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Immunology and Infection

Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

La capacidad de los bacteriófagos para mover el ADN entre las células bacterianas los convierte en herramientas efectivas para la manipulación genética de sus huéspedes bacterianos. Aquí se presenta una metodología para inducir, recuperar y usar φBB-1, un bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transducir ADN heterólogo entre diferentes cepas de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.

Abstract

La introducción de ADN extraño en la espiroqueta Borrelia burgdorferi se ha logrado casi exclusivamente mediante la transformación mediante electroporación. Este proceso tiene eficiencias notablemente más bajas en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme en relación con otras bacterias Gram-negativas mejor caracterizadas. La tasa de éxito de la transformación depende en gran medida de tener cantidades concentradas de ADN de alta calidad de antecedentes específicos y está sujeta a una variabilidad significativa de cepa a cepa. Los medios alternativos para introducir ADN extraño (es decir, vectores lanzadera, reporteros fluorescentes y marcadores de resistencia a los antibióticos) en B. burgdorferi podrían ser una adición importante al arsenal de herramientas útiles para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Los bacteriófagos han sido bien reconocidos como mecanismos naturales para el movimiento del ADN entre las bacterias en un proceso llamado transducción. En este estudio, se ha desarrollado un método para utilizar el ubicuo fago borrelial φBB-1 para transducir ADN entre células de B. burgdorferi de los mismos y diferentes antecedentes genéticos. El ADN transducido incluye tanto ADN borrelial como ADN heterólogo en forma de pequeños vectores lanzadera. Esta demostración sugiere un uso potencial de la transducción mediada por fagos como complemento de la electroporación para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Este informe describe métodos para la inducción y purificación del fago φBB-1 de B. burgdorferi, el uso de este fago en ensayos de transducción y la selección y selección de transductores potenciales.

Introduction

El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de la bacteria espiroqueta Borrelia burgdorferi ha añadido un valor inconmensurable a la comprensión de la naturaleza de la enfermedad de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tiene un genoma inusualmente complejo compuesto por un pequeño cromosoma lineal y plásmidos lineales y circulares 5,6. La pérdida espontánea de plásmidos, el reordenamiento intragénico (movimiento de genes de un plásmido a otro dentro del mismo organismo) y la transferencia horizontal de genes (HGT, el movimiento de ADN entre dos organismos) han dado lugar a una cantidad vertiginosa de heterogeneidad genética entre B. burgdorferi (para un ejemplo, ver Schutzer et al.7). Los genotipos resultantes (o "cepas") son todos miembros de la misma especie, pero tienen diferencias genéticas que influyen en su capacidad para transmitir e infectar a diferentes huéspedes mamíferos 8,9,10,11. En este informe, el término "cepa" se utilizará para referirse a B. burgdorferi con un fondo genético particular de origen natural; El término "clon" se utilizará para referirse a una cepa que ha sido modificada genéticamente para un propósito particular o como resultado de una manipulación experimental.

La caja de herramientas moleculares disponible para su uso en B. burgdorferi incluye marcadores seleccionables, reporteros de genes, vectores lanzadera, mutagénesis de transposones, promotores inducibles y marcadores contraseleccionables (para una revisión, ver Drektrah y Samuels12). El uso efectivo de estas metodologías requiere la introducción artificial de ADN heterólogo (extraño) en una cepa de B. burgdorferi de interés. En B. burgdorferi, la introducción de ADN heterólogo se logra casi exclusivamente a través de la electroporación, un método que utiliza un pulso de electricidad para hacer una membrana bacteriana transitoriamente permeable a pequeños trozos de ADN introducidos en el medio1. La mayoría de las células (estimadas en ≥99,5%) son destruidas por el pulso, pero las células restantes tienen una alta frecuencia de retención del ADN heterólogo13. Aunque se considera uno de los métodos más eficientes para introducir ADN en bacterias, la frecuencia de electroporación en B. burgdorferi es muy baja (oscilando entre 1 transformador en 5 × 104 a 5 × 106 células)13. Las barreras para lograr frecuencias más altas de transformación parecen ser tanto técnicas como biológicas. Las barreras técnicas para el éxito de la electroporación de B. burgdorferi incluyen tanto la cantidad de ADN (>10 μg) que es necesaria como el requisito de que las espiroquetas estén exactamente en la fase de crecimiento correcta (mid-log, entre 2 × 107 células·mL−1 y 7 × 107 células·mL−1) al preparar células electrocompetentes12,13. Estas barreras técnicas, sin embargo, pueden ser más fáciles de superar que las barreras biológicas.

Los investigadores de la enfermedad de Lyme reconocen que los clones de B. burgdorferi se pueden dividir en dos grandes categorías con respecto a su capacidad para ser manipulados genéticamente13,14. Los aislados de alto paso, adaptados al laboratorio, a menudo se transforman fácilmente, pero generalmente han perdido los plásmidos esenciales para la infectividad, se comportan de manera fisiológicamente aberrante y no pueden infectar a un huésped mamífero o persistir dentro de un vector de garrapatas12,13. Si bien estos clones han sido útiles para diseccionar la biología molecular de la espiroqueta dentro del laboratorio, son de poco valor para estudiar la espiroqueta dentro del contexto biológico del ciclo enzoótico. Los aislados infecciosos de paso bajo, por otro lado, se comportan de manera fisiológica que refleja un estado infeccioso y pueden completar el ciclo infeccioso, pero generalmente son recalcitrantes a la introducción de ADN heterólogo y, por lo tanto, son difíciles de manipular para el estudio12,13. La dificultad para transformar aislados de paso bajo está relacionada con al menos dos factores diferentes: (i) los aislados de paso bajo a menudo se agrupan estrechamente, particularmente en las condiciones de alta densidad requeridas para la electroporación, bloqueando así muchas células de la aplicación completa de la carga eléctrica o el acceso al ADN en el medio13,15; y (ii) B. burgdorferi codifica al menos dos sistemas diferentes de modificación de restricción transmitida por plásmidos (R-M) que pueden perderse en aislados de paso alto14,16. Los sistemas R-M han evolucionado para permitir que las bacterias reconozcan y eliminen el ADN extraño17. De hecho, varios estudios en B. burgdorferi han demostrado que las eficiencias de transformación aumentan cuando la fuente del ADN es B. burgdorferi en lugar de Escherichia coli13,16. Desafortunadamente, adquirir la alta concentración requerida de ADN para la electroporación de B. burgdorferi es una perspectiva costosa y lenta. Otra preocupación potencial al electroporar y seleccionar aislados de paso bajo es que el proceso parece favorecer a los transformadores que han perdido el plásmido crítico asociado a virulencia, lp2514,18,19; por lo tanto, el acto mismo de manipular genéticamente aislados de B. burgdorferi de paso bajo mediante electroporación puede seleccionar clones que no son adecuados para el análisis biológicamente relevante dentro del ciclo enzoótico20. Dados estos problemas, un sistema en el que el ADN heterólogo podría electrotransformarse en clones de B. burgdorferi de alto paso y luego transferirse a aislados infecciosos de paso bajo por un método distinto de la electroporación podría ser una adición bienvenida a la creciente colección de herramientas moleculares disponibles para su uso en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.

