Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein murines experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD). CHS basiert auf der Sensibilisierung mit reaktivem Hapten durch Lackieren der rasierten Haut von Brust und Bauch, mit einer anschließenden Ohrhautherausforderung mit einem verdünnten Hapten, was eine Schwellungsreaktion verursacht, die auf verschiedene Arten beurteilt wird.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Kontaktüberempfindlichkeit als murines Modell der allergischen Kontaktdermatitis
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kontaktüberempfindlichkeit (CHS) ist ein experimentelles Modell der allergischen Kontaktdermatitis (ACD), das an Mäusen untersucht werden kann. Diese Studie zielt darauf ab, eine objektive Labormethode vorzustellen, die helfen kann, die CHS-Reaktion in Mäusen zu untersuchen, die durch verschiedene Tests gemessen und quantifiziert werden kann. Um CHS zu induzieren, wurden Mäuse am Tag "0" an einer zuvor rasierten Stelle durch Bauchhautmalerei mit dem hapten 2,4,6-Trinitrochlorbenzol (TNCB) in einem Aceton-Ethanol-Gemisch sensibilisiert, während Negativkontrollmäuse mit Vehikel-Alone-Aceton-Ethanol-Gemisch scheinsensibilisiert wurden. Am Tag "4" wurde die Grundohrendicke mit einem Mikrometer vor der Auslösung von CHS (Challenge) gemessen, indem beide Ohren mit verdünntem TNCB sowohl in der Test- als auch in der Kontrollgruppe lackiert wurden. Nach 24 h wurde die Ohrschwellung mit einem Mikrometer gemessen. CHS ist ein Beispiel für eine T-Zell-vermittelte Immunantwort, die Schwellungen in entzündetem Gewebe verursacht und 24 Stunden nach der Hautherausforderung mit der gleichen Hapten ihren Höhepunkt erreicht. Eine Zunahme des Ohrödems korrelierte mit erhöhtem Ohrgewicht, Myeloperoxidase (MPO) -Aktivität, entzündungsfördernder Zytokinkonzentration in den Ohrextrakten, erhöhter Verdickung der ödematösen Dermis in der histologischen Untersuchung und Ohrvaskulärpermeabilität. Es gab auch einen Anstieg der Konzentration von TNP-spezifischen IgG1-Antikörpern in den Seren der Testgruppe im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Darüber hinaus kann CHS erfolgreich mit den CHS-Effektorzellen übertragen werden, die von Spendern erhalten wurden, die zuvor mit TNCB sensibilisiert wurden. Die CHS-Effektorzellen wurden intravenös in naive Empfängermäuse verabreicht, die anschließend mit dem gleichen verdünnten Hapten herausgefordert wurden. Die Ohrschwellung wurde 24 Stunden später mit einem Mikrometer gemessen.
