamente a abundância de células viáveis em solução, enquanto a homogeneização de bactérias na ausência de uma mosca matou um número significativo de células bacterianas. A homogeneização em PBS sem contas também reduziu significativamente o número de células viáveis. Da mesma forma, a viabilidade da IA foi preservada quando homogeneizada na presença de uma mosca, enquanto a homogeneização sem mosca reduziu o número de células viáveis em solução (Figura 1E). Estes resultados indicam que o tecido da mosca protege as bactérias de serem destruídas pelas contas durante a homogeneização. No entanto, os experimentos da Figura 1D e da Figura 1E foram realizados com mais de 10 a 8 UFCs por poço. Na prática, poços com ~ 106 células por poço ou menos foram encontrados para mostrar pouca perda de células quando contas foram usadas sem uma mosca. Resfriar a placa no gelo no meio do caminho através do batimento de contas também melhora a viabilidade celular. O significado desses resultados é que os leitores devem estar cientes desses problemas potenciais e projetar controles apropriados para seu caso de uso específico.
Precisão das placas de 96 poços de chapeamento a ponto para quantificação de UFC de alto rendimento
Como o objetivo é medir a abundância de UFC para centenas a milhares de moscas individuais, os métodos tradicionais de espalhamento são proibitivamente intensivos em tempo e material. O plaqueamento pontual é um método eficaz e eficiente para o crescimento e a enumeração dasUFC 19,31. O método de chapeamento pontual utiliza um pipetador de 96 canais para dispensar 2 μL de suspensão bacteriana em meios preparados em placas de bandeja retangulares (Figura 2A). Cada mancha representa a carga bacteriana de uma única amostra, de modo que 96 moscas podem ser analisadas com uma única placa (Figura 2B). A precisão do revestimento pontual foi comparada com o revestimento tradicional por meio da inoculação de placas de crescimento usando exatamente a mesma suspensão OD 0,0001 de Lp para ambos os métodos. A suspensão foi diluída duas vezes em série cinco vezes em PBS. Como comparação cabeça-a-cabeça, 50 μL do inóculo foram espalhados em placas redondas individuais, ou 2 pontos μL foram feitos em placas MRS retangulares. As placas foram então incubadas a 30 °C até que as colônias fossem contáveis. As contagens de UFC resultantes para cada diluição foram utilizadas para calcular a concentração original da suspensão e comparadas (Figura 2C). Placas redondas com 50-500 UFCs foram contadas como controle. Não foi observada diferença significativa entre os métodos de alto rendimento e o tradicional revestimento.
Como a densidade das colônias pode afetar seu crescimento e quantificação, testou-se o efeito da densidade de UFC sobre as contagens finais. As manchas com 2 a 25 colônias por mancha não apresentaram diferença na contagem final em relação ao método tradicional de placa redonda (Figura 2C). Manchas com média de 35 colônias produziram resultados ligeiramente inferiores às placas de propagação de controle (Figura 2C; p = 0,0017). Um exame minucioso das fotografias de manchas individuais indicou que essa inclinação era devido a colônias sobrepostas em pontos densos. As medidas baseadas em pontos com média de 11 colônias por ponto resultaram em concentrações mais próximas daquelas baseadas nas placas de propagação (Figura 2C; Placas de propagação: média = 1 x 104,4 UFC; DP = 0,086 vs. manchas com 11 colônias médias: média = 1 x 104,4 UFC; DP = 0,12, p = 0,42, teste t de Welch).