Además de la transformación (la captación de ADN desnudo), hay otros dos mecanismos por los cuales las bacterias toman regularmente ADN heterólogo: la conjugación, que es el intercambio de ADN entre bacterias en contacto físico directo entre sí, y la transducción, que es el intercambio de ADN mediado por un bacteriófago21. De hecho, la capacidad del bacteriófago para mediar HGT ha sido utilizada como una herramienta experimental para diseccionar los procesos moleculares dentro de varios sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi no es naturalmente competente para la absorción de ADN desnudo, y hay poca evidencia de que B. burgdorferi codifique el aparato necesario para promover una conjugación exitosa. Informes anteriores han descrito, sin embargo, la identificación y caracterización preliminar de φBB-1, un bacteriófago templado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empaqueta una familia de plásmidos de 30 kb encontrados dentro de B. burgdorferi25; Los miembros de esta familia han sido designados CP32. Consistente con un papel para φBB-1 en la participación en HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. informaron un cp32 idéntico encontrado en dos cepas con cp32s dispares, lo que sugiere un intercambio reciente de esta cp32 entre estas dos cepas, probablemente a través de la transducción29. También hay evidencia de una recombinación significativa a través de HGT entre los cp32 en un genoma relativamente estable30,31,32,33. Finalmente, la capacidad de φBB-1 para transducir tanto cp32s como ADN vector lanzadera heterólogo entre células de la misma cepa y entre células de dos cepas diferentes ha sido demostrada previamente27,28. Dados estos hallazgos, φBB-1 se ha propuesto como otra herramienta a desarrollar para la disección de la biología molecular de B. burgdorferi.

El objetivo de este informe es detallar un método para inducir y purificar el fago φBB-1 de B. burgdorferi, así como proporcionar un protocolo para realizar un ensayo de transducción entre clones de B. burgdorferi y seleccionar y seleccionar posibles transductores.

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Protocol

Todos los experimentos con ADN recombinante y organismos BSL-2 fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Quinnipiac.

1. Preparación del cultivo de B. burgdorferi para la producción de φBB-1

  1. Preparar el medio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado con suplementado con suero normal de conejo (BSK) inactivado por calor al 6,6%15. Para 1 L de 1x BSK, combinar los componentes enumerados en la Tabla 1 en 900 ml de agua, ajustar el pH a 7,6 utilizando 1 N de hidróxido de sodio y mezclar lentamente a 4 °C durante 2-4 h. Una vez completada la mezcla, verifique y reajuste el pH a 7.6 si es necesario, y aumente el volumen a 1 L con agua. Esterilizar el medio pasando a través de un filtro de 0,22 μM (ver Tabla de materiales) y usar fresco o almacenar a 4 °C durante ≤2 meses.
  2. De tres a cinco días antes de comenzar el protocolo de transducción, inocular 150 μL del clon o clones apropiados de B. burgdorferi en 15 ml de 1x BSK en tubos centrífugos cónicos estériles bien tapados (ver Tabla de materiales). Complementar el medio con la concentración apropiada de antibióticos o combinación de antibióticos para la selección y mantenimiento del ADN heterólogo dentro del clon o clones de B. burgdorferi (Tabla 2).
    NOTA: B. burgdorferi es un organismo de nivel 2 de bioseguridad. Tome todas las precauciones apropiadas mientras trabaja con este organismo. Realizar todos los trabajos con cultivos vivos de B. burgdorferi en un gabinete de bioseguridad clase II certificado y debidamente desinfectado. Deseche adecuadamente todo el material que entre en contacto con B. burgdorferi y los propios organismos según las pautas de los CDC34.
  3. Incubar los cultivos a 33 °C sin agitar hasta que los cultivos alcancen una densidad de ≥5 × 107 espiroquetas·mL−1, lo que tarda aproximadamente 3-5 días.

2. Determinar la densidad de los cultivos de B. burgdorferi (modificados de Samuels)15

  1. Para densidades anticipadas superiores a 5 × 106 células·mL−1, determinar la densidad celular mediante espectroscopia.
    1. Transfiera 1 ml de cultivo a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y centrifugar a 8.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    2. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 y 1.8mM KH2PO4). Transfiera toda la suspensión celular a una cubeta transparente semi-micro UV.
    3. Determinar la densidad óptica de la muestra resuspendida a una longitud de onda de 600 nm (A600). Ponga a cero el espectrofotómetro (consulte la Tabla de materiales) contra PBS.
    4. Para calcular la concentración de espiroquetas·mL−1 en el cultivo original, multiplique la densidad óptica en A600 por 1,4 × 109.
  2. Para densidades anticipadas entre 5 × 104 células·mL−1 y 5 × 106 células·mL−1, determine la densidad celular utilizando una cámara de conteo de Petroff-Hausser (ver Tabla de materiales) para contar directamente el número de espiroquetas. Este método también se puede utilizar para densidades más altas después de una dilución adecuada.
    NOTA: La visualización de espiroquetas vivas requiere un microscopio modificado con un condensador de campo oscuro.
    1. Aplicar 10 μL de muestra a la cámara de recuento y cubrir con el vidrio adecuado. Para densidades superiores a 1 × 107, diluir la muestra en PBS para obtener 50-100 espiroquetas por campo.
    2. Cuente las células usando un microscopio de campo oscuro con un aumento de 200x-400x. Cuenta todo el campo de 25 grupos de 16 cuadrados pequeños en todos los planos.
    3. Multiplicar el número contado por el factor de dilución (si lo hubiera) y 5 × 104 para obtener células·mL−1 del cultivo original.

3. Inducción del fago de B. burgdorferi φBB-1

NOTA: Esterilice todos los artículos de vidrio y plástico en autoclave; esterilizar todas las soluciones mediante esterilización en autoclave o filtración a través de un filtro de 0,22 μM. Los pasos a continuación se presentan en base a volúmenes de 15 ml, pero el método es escalable a volúmenes más pequeños o más grandes dependiendo de las necesidades individuales del experimento.

  1. Para el cultivo de B. burgdorferi a partir del cual se producirá el fago (el donante), utilice la concentración calculada por cualquiera de los métodos en la etapa 2 para determinar el volumen de cultivo iniciador necesario para producir 4 ml de 2 × 108 espiroquetas·mL−1. Esto producirá una concentración final de 5 × 107 espiroquetas·mL−1 en 15 ml durante la etapa de recuperación (paso 3.6 a continuación).
  2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 3.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 4 ml de BSK fresco. Transfiera la muestra al tubo estéril más pequeño disponible para contener la muestra con un espacio mínimo en la cabeza.
  3. Añadir la cantidad adecuada de agente inductor a la concentración recomendada (Tabla 3) en base a un volumen de cultivo de 4 ml para inducir la producción de fagos. Tapa el tubo herméticamente y mezcla bien.
  4. Incubar la muestra a 33 °C durante 2-4 h.
  5. Después de la incubación, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar la muestra a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante.
  6. Resuspender el pellet celular en 15 mL de 1x BSK.
    NOTA: Después de la inducción del fago, hay dos formas diferentes de proceder con el ensayo de transducción. Estos métodos se presentan en la Figura 1 y en los pasos 4 y 6.