Einleitung
Allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist eine häufige entzündliche Hauterkrankung in Industrieländern, die durch eine Typ-IV-Überempfindlichkeitsreaktion verursacht wird, die sich aus der Exposition gegenüber niedermolekularen Chemikalien, den sogenannten Hapenten, ergibt. Zu den Substanzen, die beim Menschen eine Kontaktsensibilisierung verursachen, gehören Schwermetallionen (Chrom, Nickel, Eisen, Kobalt), Terpentin, Duftstoffe, Farbstoffe und Konservierungsstoffe, die in Kosmetika enthalten sind (z. B. p-Phenylendiamin), einige Medikamente (z. B. Neomycin, Benzocain), β-Lactam-Antibiotika (dh Penicillin), von Pflanzen hergestellte Chemikalien (Penadecacatechol, eine ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle in diesem Artikel vorgestellten Experimente wurden nach den Richtlinien des 1. Lokalen Ethikkomitees für Tierversuche in Krakau durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden gemäß den lokalen Empfehlungen durchgeführt, insbesondere in Bezug auf die Verwendung von Ketamin / Xylazin als Anästhetikum, die Verwendung beider Seiten der Ohren zum Auftragen der Substanz / des Hapten, das Abschneiden des Ohrs und das Sammeln von Blut durch Augapfelentfernung. BALB/c (Haplotyp H-2d), CBA/J (H-2 k) und C57BL/6 (H-2b) männliche und weibliche Mäuse, 6-12 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet (siehe Materialtabell....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Für die CHS-Induktion wurden die Tiere durch Hautmalerei (abdominal) mit 150 μL von 5% TNCB sensibilisiert oder mit dem Vehikel allein scheinsensibilisiert. Am Tag "4" wurden die Ohrschwellungsreaktionen beider Ohren durch Kontaktmalerei (Challenge) mit 10 μL von 0,4% TNCB in beiden Mäusen induziert, die zuvor mit TNCB (Testgruppe) und den Kontrollgruppenmäusen (scheinsensibilisiert) sensibilisiert waren. Die vorgestellten Daten zeigen, dass die mit TNCB sensibilisierten und 4 Tage später herausgeforderten Mäuse.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
CHS wird über Hapten induziert, die an Selbstproteinantigene in der Haut binden und Neoantigene bilden. CHS wird durch lokale extravaskuläre Rekrutierung von zirkulierenden antigenspezifischen CHS-Effektor-T-Zellen vermittelt, was zu einer Schwellung im herausgeforderten Gewebe führt, die 24 Stunden nach der Exposition der Sekundärhaut gegenüber dem gleichen Hapten6 ihren Höhepunkt erreicht. Die Schwellung des Gewebes wird hauptsächlich durch die Infiltration von Leukozyten und die leukoz.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch die Subvention SUBZ unterstützt. A020.22.060 der Medizinischen Universität in Breslau, Polen, und durch Zuschüsse des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung N N401 545940 an MS und IP2012 0443 72 an MMS.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 70% Ethanol | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 65350-M | zur Oberflächendesinfektion |
| 96-Well-Platten mit flachem Boden, Polypropylen | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich | 655101 | für MPO- und Evans-Blau-Messung - Platten sollten aus Polypropylen bestehen, das eine geringere Bindungskapazität aufweist, damit Proteine oder DNA nicht binden |
| Aceton (ACS-Reagenz, ≥ 99,5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 179124 | |
| Aluminiumfolie | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | Z185140 | |
| Analysenwaage | Sartorius Weighing Technology GmbH, Göttingen, Deutschland | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
| Automatisierter Gewebeprozessor | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, Indien | MTP-E-212 | Automatische Aufbereitung von Gewebeproben durch Fixieren, Dehydrieren, Reinigen und Infiltrieren mit Paraffin |
| BD Vacutainer SST II Advance (Röhrchen mit Gel zur Gewinnung von Serum) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | BD 366882 | |
| Bicinchoninsäure-Kit zur Proteinbestimmung | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | BCA1-1KT | |
| Biotin Ratte Anti-Maus IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 553441 | |
| BSA (Rinderserumalbumin) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | A9418 | Proteinassays & Analysen, 2 mg/mL |
| Zellsieb, Porengröße 70 μ m | BIOLOGIX, China | 15-1070 | geeignet für 50 mL Röhrchen |
| Deckglas VWR, Radnor, Pennsylvania, Vereinigte Staaten | 631-1583 | 24 mm, aber es ist möglich, andere Größen zu verwenden | |
| Einwegpipetten Kapazität: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | Z740301, Z740302, Z740303 | |