Geração de imagens de alta qualidade para quantificação usando uma plataforma de fotografia especializada com luz branca ou fluorescência
O spot-plating de alto rendimento gera naturalmente um grande número de áreas-alvo, que devem ser contadas com precisão. Fotografias de qualidade podem ser usadas para documentar os dados e facilitar a contagem de UFCs. Uma plataforma de fotografia robusta e direta foi desenvolvida usando materiais comercialmente disponíveis (Figura 3A). Uma câmera digital foi anexada a um suporte em cima de uma caixa de luz personalizada, chamada FluoroBox, e foi apontada diretamente para baixo, perpendicular ao centro da placa. Um filtro de emissão colorido foi opcionalmente posicionado na frente da lente usando um controle deslizante de filtro. Um escudo de luz impediu o reflexo da lente, bloqueando a luz direta das fitas de LED abaixo. Tiras de LED iluminavam a placa dos lados, em vez de acima, para evitar o brilho na placa. Além da luz branca, LEDs azuis e verdes de cor única foram usados para excitar proteínas fluorescentes verdes e vermelhas, respectivamente. A placa foi mantida no lugar por um suporte de placa na gaveta, e a gaveta foi equipada com controles deslizantes de gaveta para facilitar a inserção da placa. Os designs completos estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 2.
Uma foto de uma placa pontual de colônias de Lp foi tirada usando LEDs de luz branca e uma câmera digital para auxiliar na contagem de colônias e distinguir diferentes cores e morfologias (Figura 3B). Para validar que a intensidade da iluminação era uniforme, a intensidade de fundo do ágar foi medida em diferentes regiões de uma fotografia de placa (Figura 3C). Para demonstrar que as colônias podem ser claramente distinguidas do fundo, a intensidade em todo o diâmetro de 10 colônias diferentes em diferentes partes da placa foi medida e verificou-se ser aproximadamente ~300% maior do que o fundo (Figura 3C). A placa foi inoculada com Lp com um plasmídeo de expressão de proteína fluorescente mCherry, bem como algum Lp que não continha o plasmídeo, de modo que as colônias eram mCherry-positivas ou mCherry-negativas. Para distinguir esses dois tipos de colônias, a placa foi fotografada usando a mesma câmera com luz LED verde (515-525 nm) e um filtro vermelho (Tiffen #29), fazendo com que as colônias mCherry-positivas fluorescessem (Figura 3D). A diferença de intensidade entre mCherry-positivo e mCherry-negativo foi quantificada pela medição da intensidade em uma amostra de colônias (n = 10 colônias). As colônias mCherry-positivas foram ~1.000% maiores do que as mCherry-negativas (Figura 3E). Colônias de Ai expressando GFP e colônias de Ai expressando sem fluorescência foram fotografadas usando luzes LED azuis (465-475 nm) e um filtro verde (Tiffen #58) (Figura 3F). As colônias GFP-positivas apresentaram intensidade 200% maior que as GFP-negativas (Figura 3G).
Contagem automatizada de CFUs em placas spot usando o plug-in personalizado ImageJ Count-On-It
As fotos por si só ajudam na contagem de colônias (por exemplo, armazenando os dados, compartilhando os dados, ampliando, marcando uma sobreposição, separando cores, etc.). No entanto, o ato de contar e organizar manualmente os resultados de centenas de pontos pode ser tedioso, demorado e propenso a diferenças de humano para humano nas contagens finais. Para acelerar o processo de contagem e padronizar a reprodutibilidade das contagens, um plug-in especializado do ImageJ chamado Count-On-It (Figura 4A) foi desenvolvido. Este plug-in permite a contagem semi-automatizada precisa de CFUs em placas de ágar. O usuário prepara imagens para contagem primeiro cortando-as e endireitando-as usando o plug-in adicional Croptacular. As fotos podem, opcionalmente, ser processadas em lote, e o limite pode ser ajustado para cada placa. Várias outras opções permitem que o usuário aumente a precisão da contagem de placas, incluindo o ajuste dos comprimentos de onda de luz (imagens RGB), a definição de uma faixa de tamanho de colônia (em pixels), a alteração da proporção máxima e a personalização das dimensões da grade de seleção ativa. Count-On-It produz uma tabela de resultados com cada placa representada como uma coluna de contagens de UFC. Ele também gera um recibo de foto mostrando uma sobreposição para documentar visualmente seus resultados de contagem e auxiliar na correção manual de erros (Figura 4B). Embora ocorram erros, quando o número de colônias contadas manualmente foi comparado com o número de colônias contadas usando esse plug-in (Figura 4C), a relação foi geralmente equivalente, com regressão linear entre as contagens manual e automatizada mostrando uma inclinação de 0,95 com mais de 90% de precisão (R2 = 0,93), embora o erro tenha aumentado quando o número de colônias excedeu 20.