4. Transducción durante el cocultivo después de la exposición del donante al agente inductor (Figura 1A)

NOTA: Este protocolo solo se puede usar cuando la cepa productora de fagos (donante) tiene resistencia a un antibiótico en particular y la cepa a transducir (receptor) tiene resistencia a otro antibiótico.

  1. Preparar un cultivo de B. burgdorferi para ser utilizado como receptor en los ensayos de transducción, como se describe para la cepa donante en el paso 1 anterior. Sobre la base de la densidad determinada como en el paso 2, calcular el volumen necesario para producir 15 ml de 1 × 107 espiroquetas·mL−1.
  2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 4.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante.
  3. Resuspender el pellet en 1 mL de cultivo a partir del paso 3.6 (donante de fagos resuspendido). Agregue el receptor resuspendido nuevamente a la cultura con el donante. No suplementar con antibióticos. El volumen total que contiene ambos cultivos es de 15 mL.
  4. Incubar a 33 °C durante 72-96 h.
  5. Realizar la selección de transductores mediante recubrimiento en fase sólida después del cocultivo como se describe en el paso 7.

5. Precipitación de polietilenglicol (PEG) para recuperar fagos para su uso en ensayos de transducción

NOTA: Este protocolo se puede utilizar en los casos en que la cepa productora de fagos (donante) tiene resistencia a un antibiótico en particular y la cepa a transducir (receptor) no tiene resistencia a los antibióticos o resistencia a otro antibiótico.

  1. Complementar el cultivo del paso 3.6 con el antibiótico adecuado a la concentración indicada en la Tabla 2. Incubar la muestra a 33 °C durante 72-96 h.
  2. Preparar soluciones para la precipitación de PEG.
    1. Preparar 500 mL de NaCl 5 m. Esterilizar en autoclave y dejar enfriar antes de usar. Conservar a temperatura ambiente.
    2. Preparar 500 mL de PEG al 40% disolviendo 200 g de PEG8000 en 400 mL de agua; Calentar suavemente mientras se remueve hasta que la solución esté bien mezclada. Llevar el volumen hasta 500 mL con agua. Para disolver completamente el PEG8000 y esterilizar la solución, esterilice en autoclave la solución y enfríe antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente.
    3. Preparar 100 ml de medio de suspensión (SM; 100 mM NaCl, 10 mMMgSO4 y 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). Esterilizar en autoclave. Conservar a 4 °C.
  3. Para la precipitación PEG del fago del clon donante de B. burgdorferi (a partir del paso 3.6), después de 72-96 h de incubación, centrifugar las muestras a 8.000 x g durante 20 min a 4 °C.
  4. Decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 ml; Deseche el pellet celular. Añadir 5 M de NaCl a una concentración final de 1 M. Mezclar bien. Mece suavemente a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Centrifugar las muestras a 8.000 g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 ml; El pellet puede ser pequeño o estar ausente. Agregue una solución de PEG8000 al sobrenadante al 40% hasta una concentración final del 10%. Mezclar bien y poner en hielo durante más de 1 h hasta toda la noche.
    NOTA: Los tiempos más largos no parecen correlacionarse con un aumento significativo de la recuperación de fagos.
  6. Centrifugar las muestras a 8.000 x g durante 20 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y elimine la mayor cantidad de líquido en exceso posible sin perder ningún pellet, que contiene las partículas del fago.
  7. Resuspenda el pellet en un volumen mínimo de SM, usando el SM para lavar el costado de la botella y recoger cualquier partícula potencial de fagos. La proporción recomendada es de 400 μL de SM por 10 ml de sobrenadante original, pero dependiendo del tamaño del pellet, se puede requerir más o menos SM para la resuspensión completa.
  8. Tratar la muestra de fagos recuperados con un volumen igual de cloroformo basado en el volumen de resuspensión. Mezclar bien la muestra y luego centrifugar a 8.000 x g durante 10 min. Retire la capa acuosa (superior) a un tubo limpio, evitando cualquiera de las capas gruesas de la interfaz.
    NOTA: φBB-1 es un bacteriófago sin envoltura y no es susceptible al tratamiento con cloroformo25. Este paso se realiza para interrumpir aún más cualquier estructura unida a la membrana (es decir, células o ampollas) y para matar cualquier contaminante celular potencial. El cloroformo es un orgánico volátil y debe usarse solo en una campana extractora bien ventilada; Desechar el material que contenga cloroformo como residuo orgánico.
  9. Determinar el volumen recuperado después del primer tratamiento con cloroformo y tratar la muestra de nuevo con una cantidad de cloroformo igual al 10% de ese volumen. Mezclar bien y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min. Retire la capa acuosa (superior), teniendo cuidado de evitar cualquiera de la interfaz o capa orgánica. Transfiera la capa acuosa a un tubo limpio.
  10. Utilizar el fago inmediatamente (como se describe en el paso 6) o conservar a 4 °C.
    NOTA: No se recomienda la congelación de muestras de fagos φBB-1. Aunque la estabilidad de φBB-1 a 4 °C no se ha investigado rigurosamente, las muestras almacenadas a 4 °C hasta 1 mes después de la recuperación se han utilizado con éxito en ensayos de transducción.

6. Ensayo de transducción después de la precipitación de PEG de φBB-1 (Figura 1B)

  1. Preparar cultivos de B. burgdorferi para ser utilizados como receptor en ensayos de transducción, como se describe para la cepa donante en el paso 1 anterior. Sobre la base de la densidad determinada como en el paso 2, calcular el volumen de cultivo del receptor necesario para producir 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1.
  2. Centrifugar el volumen de cultivo calculado en el paso 6.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 14,5 ml de BSK fresco.
  3. Añadir ≤500 μL de muestra de fagos precipitados con PEG (a partir del paso 5) al cultivo del clon receptor. Mezclar bien e incubar a 33 °C durante 72-96 h.
    NOTA: La cantidad de fagos recuperados durante la precipitación de PEG puede ser variable, dependiendo de una serie de factores. Sin embargo, a partir de un cultivo de 15 ml de la cepa inducida de B. burgdorferi CA-11.2A, 500 μL contienen típicamente 50-1,000 fagosviables 28. Los volúmenes de recuperación de fagos ≥500 μL afectan negativamente el crecimiento de B. burgdorferi , probablemente debido al aumento de la proporción de SM a BSK.
  4. Realizar la selección de transductores mediante recubrimiento en fase sólida después de mezclarlos con fagos precipitados con PEG como se describe en el paso 7.

7. Selección de transductores

NOTA: El recubrimiento en fase sólida de los transductores potenciales se realiza utilizando una modificación de una sola capa del protocolo descrito por primera vez por Samuels15. Las colonias de B. burgdorferi crecen dentro del agar, por lo que para la selección de transductores por recubrimiento en fase sólida, las muestras deben agregarse al medio mientras se vierten las placas. Un método alternativo para la selección de transformadores utilizando un método de dilución en placas de 96 pocillos también se ha descrito anteriormente35. Esta técnica también podría ser efectiva para la selección de transductores, pero aún no se ha probado para este propósito.