| DPBS (Dulbecco′ ThermoFisher | Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14190144 | kein Kalzium, kein Magnesium, Säugetierzellkultur |
| DPX Eindeckmittel für die Histologie | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 6522 | Einbettmittel für H-E, kann verwendet werden z.B. Kanadabalsam |
| Dumont 5 Pinzette - gerade | Animalab, Poznan, Polen | 11251-10FST | chirurgische Instrumente für Eingriffe an Mäusen (sollte sterilisiert werden) |
| Dumont 7 Pinzette - gebogen | Animalab, Poznan, Polen | 11272-50FST | chirurgische Instrumente für Eingriffe an Mäusen (sollte sterilisiert werden) |
| Eosin Y-Lösung, alkoholisch | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | HT110116 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mL | Eppenforf, Deutschland | 3,01,20,086 | Polypropylen |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mL | Eppenforf, Deutschland | 3,01,20,094 | Polypropylen, runder Boden (die Homogenisierungskügelchen können sich leicht bewegen) |
| Ethanol 100% (absoluter Alkohol) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 1.07017 | |
| Ethanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 1.59010 | |
| Evans blue | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | E2129 | |
| FBS (fötales Rinderserum) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | ||
| Formalinlösung, neutral gepuffert, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | HT501128 | |
| Formamid 99,5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | F7503 | |
| Gefrierschrank -20 > C | Bosch, Deutschland | GSN54AW30 | |
| Kühlschrank +4 &Grad; C / Gefrierschrank -20 &Grad; C | Bosch, Deutschland | KGV36V10 | Säugetierzellkultur, qualifiziert, Brasilien, 10 x 50 mL |
| Glasmikroskopie-Objektträger, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Objektträger, die das Auftragen von Klebematerialien oder Proteinbeschichtungen überflüssig machen, um den Verlust von Gewebeschnitten während der Färbung zu verhindern. |
| Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
| Graue Seife | Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Polen | Bialy jelen Seife | Bar grau Seife Bar Natural Hypoallergen. Allgemein verfügbares Produkt |
| H2SO4 (Schwefelsäure) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 1.60313 | |
| Harris Hämatoxylinlösung | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | HHS16 | |
| Hämozytometer | VWR, Avantor, U.S.A | 612-5719 | manuelle Zählkammer wird empfohlen, die genauer ist |
| Hexadecyltrimethylammoniumbromid | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | H5882 | |
| Homogenisator | QIAGEN Hilden, Deutschland | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | Homogenisator mit Edelstahlkügelchen (Durchmesser 5 mm) für 2 mL Zentrifugenröhrchen |
| Meerrettichperoxidase Streptavidin (HRP Streptavidin) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA | SA-5004-1 | |
| Wasserstoffperoxidlösung (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | H1009 | |
| Inkubator Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Deutschland | 41071068 | 37 oC in der Atmosphäre von 5 % CO2 und 65 0C zur Entparaffinisierung der Schnitte für die Histologie |
| Ketamin 100 mg/ml, Injektionslösung | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polen | Kat.# nicht lieferbar | |
| KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 99,995% wasserfreie Basis | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 1.05108 | |
| Laborzentrifuge | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Deutschland | B00013899 | Drehzahl auf 300 x g, mit Kühlung auf 4 0C |
| Laborzentrifuge | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Deutschland | 75002425 | Geschwindigkeit auf 3.000 x g, mit Kühlung auf 4 0C |
| Maske (FFP2) | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 111-0917 | für die Arbeit mit ortho-dianisindihydrochlorid |
| Mäusezuchteinheit des Lehrstuhls für Biomedizinische Wissenschaften, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Jagiellonen-Universitätsmedizin, Krakau, Polen | CBA/J, C57BL/6 | ||
| Mikrometer | Mitutoyo, Tokio, Japan | 193-111 | stellige Außenmessschraube, Ratschenanschlag, 0-25 mm Bereich, 0,001 mm Teilung, +/-0,002 mm Genauigkeit, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
| Mikroplatte, 96 Well, Mikrolon, hohe Bindung (für ELISA-Test) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich | 655061 | mit Maxi-Sorp-Bindungsflächen für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in farbmetrischen Assays |