Count-On-It também pode ser usado para contar separadamente colônias fluorescentes usando o recurso de fluorescência do FluoroBox. As contagens de colônias positivas para mCherry (Figura 4D) por plug-in de software versus manual tiveram um R2 de 0,92 (Figura 4E). Da mesma forma, as colônias GFP-positivas (Figura 4F) contadas com plug-in de software versus manual tiveram um R2 de 0,90 (Figura 4G). Colônias fluorescentes versus não fluorescentes podem ser distinguidas dentro de uma única amostra, e o tamanho e a forma da colônia também podem ser usados para distinguir subpopulações separadas (Figura 4H-K). Os recibos de fotos fornecem um registro que permite ao usuário verificar rapidamente a precisão das contagens e corrigir erros manualmente. Na Figura 4C,E,G,I,K, os recibos de fotos não foram usados para melhorar a precisão da contagem para que os leitores possam ver a saída bruta do método. Casos como na Figura 4G, em que uma contagem manual de 1 produziu uma contagem automatizada de 21, podem ser detectados rapidamente usando os recibos de fotos. Neste caso, o brilho na borda da placa criou bolhas que foram contadas como colônias. Para cada caso de uso, as configurações ideais para o plug-in de software precisam ser determinadas antes da contagem de alta taxa de transferência.
Figura 1: O ensaio de colonização mede as UFCs em centenas de moscas individuais usando um formato de placa de 96 poços. (A) Visão geral pictórica do ensaio de colonização e do método de quantificação de alto rendimento utilizado, conforme descrito na seção do protocolo. (B) A abundância de Lactiplantibacillus plantarum (Lp) em moscas após o ensaio de colonização foi medida em condições variadas usando o método de quantificação de UFC de alto rendimento. As moscas foram mantidas no mesmo frasco para injetáveis durante 3 dias e, em seguida, homogeneizadas e banhadas (não lavadas), lavadas em etanol antes do revestimento (lavadas), lavadas e transferidas todos os dias (transferidas), transferidas diariamente e depois mantidas em alimentos estéreis antes do revestimento (pós-transferidas), ou mantidas em frascos para injetáveis com apenas água durante 4 h (Limpa) (n = 724 moscas no total, 3 repetições biológicas e ~72 moscas no total por tratamento). (C) O mesmo ensaio de (B) foi realizado usando Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 moscas). (D) A suspensão bacteriana de Lp foi preparada em PBS e, em seguida, banhada para contar UFCs ou primeiro homogeneizada por batida de contas, batida por contas em combinação com uma mosca livre de germes (GF) ou agitada no batedor de contas sem contas ou uma mosca (n = 236 poços de amostra). (E) A viabilidade da IA pós-homogeneização foi testada da mesma forma que em (D) (n = 282 poços amostrais). A significância estatística para os painéis (B-E) foi calculada por meio do teste de Kruskal-Wallis seguido de testes de soma de postos de Wilcoxon pareados, com correção de comparações múltiplas de Bonferroni. Caixa dá intervalo interquartil. Linha indica mediana. Bigodes dão alcance total. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Precisão das placas de chapeamento a ponto de 96 poços para quantificação de UFC de alto rendimento. (A) Revestimento pontual utilizando um pipetador de 96 canais para dispensar 2 μL em meios preparados em placas de bandeja retangulares. (B) Placa de crescimento MRS-ágar com 96 manchas de colônias de Lp. (C) Concentração de suspensão de Lp com base nas contagens de UFC de placas redondas tradicionais (n = 24 placas) em comparação com a concentração baseada em contagens de UFC de placas pontuais (n = 680 pontos) diluídas em série e organizadas por contagem média de colônias por ponto (~48 pontos para cada fator de diluição único para três placas replicadas foram contados). Cada ponto de dados representa as colônias exatas por ponto, enquanto cada coluna representa as colônias médias para essa diluição. A linha pontilhada horizontal indica a contagem calculada de UFC da cultura que foi chapeada. Os pontos delineados em verde destacam as tradicionais contagens de placas redondas. Os pontos preenchidos em vermelho destacam a densidade ideal