  1. Determine el número de placas necesarias para la selección de transductores en función del número de muestras de los ensayos de transducción y los controles que se van a platear.
    NOTA: Normalmente, se vierten dos placas por muestra, una equivalente a aproximadamente el 10% del volumen de cultivo y otra que incluye el resto del cultivo. Además, vierta las placas que sirven como controles negativos para probar individualmente que la preparación de fagos y / o los clones parentales utilizados como donante y receptor no crecen en presencia de los antibióticos utilizados durante la selección. También se recomienda preparar el material de recubrimiento para al menos dos placas adicionales. Por ejemplo, si el número de muestras y controles a emplatar es ocho, prepare suficiente mezcla de recubrimiento para 10 placas.
  2. Prepare soluciones para el recubrimiento como se describe a continuación.
    NOTA: Cada placa será de 30 mL, compuesta por 20 mL de BSK 1.5x para recubrimiento y 10 mL de agarosa al 2.1% (relación 2:1). Esto producirá una placa con concentraciones finales de 1x BSK y 0,7% de agarosa. Por ejemplo, para 10 placas, prepare una mezcla de recubrimiento total de 300 ml, que consista en 200 ml de BSK 1.5x y 100 ml de agarosa al 2.1%.
    1. Prepare 1 L de 1.5x BSK como se describe para 1x BSK en el paso 1.1 usando las cantidades de cada componente enumeradas para 1.5x BSK en la Tabla 1. Almacene como se describe para 1x BSK.
    2. Preparar agarosa al 2,1% en agua y autoclave. Use la solución de agarosa fresca o guárdela a temperatura ambiente. Si se almacena a temperatura ambiente, microondas con la tapa suelta hasta que esté completamente fundido antes de emplatar.
    3. Determinar el volumen de antibiótico(s) necesario(s) para alcanzar la concentración adecuada (Tabla 2) en función de toda la mezcla de recubrimiento.
      NOTA: Si el volumen total de la solución de recubrimiento final es de 300 ml, mezcle 200 ml de BSK 1.5x y suficiente antibiótico para asegurar que los 300 ml completos tengan la concentración final correcta de antibióticos. Si tanto el donante como el receptor en el ensayo de transducción tienen diferentes genes de resistencia a los antibióticos, la mezcla de recubrimiento debe contener ambos antibióticos. Si el fago precipitado por PEG del donante (como se preparó en el paso 5) codifica un marcador de resistencia a los antibióticos y el receptor no tiene ninguno, la mezcla de recubrimiento debe contener solo un antibiótico.
  3. Según el número de placas que se verterán, transfiera la cantidad apropiada de 1.5x BSK y antibiótico(s) a una botella estéril lo suficientemente grande como para contener toda la mezcla de chapado. Equilibrar en un baño maría a 56 °C durante ≥15 min.
  4. Equilibrar la agarosa fundida del autoclave o microondas en un baño maría a 56 °C durante ≥15 min.
  5. Después del equilibrio, añadir la cantidad determinada de agarosa al 2,1% a la botella con el BSK 1,5x (con antibiótico) y volver a poner la solución de recubrimiento en el baño maría a 42 °C durante 10-15 min.
    NOTA: Las temperaturas más altas pueden dañar o matar las espiroquetas36. Si utiliza el mismo baño de agua que el anterior, enfríe el baño de agua a 42-45 °C antes de iniciar el temporizador para el equilibrio. No deje que la solución de recubrimiento se equilibre a 42 °C durante más de 20 minutos o comenzará a solidificarse mientras vierte las placas.
  6. Durante el equilibrio, prepare las muestras de B. burgdorferi para ser plateadas. Transfiera la cantidad a chapar a un tubo centrífugo cónico estéril de 50 ml (consulte la Tabla de materiales).
    1. Si se coloca una cantidad inferior a 1,5 ml (<5% del volumen final de la placa de 30 ml), transfiera la muestra al nuevo tubo y agregue la mezcla de recubrimiento directamente a la muestra durante el recubrimiento.
    2. Para volúmenes mayores, transfiera el volumen deseado de cultivo al nuevo tubo y luego centrifugar a 6.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Decantar todo menos 100-500 μL del sobrenadante y utilizar el resto para resuspender el pellet completamente antes del chapado.
    3. Para las placas de control después del cocultivo, añadir ≥107 células de los clones donantes o receptores a tubos centrífugos cónicos estériles de 50 ml. Si el volumen es superior a 1,5 ml, centrifugar y resuspender el pellet como en el paso 7.6.2. Si se realizó un ensayo de transducción utilizando el fago precipitado con PEG, además del clon receptor, agregue 100-250 μL de la muestra de fagos en un tubo cónico estéril de 50 ml para el recubrimiento.
  7. Después de que la solución de recubrimiento se haya equilibrado a 42-45 °C durante 10-15 min, transferir 30 ml de la solución de recubrimiento a un tubo con la muestra adecuada; Inmediatamente dispense la mezcla de recubrimiento y la muestra en una placa etiquetada. Repita con una pipeta nueva para cada muestra a emplatar.
  8. Deje que las placas se solidifiquen durante 15-20 min y luego colóquelas en una incubadora a 33 °C suplementada con 5% deCO2. No invierta las placas durante al menos 48 h después de verterlas.
  9. Dependiendo de los antecedentes del clon receptor, verifique que las colonias aparezcan dentro de la agarosa en las placas de selección después de 10-21 días de incubación. Escoja al menos 5-10 colonias que crezcan en la placa en presencia de ambos antibióticos usando una pipeta de borosilicato 5.75 esterilizada con tapones de algodón (ver Tabla de materiales) e indíquelas en 1.5 ml de 1x BSK con los antibióticos apropiados.
  10. Cultivar las colonias inoculadas a 33 °C como en el paso 1.3 durante 3-5 días o hasta que alcancen una densidad de aproximadamente 20-40 espiroquetas por campo con un aumento de 200x utilizando microscopía de campo oscuro.
    NOTA: Una vez tamizadas (ver paso 8), las espiroquetas pueden congelarse para su almacenamiento a largo plazo a −80 °C mezclando un volumen igual de cultivo con una mezcla de 60% de glicerol y 40% 1x BSK esterilizado por filtración a través de un filtro de 0,22 μm.

8. Verificación de posibles transductores

NOTA: Examine los clones que crecen en placas en presencia de dos antibióticos para verificar que representan transductores verdaderos en el fondo anticipado (receptor). Estos métodos se basan en la amplificación, y potencialmente secuenciación, de regiones específicas por la reacción en cadena de la polimerasa. Los protocolos y prácticas detallados para realizar PCR en B. burgdorferi se describen en otra parte (para un ejemplo reciente, ver Seshu et al.37). Seleccione los cebadores utilizados para cribar los transductores en función de las cepas utilizadas. A continuación se describen algunas sugerencias sobre cómo abordar la detección de los transductores.