| Mikroskop mit Objektiven | Leica Microsystems CMS GmbH, Deutschland | DM1000, 294011-082007 | Die in der Arbeit vorgestellte Histologie wurde unter dem ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System durchgeführt, mit den Zielen: FL 20X LWDPH, 0,40NA/3,1WD und FL 40X LWDPH 0,65NA/1,79WD |
| Myeloperoxidase aus humanen Leukozyten (MPO-Standard) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | M6908 | |
| Na2HPO4 x 7 H2O (Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | S9390 | |
| Olivenöl | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 75343 | reine, natürliche |
| OptEIA Maus IFN-γ ELISA-Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555138 | |
| Ortho-dianisin-dihydrochlorid | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | D3252 | |
| Paraffinwachs | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 76242 | Kügelchen, wachsartiger fester PBS |
| (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 20012027 | pH 7,2, pH-Messgerät für Säugetierzellkulturen |
| Elmetron, Polen | CP-401 | ||
| Pipetten, variables Volumen mit Spitzen | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | EP3123000900-1EA | 3er-Pack, Option 1, 0,5-10 μl/10-100 μl/100-1000 μl, enthält epT.I.P.S. |
| Rasierklinge | VWR, Radnor, Pennsylvania, Vereinigte Staaten | PERS94-0462 | Schaber- und Schneideklingen, einschneidig, Aluminiumrücken, 100 Klingen pro Packung, einzeln verpackt |
| Rotationsmikrotom | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A | |
| Schere - gerade, scharf / scharf | Animalab, Poznan, Polen | 14060-10FST | Chirurgische Instrumente für Eingriffe an Mäusen (sollten sterilisiert werden) |
| Schraubverschluss (oben offen) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 27056 | schwarze Lochkappe aus Polypropylen, zur Verwendung mit 22 mL Fläschchen mit 20-400 Gewinde |
| Spektralphotometer | BioTek Instruments, U.S.A | 201446 | universelles Mikrotiterplatten-Spektralphotometer: λ Bereich: 200 - 999 nm, Extinktivmessbereich: 0,000 - 4.000 Abs |
| Färbeschale 20 Objektträger mit Gestell | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | S6141 | z.B. 20 Objektträger-Färbeschalen komplett mit Abdeckungen, Objektträgergestell und Griff |
| Sterile Einweg-Biopsie-Stanze 6mm | Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA | 33-36 | |
| Chirurgische Schere | Animalab, Poznan, Polen | 52138-46 | Chirurgische Instrumente für Eingriffe an Mäusen (sollten sterilisiert werden) |
| Kassetten für die Gewebeverarbeitung | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | Z672122 | Kassetten für die Gewebeverarbeitung/ -einbettung mit Deckel |
| TMB Substrat-Reagenzien-Set | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | |
| TNCB (2,4,6-Trinitrochlorbenzol) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan | C0307 | |
| TNP-BSA (Rinderserumalbumin, konjugiert mit 2,4,6-Trinitrophenyl) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA | T-5050 | |
| T-PER (Gewebeprotein-Extraktionsreagenz) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 78510 | |
| Röhrchen 15 mL steril | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | CLS430055 (Corning) | Polypropylen, konischer |
| Boden Röhrchen 50 mL, steril | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | CLS430290 (Corning) | Polypropylen, konischer Boden |
| Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | P1379 | |
| Fläschchen mit Schraubverschluss, Klarglas (nur Fläschchen) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 27173 | zur Herstellung von Hapten, aufgeschraubt, damit es nicht verdunstet |
| Wasserbad | AJL Electronic, Polen | LW102 | |
| Wachs (Paraffin) Spender | VWR, Radnor, Pennsylvania, Vereinigte Staaten | 114-8737 | |
| Xylazin (Xylapan 20 mg/ml) Injektionslösung | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polen | Kat.# nicht verfügbar | |
| Xylol (histologische Qualität) | Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland | 534056 |
Referenzen
- Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
- Hertl, M., et al. Predominance of epiderma....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.
Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
to:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
Figure 1 of the Representative Results has been updated from:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 2 of the Representative Results has been updated from:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