da colônia de 11 UFCs por ponto de 2 μL. A significância estatística foi calculada por meio de ANOVA one-way ordinária comparando a média de cada coluna com a média da coluna de controle da placa de spread com a correção de comparações múltiplas de Bonferroni. Caixa dá intervalo interquartil. Linha indica mediana. Bigodes dão alcance total. **p < 0,01. ns = não significativo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Uma plataforma de fotografia produz imagens quantificáveis de placas usando luz branca ou fluorescência . (A) Visão geral do design da FluoroBox. (B) Foto de uma placa pontual de colônias de Lp usando luz branca. (C) Perfil de intensidade de colônias individuais sob luz branca em comparação com a intensidade do fundo (BKG) (n = 10 colônias, a linha tracejada representa o desvio padrão). (D) Foto da mesma placa pontual que em (B), usando luzes verdes de cor única e o filtro vermelho para selecionar colônias de Lp positivas para mCherry. (E) Perfil de intensidade de colônias individuais ilustrando a diferença entre colônias com e sem emissão de mCherry. (F) Foto de uma placa pontual contendo colônias de AI, algumas das quais têm um rótulo GFP. (G) Perfil de intensidade de colônias únicas ilustrando a diferença entre colônias GFP-negativas e GFP-positivas. E, F, G: n = 10 colónias para cada parcela. Os diâmetros das colônias são de aproximadamente 1,5 mm. A linha tracejada é SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Contagem precisa de placas pontuais pelo plug-in Count-On-It ImageJ. (A) Captura de tela da janela de configuração do plug-in. (B) O plug-in gera um recibo para contagem de documentos e auxilia na correção de erros. Inserir: Sobreposição com o número de colônias contadas para cada região de mancha; o contorno amarelo indica que uma única colônia foi contada e vermelho que várias colônias foram contadas. (C) Gráfico mostrando o número de colônias contadas manualmente em comparação com o número de colônias contadas usando o plug-in (automatizado) quando uma imagem de luz branca foi usada, onde cada ponto no gráfico representa um único ponto contado manualmente ou automaticamente (inclinação de ajuste = 0,95, linha ciano; linha 1:1 é pontilhada de vermelho; R2 = 0,93, coeficiente de correlação de Pearson, p < 0,0001). (D) Imagem de recebimento de foto do plug-in quando colônias mCherry-positivas foram selecionadas usando o recurso de fluorescência da caixa de fotos. (E) Gráfico mostrando o número de colônias mCherry-positivas contadas usando o método manual em comparação com o automatizado quando a fluorescência vermelha foi usada (inclinação do ajuste = 1,1, linha ciano; linha 1:1 é pontilhada de vermelho; R2 = 0,92, coeficiente de correlação de Pearson, p < 0,0001). Observe que os valores atípicos e os erros não foram corrigidos usando os recibos de análise para E,G,I,K. (F) Imagem de recebimento de foto do plug-in quando colônias positivas para GFP foram selecionadas usando o recurso de fluorescência verde da caixa de fotos e selecionando o canal verde com o plug-in. (G) Gráfico mostrando o número de colônias GFP-positivas contadas usando o método manual em comparação com o automatizado quando a iluminação de fluorescência verde foi usada (inclinação do ajuste = 1,1, linha ciano; linha 1:1 é pontilhada de vermelho; R2 = 0,90, coeficiente de correlação de Pearson, p < 0,0001). (H) Colônias mCherry-positivas selecionadas a partir de morfologias de colônias mistas usando um alto limiar de fluorescência no plug-in. (I) Gráfico mostrando o número de colônias mCherry-positivas contadas pelo método manual em comparação com o automatizado quando a iluminação de fluorescência vermelha foi utilizada (inclinação do ajuste = 0,99; R2 = 0,91, coeficiente de correlação de Pearson, p < 0,0001). (J) Colônias mCherry-negativas selecionadas a partir de morfologias de colônias mistas utilizando um limiar de baixa fluorescência. (K) Gráfico mostrando o número de colônias mCherry-negativas contadas usando o método manual em comparação com o automatizado quando o limiar de intensidade foi definido para selecionar colônias não fluorescentes (inclinação do ajuste = 1,1; R2 = 0,85, coeficiente de correlação de Pearson, p < 0,0001). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Instruções de montagem do FluoroBox. Este arquivo orienta o leitor passo a passo através da construção da caixa de iluminação controlada usada no vídeo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: FluoroBox corte a laser acrílico. Este arquivo fornece um modelo de corte para cortar a laser as peças de acrílico para a caixa de iluminação controlada. O arquivo pode ser enviado para um fornecedor de acrílico cortado a laser. Consulte a Tabela de Materiais para o fornecedor usado neste protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 3: Instruções de software. Este arquivo orienta o leitor passo a passo através da instalação e uso do software Croptacular e Count-On-It fornecido com este protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 1: código de impressão 3D para bandeja de medição de contas (S1-bead-measurer.stl). Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 2: Rectangular plate photo cropper ImageJ plugin (Croptacular_.ijm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 3: Plugin de recortador de fotos de placa redonda (Circus_.ijm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 4: Placa retangular 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
As técnicas detalhadas aqui apresentadas permitem um aumento de > 100 vezes no número de amostras que podem ser avaliadas em um experimento de contagem de UFC. Esta técnica avança os métodos existentes para experimentos de microbioma em Drosophila 12,35,36 usando o formato de placa de 96 poços para testar moscas individuais. Além disso, aplica um método de spotping mais eficiente 19,31 e um fluxo de trabalho automatizado com uma plataforma de fotografia e contagem de colônias. A importância deste método para a Drosophila é padronizar os experimentos para o formato de placa de 96 poços, o que permite o manuseio simultâneo de um grande número de replicações biológicas com automação para alcançar a quantificação de alto rendimento das UFCs.
A plataforma de 96 poços mostra que o aumento da frequência de transferência e o "clareamento" de bactérias transitórias provocam uma redução significativa tanto na abundância média quanto na variação entre as amostras (Figura 1B,C), demonstrando o rigor desse protocolo aprimorado. Uma limitação das moscas de co-alojamento é a transferência horizontal de bactérias entre moscas. Uma solução proposta é manter as moscas individualmente em um formato de placa de 96 poços, como o Whole Animal Feeding Flat38.
Embora uma redução significativa na carga bacteriana não tenha sido observada quando as moscas foram lavadas em etanol, essas moscas só foram mantidas na presença de bactérias externas por 3 dias. O alojamento por períodos de tempo mais longos poderia permitir que uma maior carga bacteriana se acumulasse39. Portanto, a lavagem em etanol ainda é recomendada.
A transferência de moscas para a placa de 96 poços é a primeira etapa crítica para configurar o fluxo de trabalho (Figura 1A). Uma vez que as moscas são lavadas, elas são distribuídas nos poços, uma de cada vez. Um gráfico de placas é útil nesta fase para observar quais condições estão presentes em cada poço e adicionar quaisquer notas, como "a mosca foi perdida". A homogeneização é outro passo crítico com algumas ressalvas importantes. As bactérias sobrevivem ao processo de homogeneização quando na presença de uma mosca (Figura 1D,E) e, presumivelmente, esse princípio também é verdadeiro quando as bactérias estão dentro do intestino da mosca. No entanto, as bactérias também são mortas quando são homogeneizadas apenas em placas batedoras de contas, demonstrando que a homogeneização pode matar as células bacterianas em determinadas circunstâncias, uma limitação que pode ser importante se estiver homogeneizando intestinos dissecados, por exemplo. Notavelmente, a perda de UFCs ao homogeneizar depende do número de UFCs na amostra, e a perda é mínima quando ~105 UFCs por poço são usadas. Uma maior preservação das UFCs pode ser alcançada interrompendo a homogeneização no meio do caminho e resfriando a placa no gelo.