  1. Prepare los lisados de B. burgdorferi para la detección por PCR.
    NOTA: El siguiente protocolo se utiliza para producir lisados de B. burgdorferi lavados a partir de células cultivadas cultivadas como en el paso 7.9 para el análisis inmediato del ADN por PCR. Este método está diseñado para minimizar la interferencia de inhibidores potenciales en BSK, pero no se recomienda para producir ADN de alta calidad para secuenciación o almacenamiento. Para ello, utilice un protocolo o kit para la extracción total del genoma (véase la Tabla de materiales). Se recomienda encarecidamente que los lisados de los clones parentales (tanto las cepas donantes como las receptoras) también se preparen al mismo tiempo para incluirlos en cada análisis.
    1. Transfiera 500 μL de cada transductor potencial seleccionado y cultivado como en el paso 7.10 a un tubo de microcentrífuga limpio.
    2. Centrifugar los cultivos durante 10 min a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    3. Retirar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 500 μL de TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifugar durante 5 min a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en 50 μL de agua con calidad de PCR. Hervir las muestras durante 10 min. Dejar enfriar brevemente, y luego centrifugar a 8.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    5. Para cada PCR, utilizar inmediatamente 2 μL de la parte superior de la muestra centrifugada; Evite molestar el pellet.
  2. Examinar los transductores potenciales para los genes específicos que codifican la resistencia a los antibióticos mediante PCR. Consulte la Tabla 4 para los cebadores para la detección de marcadores de resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en los ensayos de transducción.
    NOTA: Aunque es raro en nuestra experiencia, puede ocurrir una mutación espontánea a los antibióticos aminoglucósidos utilizados para la selección de ADN heterólogo en B. burgdorferi.
  3. Examine los transductores potenciales también utilizando otro marcador de cepa o clon para confirmar que el fondo es el del receptor. Incluya tanto el donante como el padre receptor en estos análisis. Detectar marcadores específicos de la cepa utilizando secuencias basadas en las cepas utilizadas y protocolos de laboratorio individuales para determinar la integridad de la cepa.
  4. Si intenta transducir en clones virulentos para su uso dentro del vector garrapata o huésped mamífero o para la comparación directa con otro clon, determine el contenido completo de plásmidos de los transductores y los clones originales. Esto se hace para asegurar el mismo contenido de plásmidos que el de la cepa comparativa o la presencia de los elementos genéticos necesarios para la propagación dentro del ciclo enzoótico, como se describe en otra parte 18,19,37,38,39.

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Representative Results

El uso de bacteriófagos para mover ADN entre cepas o clones de B. burgdorferi más fácilmente transformables que son recalcitrantes a la electrotransformación representa otra herramienta para la investigación molecular continua de los determinantes de la enfermedad de Lyme. El ensayo de transducción descrito en este documento puede modificarse según sea necesario para facilitar el movimiento de ADN entre cualquier clon de interés utilizando uno o dos antibióticos para la selección de posibles transductores. Se ha demostrado previamente la transducción tanto del ADN del profago como de vectores heterólogos lanzadera de E. coli/B. burgdorferi entre un clon de la cepa de paso alto CA-11.2A y tanto un clon de la cepa B31 de paso alto como un clon virulento de paso bajo de la cepa 29728. Los resultados presentados a continuación demuestran el movimiento del ADN del profago entre dos clones avirulentos de paso alto. El clon donante, c1673, es un clon de la cepa CA-11.2A de B. burgdorferi que codifica un gen de resistencia a la kanamicina en el ADN del profago27,28. El receptor es un clon de B. burgdorferi cepa B31, designada c1706, que codifica un marcador de resistencia a la gentamicina en el cromosoma28. El ensayo de transducción se realizó como se ilustra en la Figura 1B; El fago precipitado por PEG recuperado de los sobrenadantes de c1673 expuestos al 5% de etanol se mezcló con c1706 como se describe en el paso 6 del protocolo.

Después de mezclar aproximadamente el 20% del fago recuperado por precipitación de PEG de los sobrenadantes de c1673 expuesto al etanol (que codifica la resistencia a la kanamicina) con c1706 (que codifica la resistencia a la gentamicina), la mezcla se colocó en presencia de ambos antibióticos; Las unidades formadoras de colonias (UFC) que pueden crecer en presencia de kanamicina y gentamicina son indicativas de eventos de transducción (Figura 2)27,28. El número de UFC se informa como la frecuencia de transducción por célula receptora inicial. En este experimento representativo, se recuperaron aproximadamente 275 transductores después de la incubación del fago con 1 × 107 células receptoras, lo que arrojó una frecuencia de transducción de 2,75 × 10−5 UFC por célula receptora.

Tras la recuperación de los transductores potenciales, se realizó la amplificación por PCR de los genes que codifican la resistencia a kanamicina y gentamicina en 10 de los clones, con dos muestras representativas mostradas en la Figura 3. El gen de resistencia a la kanamicina podría ser amplificado por el donante (c1673) y los transductores potenciales, pero no por los receptores (c1706). Del mismo modo, el gen de resistencia a la gentamicina podría amplificarse desde el receptor (c1706) y los transductores potenciales, pero no desde el donante. Por lo tanto, los clones recuperados codifican específicamente ambos genes de resistencia a los antibióticos y representan eventos de transducción, no mutantes espontáneos.

Para demostrar que el casete de resistencia a la kanamicina fue transducido por φBB-1 del donante al receptor, se determinó el fondo de los transductores utilizando marcadores específicos de la cepa, como se describió anteriormente28. Esto es particularmente importante si los transductores han sido generados por el método de cocultivo de transducción. Brevemente, se utilizaron cebadores28 publicados anteriormente para amplificar regiones específicas de varios plásmidos borreliales, generando un perfil que puede usarse para identificar el fondo del clon (Figura 4). El clon c1673 en el fondo CA-11.2A codifica amplicones específicos 4, 5 y 6, mientras que c1706, que tiene un fondo B31 de paso alto, no lo hace. Del mismo modo, a los dos transductores les faltan los amplicones 4, 5 y 6; Por lo tanto, estos clones tienen el fondo C1706 y han adquirido el gen de resistencia a la kanamicina de C1673.

Componente 1x BSK (para cultivo) (1 L) 1,5x BSK (para chapado) (1 L)
Albúmina sérica bovina (fracción V) 35 g 52,5 g
10x CMRL-1066 (sin L-glutamina) 8 g 12 g
Neopeptona 4 g 6 g
levadura 1,6 g 2,4 g
HEPES 4,8 g 7,2 g
Glucosa 4 g 6 g
Citrato de sodio 0,56 g 0,84 g
Piruvato de sodio 0,64 g 0,96 g
N-acetil-glucosamina 0,32 g 0,48 g
Bicarbonato de sodio 1,76 g 2,64 g
Suero de conejo normal inactivado por calor (INRS) 66 ml 99 ml

Tabla 1: BSK para el cultivo y selección de clones de B. burgdorferi para ensayos de transducción. La formulación y preparación de 1x BSK para el cultivo de B. burgdorferi y 1.5x BSK para la selección en fase sólida de clones de B. burgdorferi descritos aquí se basan en Samuels15. Las diferentes formulaciones de BSK (o MKP)37,40,41 que apoyan el crecimiento de B. burgdorferi aún no se han probado utilizando el ensayo de transducción.

Antibiótico Concentración de existencias Concentración final en cultivo de Bb
Kanamicina 100 mg.mL-1 (en agua) 200-400 μ g.mL-1
Gentamicina 50 mg.mL-1 (en agua) 50 μ g.mL-1
Estreptomicina 50 mg.mL-1 (en agua) 50 μ g.mL-1
Eritromicina 2 mg.mL-1 (en EtOH) 0,06 μ g.mL-1

Tabla 2: Antibióticos potenciales y concentraciones a utilizar para la selección y mantenimiento del ADN heterólogo en B. burgdorferi. Esta lista se basa en los marcadores actuales resistentes a los antibióticos comúnmente utilizados en Borrelia burgdorferi42,43,44,45. La kanamicina, la gentamicina y la estreptomicina se preparan en agua, se esterilizan por filtración a través de un filtro de 0,22 μM y se almacenan a -20 °C. La eritromicina se prepara en etanol al 95% y se almacena a -20 °C. Muchos laboratorios reportan el uso exitoso de kanamicina para la selección a una concentración de 200 μg·mL−1; cuando se utiliza gentamicina y kanamicina para la selección en ensayos de transducción, se utiliza 400 μg·mL−1 kanamicina. El gen aadA confiere resistencia tanto a la estreptomicina como a la espectinomicina44. Para la selección de constructos que contengan el gen aadA en E. coli, se utiliza espectinomicina de 100 μg·mL−1. Tenga en cuenta que los aminoglucósidos (kanamicina, gentamicina y estreptomicina) no son clínicamente relevantes en el tratamiento de la enfermedad de Lyme; Sin embargo, la eritromicina se utiliza clínicamente en ciertas situaciones46. Aunque la resistencia natural a este antibiótico en B. burgdorferi ha sido reportada47, este marcador de resistencia no ha sido utilizado hasta ahora en los ensayos de transducción reportados aquí.

Agente inductor Concentración de existencias (disolvente) Concentración final en la muestra
Etanol 100% (ninguno) 5%
Mitomicina C 2 mg.mL-1 (agua) 20 μ g.mL-1
1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

Tabla 3: Potenciales agentes inductores y concentraciones utilizadas para la inducción de φBB-1 de B. burgdorferi. Se ha demostrado que la N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), la mitomicina C y el etanol, así como el metanol y el isopropanol, inducen φBB-1 por encima de los niveles constitutivos en la cepa CA.11-2A25,26,28 de B. burgdorferi. Se sospecha que el MNNG es un carcinógeno y un peligro ambiental; Usar con precaución, disolver en un disolvente combustible e incinerar para su eliminación. La mitomicina C es un presunto carcinógeno y un peligro ambiental potencial; Usar con precaución debajo de una campana extractora de humos químicos y desechar adecuadamente. Si bien los datos publicados sugieren que el MNNG es el agente más eficaz para inducir φBB-126, los peligros de trabajar con este producto químico y las dificultades para adquirirlo complican su uso48, particularmente con los estudiantes. La inducción con etanol es consistentemente mejor que con metanol o isopropanol28 y se ha utilizado más comúnmente en el ensayo de transducción.

Nombre o designación del gen Resistencia a los antibióticos Referencia Nombre de la cartilla Secuencia de cebador (5 ́ a 3 ́)
kanR desde Tn903 kanamicina 42 kanR 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
kanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 gentamicina 43 aacC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
aadA estreptomicina 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

Tabla 4: Cebadores utilizados para el análisis preliminar de transducción de marcadores de resistencia a antibióticos. Los cebadores indicados aquí son para la detección de genes de resistencia a antibióticos comúnmente utilizados en ensayos de transducción. Estos cebadores se utilizan en PCR con las siguientes condiciones repetidas durante 28 ciclos: desnaturalización a 92 °C durante 15 s, recocido de cebador a 56 °C durante 15 s y extensión del ADN objetivo a 72 °C durante 30 s.