A homogeneização foi realizada por 5 min neste protocolo com base em experimentos de controle onde um número conhecido de UFCs foi misturado com uma mosca livre de germes, e isso funcionou empiricamente para bactérias moscas. Menos batidas fizeram com que partes maiores de moscas estivessem presentes, o que interfere na pipetagem, enquanto tempos de homogeneização significativamente mais longos, de ~ 10 minutos, tornaram as contagens de UFC mais variáveis. Observou-se que o menor volume e a forma angular dos poços de placa cônica reduzem a eficiência do batimento do talão em comparação com os tubos cilíndricos de 2 mL. Muitas variações nessa abordagem geral são possíveis, incluindo quais cepas bacterianas, quais contas batem no recipiente, quais contas e qual genótipo de mosca são usadas. Casos de usuários individuais precisam usar controles positivos para estabelecer sua abordagem.
O método de plaqueamento pontual foi empregado de forma específica: diluições 1:2 de L. plantarum WF em PBS foram manchadas em placas MRS e incubadas a 30 °C por 2 dias (tempos de incubação mais curtos podem ser implementados para gerar menores tamanhos de colônias). O método requer algum investimento inicial em equipamentos, principalmente o batedor de contas e o pipetador de 96 canais (Figura 2A), que é necessário tanto para a série de diluição quanto para o revestimento pontual. No entanto, opções mais baratas estão disponíveis, incluindo um replicador de placas de 96 poços com pinos ranhurados. A série de diluição é uma etapa crítica que afeta a precisão dos resultados da contagem de UFC. Em termos de modos de falha, é possível entupir as pontas da pipeta com peças de mosca ou contas de vidro e para as pontas da pipeta não selar corretamente no pipetador ou falhar por algum outro motivo. Todos esses problemas resultam em subcontagem dos poços afetados e devem ser monitorados. A mistura adequada em cada etapa da série de diluição também é crucial. Cada diluição deve ser misturada completamente colocando a placa em um agitador de placas ou pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes, o que também serve para enxaguar as pontas. Ao detectar da placa mais diluída para a menos diluída, as pontas podem ser reutilizadas para toda a série de diluição. Com diluições de 1:2, a contagem é precisa em uma faixa de 2-25 colônias, abrangendo uma ordem de magnitude (Figura 2C). Portanto, diluições 1:10 economizam tempo e materiais. Outra variável que pode ser aproveitada é o tempo de incubação, que pode ser ajustado para produzir colônias menores e, assim, aumentar a gama de pontos contáveis, impedindo a fusão de colônias adjacentes.
Uma foto de qualidade da placa é essencial, pois ela se torna a fonte bruta de dados a partir da qual as UFCs são analisadas e podem ser arquivadas indefinidamente. A FluoroBox foi projetada para produzir fotos das placas com intensidade de luz uniforme, o que minimiza o brilho na superfície do ágar. Além disso, o projeto é capaz de fotografar seletivamente colônias fluorescentes usando luzes LED de cor única e filtros de fotos coloridas (Figura 3A). A construção de uma configuração como a FluoroBox, com iluminação controlada e configurações de câmera, pode aumentar muito a reprodutibilidade das imagens CFU, o que é importante para a análise automatizada. As morfologias das colônias, a intensidade da fluorescência e os efeitos do tempo ou da densidade no crescimento da colônia são apenas algumas das propriedades que podem ser analisadas usando as fotografias. A caixa de fotos pode ser construída sem os filtros de cor e luzes de cor única se nenhuma bactéria fluorescente for usada, reduzindo o custo e a complexidade. Diferentes luzes de excitação e filtros de emissão podem ser substituídos pelos recomendados aqui se um fluoróforo diferente for usado por um laboratório. Uma câmera conectada a um tablet via Wi-Fi usando um aplicativo é útil tanto para o recurso de obturador automatizado para evitar tremores quanto para facilitar a transferência de dados. As imagens podem ser transferidas para o tablet e, em seguida, para um laptop usando o software de transferência de arquivos sem fio. As câmeras recomendadas com esses recursos são indicadas na Tabela de Materiais.