Figure 1
Figura 1: Ensayo de transducción para monitorear el movimiento mediado por fagos (transducción) del ADN. El ensayo de transducción se puede realizar utilizando (A) el método de cocultivo o (B) fago recuperado del sobrenadante de cultivo por precipitación PEG. Para el método de cocultivo (A), un clon inducido de B. burgdorferi (el donante) que codifica un gen de resistencia a antibióticos en el ADN que debe ser transducido por φBB-1 (círculo verde) se cultiva con un clon no inducido de B. burgdorferi (el receptor), que codifica un segundo gen de resistencia a antibióticos en el cromosoma u otro elemento genético estable (círculo rojo). Este método requiere el uso de dos marcadores diferentes de resistencia a los antibióticos (en este ejemplo, los genes que codifican la resistencia a la kanamicina y la gentamicina). Para utilizar el fago purificado en el ensayo de transducción (B), las partículas de fagos recuperadas por la precipitación PEG del sobrenadante del donante inducido se mezclan con el receptor. Si bien se muestra aquí usando dos antibióticos diferentes, este método se puede realizar con el uso de un solo marcador de resistencia a los antibióticos codificado en el ADN del profago φBB-1, como se demostró anteriormente27. Después de la incubación, los transductores se seleccionan mediante recubrimiento en fase sólida en presencia de ambos antibióticos; si el método B se utiliza con un solo marcador de resistencia a los antibióticos codificado en el ADN del fago, entonces la selección se realiza utilizando solo ese antibiótico durante el recubrimiento en fase sólida. Los transductores contendrán marcadores de resistencia a los antibióticos y tendrán los antecedentes del receptor. Esta cifra se reproduce de Eggers et al.28 con el permiso de Oxford University Press. En el experimento modelado, c1673 y c1650 representan dos clones CA-11.2A diferentes; c1673 lleva un profago φBB-1 que codifica resistencia a la kanamicina, y c1650 codifica un marcador de resistencia a la gentamicina en una ubicación no fágica28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Unidades formadoras de colonias seleccionadas por recubrimiento en fase sólida después del ensayo de transducción. Las colonias que crecen en presencia de ambos antibióticos después de la mezcla del fago de c1673 con c1706 representan transductores potenciales. No deben crecer colonias en placas de control que contengan los clones individuales del donante y del receptor o en una muestra de preparación de fagos (no se muestra). El número mínimo de fagos productivos en la muestra original puede determinarse contando el número de UFC y multiplicando por el factor de dilución. En este caso, el 20% de la muestra de fagos PEG precipitada a partir de un cultivo de 15 mL del donante produjo aproximadamente 275 colonias. Así, la concentración original de fago productivo recuperado por precipitación de PEG fue de ≥1,3 × 103 viriones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Amplificación por PCR de los genes que confieren resistencia a kanamicina y resistencia a gentamicina a partir de dos transductores potenciales. Se realizó PCR con cebadores para los genes de resistencia a kanamicina y gentamicina (Tabla 4) para cribar los lisados generados a partir de dos colonias (transductante 1 y transductor 2). Estas colonias se seleccionaron en una placa que contenía kanamicina y gentamicina después de la mezcla de c1673 (donante) y c1706 (receptor). Los amplicones se resolvieron en un gel de agarosa al 1% electroforesado durante 60 min a 120 V en 1x tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) y teñido con bromuro de etidio de 0,5 μg·mL−1 . Los números indican marcadores de tamaño en pares de kilobases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Confirmación del fondo de los transductores. Las regiones de elementos genéticos específicos se amplificaron a partir de c1673, c1706, y los dos transductores, como se describió anteriormente28, para confirmar que el fondo de los transductores era el del clon receptor, c1706. Las regiones elegidas se basaron en las secuencias de genes sobre plásmidos lineales o circulares específicos (lp o cp, respectivamente) dentro de la cepa tipo B. burgdorferi , B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) y 8 = gen fla (cromosoma). Los amplicones se resolvieron en un gel de agarosa al 1% electroforesado durante 60 min a 120 V en 1x tampón TAE y teñido con bromuro de etidio de 0,5 μg·mL−1 . Los números indican marcadores de tamaño en pares de kilobases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El uso de la transducción podría representar un método para superar al menos algunas de las barreras biológicas y técnicas asociadas con la electrotransformación de B. burgdorferi 1,4,13,37. En muchos sistemas, el bacteriófago puede mover el ADN del huésped (no profago) entre las células bacterianas mediante transducción generalizada o especializada 22,23,24,49,50. En la transducción especializada, algunos genes del huésped siempre están empaquetados dentro de la cápside del fago junto con el ADN del profago49,50. Por ejemplo, φBB-1 siempre empaqueta aquellas porciones del cp32 que son de origen bacteriano, porque están inextricablemente unidas en el plásmido a las porciones del cp32 que son el genoma del fago. En la transducción generalizada, se cree que el mecanismo de empaquetamiento del bacteriófago se adhiere a secuencias homólogas no fágicas y empaqueta "accidentalmente" ADN del huésped aleatorio en lugar de ADN de fagos; estos trozos de ADN son entonces capaces de ser introducidos en otra célula49,50. Poco se sabe todavía acerca de la transducción generalizada por fagos en B. burgdorferi; sin embargo, en sistemas bacterianos mejor caracterizados, hasta el 1% del bacteriófago liberado por una célula puede contener genes bacterianos aleatorios en lugar de ADN del fago51. Hasta ahora, no se han observado marcadores cromosómicos transducidos entre diferentes clones de B. burgdorferi, pero la demostración previa de que tanto cp32s como pequeños vectores lanzadera heterólogos pueden ser empaquetados y transducidos por φBB-1 indica que este fago puede participar tanto en la transducción especializada como en la generalizada28. Por lo tanto, se propone un caso de uso para la transducción en el laboratorio, en el que la electrotransformación que genera una mutación cromosómica todavía se realiza en el fondo de interés; Sin embargo, la introducción de vectores lanzadera para la complementación en trans o para estudios de expresión utilizando constructos reporteros en cepas recalcitrantes a la electrotransformación podría hacerse mediante transducción entre un clon de paso alto más transformable y cepas menos transformables. Si estudios futuros demuestran la capacidad de φBB-1 para empaquetar y mover loci cromosómicos, entonces los métodos descritos en este documento también podrían resultar útiles para mover ADN cromosómico modificado entre cepas más fácilmente transformables y cepas que de otro modo serían difíciles de electrotransformar. Los plásmidos similares a cp32 son omnipresentes entre todas las cepas de B. burgdorferi y la gran mayoría de las otras enfermedades de Lyme espiroquetas52,53; también hay evidencia de homólogos en otras especies de Borrelia, incluyendo B. mayonii, B. miyamotoi, y aquellos que causan fiebre recurrente54,55,56. Aún no se sabe si los homólogos en otras especies de Borrelia también son profagos, pero si es así, entonces la transducción también podría ser una herramienta para la disección molecular de estas especies, algunas de las cuales aún no han sido manipuladas genéticamente con éxito.

Aquí se han presentado dos métodos para transducir ADN: co-cultivar los clones donante y receptor juntos antes de la selección (Figura 1A) o fago precipitante de PEG del donante y mezclar solo ese fago con el receptor (Figura 1B). El número de eventos de transducción por célula receptora es mayor después del cocultivo que utilizando el fago28 precipitado por PEG, pero el cocultivo requiere que tanto el donante como el receptor lleven diferentes marcadores de resistencia a los antibióticos y que los antecedentes de cualquier transductor potencial se examinen cuidadosamente. Como el profago φBB-1 es ubicuo entre los Borrelia52,53, existe la posibilidad teórica de que, al mezclar clones en crecimiento activo, un marcador de resistencia a los antibióticos u otro ADN heterólogo podría pasar del receptor al donante (en lugar del donante al receptor, como se pretendía). El uso de fagos precipitados con PEG en el ensayo de transducción elimina esta posibilidad, ya que el donante no está presente en la mezcla de fagos / receptores. Además, se requiere la precipitación de PEG del fago si el fago y su contenido genómico se van a utilizar tanto para el análisis (es decir, análisis estructural, cuantificación, identificación de material envasado, etc.) como para la transducción. A pesar de estas ventajas, el uso de fagos precipitados por PEG tiene sus posibles inconvenientes; además de no producir tantos transductores como con el cocultivo, la precipitación de PEG puede llevar mucho tiempo, puede conducir a una pérdida significativa de fagos y da como resultado muestras que tienen contaminantes que pueden interferir con las aplicaciones aguas abajo57,58.

La transducción se ha demostrado a partir de tres cepas de B. burgdorferi hasta el momento: CA-11.2A, un clon B31 de paso alto, y un clon 297 de paso bajo28. De estos tres, la cepa CA-11.2A de B. burgdorferi produce la mayor cantidad de fago después de la inducción25,26,28; sin embargo, incluso después de la inducción, el número de fagos recuperados de B. burgdorferi sigue siendo órdenes de magnitud inferiores al fago recuperado en sistemas mejor caracterizados, como el del colifago λ25,28,59. Por lo tanto, un problema que puede surgir en el uso de la transducción a través del cocultivo o la mezcla de fagos después de la precipitación de PEG es el pequeño número de bacteriófagos que se liberan de B. burgdorferi, incluso cuando se exponen a agentes inductores. Además, la variación de lote a lote en la producción de fagos es significativa, incluso cuando todas las condiciones, componentes de medios y métodos parecen ser consistentes entre los experimentos. Por esta razón, es importante determinar que al menos un número mínimo de fagos se producen a partir de un clon dado o bajo una condición dada. Los ensayos tradicionales para determinar el número de fagos en una muestra requieren mezclar una pequeña cantidad de muestra que contiene fagos con un huésped bacteriano permisivo en el que el bacteriófago es lítico; El número de partículas productivas de fagos en la muestra está determinado por el número de eventos líticos que ocurren en ese fondo, lo que resulta en la formación de placas en un césped de la bacteria60,61. El número de fagos es reportado como unidades formadoras de placa (UFP)61. La cuantificación del número de φBB-1 productivo liberado después de la inducción utilizando un ensayo de placa se ve obstaculizada por la incapacidad de cultivar Borrelia burgdorferi en un césped denso y una falta actual de comprensión de los mecanismos que controlan el cambio entre los ciclos de replicación lisogénica y lítica de φBB-1. De hecho, aunque los informes anecdóticos de cultivos lisados de B. burgdorferi son numerosos, hasta ahora no se han publicado estudios que correlacionen la observación de la lisis de un cultivo completo con la producción de fagos. Por experiencia, sólo un pequeño número de células en un cultivo dado parecen producir espontáneamente fagos, presumiblemente por lisis, y esta producción sólo puede aumentarse modestamente con la exposición a los agentes inductores conocidos25,28,62. Por lo tanto, actualmente no es posible un ensayo de placa para cuantificar φBB-1 de B. burgdorferi.

Para cuantificar el número de fagos productivos producidos después de la inducción de B. burgdorferi, el ensayo de transducción descrito en este informe se puede realizar utilizando un clon permisivo de B. burgdorferi con un antibiótico diferente al empaquetado por el bacteriófago. Este ensayo da como resultado colonias que resultan de la transducción, con cada colonia representando un fago confirmado. Por lo tanto, el número mínimo de fagos en una muestra se puede informar como UFC en lugar de UFP. Este número es probablemente (mucho) menor que el número total real de fagos producidos debido a las ineficiencias inherentes a la recuperación de fagos por precipitación de PEG (si se utiliza), la unión e inyección de ADN por fagos y el recubrimiento en fase sólida de B. burgdorferi.

Un método potencial para determinar la cantidad total de ADN profago dentro de los sobrenadantes de cultivos de B. burgdorferi es la PCR cuantitativa (qPCR), pero los protocolos de qPCR para el ADN cp32 de B. burgdorferi no están bien representados en la literatura, y la qPCR aún no es una metodología ampliamente utilizada para este propósito. Para determinar cualitativamente que hay al menos un nivel moderado de ADN de fagos en una muestra dada, el ADN total puede extraerse de los sobrenadantes precipitados con PEG de los cultivos de B. burgdorferi después del tratamiento con DNasa antes de la extracción; el ADN del fago estará protegido por una cápside de fago intacta25. El ADN recuperado se resuelve en un gel de agarosa y se visualiza con una tinción de ADN; este protocolo típicamente produce una banda débil de 30 kb que representa el ADN lineal empaquetado dentro de la cabeza del fago25. Sobre la base de la sensibilidad de la tinción y la intensidad de la banda de ADN del fago del tamaño correcto en relación con un marcador, el número aproximado de fagos totales recuperados se puede determinar25,27. Una fuerte correlación positiva de los niveles de ADN fago total recuperado del sobrenadante con el número de transductores recuperados después del ensayo de transducción se ha demostrado previamente28.

La elección de las cepas donante y receptora es fundamental para el éxito del uso de la transducción como herramienta molecular. Nuestra comprensión de cp32s como un profago de φBB-1 se complica tanto por la omnipresencia de los cp32s en las espiroquetas de la enfermedad de Lyme52,53 como por el hecho de que una célula individual de B. burgdorferi puede contener múltiples homólogos de estos plásmidos. Todos los cp32 dentro de una célula parecen estar empaquetados dentro de cabezas de fagos en las cepas productoras de fagos que han sido examinadas27. Sin embargo, no está claro si todas las cepas de B. burgdorferi que contienen cp32 pueden producir bacteriófagos, y las cepas deben probarse para esta capacidad antes de su uso. Del mismo modo, no se sabe nada sobre los receptores que permiten que una cepa particular sea transducida por φBB-1, aunque la ubicuidad del plásmido profago en todo el género sugiere una alta probabilidad de que una cepa particular pueda ser transducida. Como podría inferirse de la presencia de múltiples plásmidos cp32 dentro de una célula individual de B. burgdorferi, no parece haber ninguna inmunidad fágica63 conferida por la presencia de un profago existente; Las cepas CA.11-2A, B31 y 297 se han utilizado en ensayos de transducción y ambas producen y pueden ser transducidas por φBB-127,28. Si bien informes anteriores indicaron que la transducción era posible solo en un número limitado de cepas utilizando el fago27 precipitado por PEG, eso puede deberse a dificultades técnicas con ese método, ya que todas las cepas probadas hasta la fecha han sido transducibles con éxito utilizando el método de cocultivo28.

Al diseñar un experimento para usar el ensayo de transducción, las principales consideraciones para la elección de la cepa donante deben ser los antecedentes genéticos, su capacidad para transformarse fácilmente a través de la electroporación y su capacidad para producir fagos. Aunque no se ha realizado un estudio exhaustivo de los clones de alto paso de cada cepa, la cepa CA-11.2A produce fagos constitutivamente a niveles detectables incluso en ausencia de inducción. Del mismo modo, los clones de alto paso de B31, la primera cepa de B. burgdorferi que se secuenció completamente5 y una cepa comúnmente utilizada en estudios moleculares, también producen constitutivamente cantidades detectables de φBB-1 y son generalmente altamente transformables 1,4,25,27,37,64 . Si las investigaciones requieren otras cepas, se recomienda que los clones de alto paso de esa cepa se prueben primero para determinar su transformabilidad introduciendo un plásmido que contenga un marcador de resistencia a los antibióticos mediante electroporación y luego se evalúe su capacidad para ser transducidos mediante la realización de un ensayo de transducción con un receptor permisivo, como CA-11.2A o B31, que codifica un marcador de resistencia a antibióticos diferente. Del mismo modo, para garantizar que una cepa o clon receptor sea permisivo a la transducción, una cepa productora de fagos, como CA-11.2A que lleva un profago que codifica resistencia a un antibiótico, se puede mezclar con el clon de interés para garantizar que se produzca la transducción.

Queda mucho por entender sobre la biología molecular de φBB-1 y su papel en HGT dentro de B. burgdorferi, particularmente a medida que transita el ciclo enzoótico. La capacidad de φBB-1 para transducir experimentalmente tanto fagos como ADN heterólogo dentro del laboratorio, sin embargo, presenta una oportunidad para agregar otra herramienta para la disección molecular de B. burgdorferi y su papel en la patogénesis de la enfermedad de Lyme.

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Disclosures

El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

El autor desea agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels y Patrick Secor por su útil discusión y a Vareeon (Pam) Chonweerawong por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencias Biomédicas y becas de investigación de la facultad a Christian H. Eggers de la Escuela de Ciencias de la Salud de la Universidad de Quinnipiac.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

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Inmunología e infección Número 187 Borrelia burgdorferi bacteriófago transferencia horizontal de genes transducción
Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta <em>Borrelia burgdorferi</em>
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Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

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