Count-On-It é um plug-in escrito no ImageJ. O software automatizado de contagem de UFC segmenta a imagem da placa em uma grade uniforme de 96 poços, conta as colônias em cada célula de grade e agrupa os resultados em uma planilha simples. Como sempre há variação na posição da grade pontual na placa e na foto, o usuário deve conformar manualmente a grade à foto usando o plug-in Croptacular. Isso também ajuda a excluir áreas próximas à borda da placa, que têm brilho. Definir o limite é fundamental para obter a contagem de UFC mais precisa da imagem. Se o limiar for definido muito alto, as colônias se fundirão; se o limiar for fixado demasiado baixo, as colónias serão excluídas. Uma vez que o limite é definido, a macro aplica desfoque gaussiano para suavizar as bordas e reduzir o aliasing, o filtro da bacia hidrográfica divide colônias sobrepostas e as bolhas são contadas usando partículas de análise.
Às vezes, a densidade de colônias é muito alta em um determinado local. Count-On-It fornece uma maneira de lidar com isso. Para estimar o número de colônias em uma célula de grade com colônias parcialmente fundidas, primeiro a área média de uma bolha circular de toda a placa é tomada como Cavg. Em seguida, a área da bolha A 1 é dividida pela área média de uma bolha circular A1/Cavg. Esse número é arredondado para o inteiro mais próximo, e essa é a estimativa de quantas colônias estão em uma bolha. Essa função é uma das razões pelas quais o limite pode influenciar os resultados da contagem: a área média relativa da colônia versus uma área de blob mesclada será diferente dependendo de como o limite afetou as bolhas mescladas.
Os métodos apresentados apresentam várias limitações. Isso inclui a necessidade de equipamentos para dispensar meios líquidos com precisão a partir de placas de 96 poços. Este equipamento, seja um pipetador de 96 canais ou uma ferramenta de pino replicador ranhurado, pode custar milhares de dólares para obter. Alternativas mais baratas existem, mas são menos precisas. A contagem automatizada via Count-On-It também apresenta algumas limitações. Por exemplo, se dois tipos de colônias em uma população mista fossem delimitados com base apenas no tamanho, a contagem de blobos não seria capaz de atribuir colônias ao tipo correto. Nesse caso, manchas com bolhas precisariam ser eliminadas das contagens. Uma maior diferenciação das colônias com base na morfologia seria uma extensão valiosa do método que não está implementado atualmente. O uso de meios seletivos, incluindo nutrientes específicos da cepa e antibióticos, simplifica a necessidade de análise complexa de imagens.
A manutenção de experimentos com moscas da fruta em placas de 96 poços multiplica o número de amostras e condições que podem ser testadas em um único experimento e pode facilitar telas de alto rendimento em fenótipos de associação Drosophila-bactéria. Imaginamos que este método pode ser estendido usando meios seletivos para diferenciar muitas cepas bacterianas em misturas complexas. O método não se limita ao estudo do microbioma da mosca. A quantificação de UFCs é comum em muitas aplicações da microbiologia, desde a contagem de coliformes na água potável até a identificação de patógenos. O sistema de chapeamento CFU apresentado aqui permite telas de alto rendimento, bem como aquisição, processamento, armazenamento e entrega automatizados de resultados.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O Dr. Kerwyn Casey Huang, o Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper e membros do laboratório de Ludington deram informações valiosas sobre o desenvolvimento deste protocolo. O financiamento foi fornecido pela subvenção NSF IOS 2032985, pela subvenção do NIH DP5OD017851, por uma subvenção da Carnegie Institution of Canada e pelo Carnegie Institute for Science's Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead beating and spot plating | |||
| Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
| Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
| Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
| Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
| Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
| MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
| Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
| TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
| Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
| Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
| Photobox construction | |||
| ¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
| ¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
| ¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
| 1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
| 22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
| 22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
| 4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
| 4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
| 6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
| 6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
| 8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
| Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
| Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
| Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
| Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
| Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
| Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
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| Software | |||
| ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
| MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
| Unix | BSD | N/A | 64 bit |
| Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |
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