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Medicine

Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei mechanisch belüfteten Ferkeln

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) ist der ideale Marker zur Beurteilung der Nierenfunktion. Die Standardmessmethode mit Inulininjektion mit serieller Blut- und Urinanalyse ist jedoch nicht praktikabel. Dieser Artikel beschreibt eine praktische Methode zur transdermalen Messung der GFR bei Ferkeln.

Abstract

Die transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) wurde verwendet, um die Nierenfunktion bei bewussten Tieren zu bewerten. Diese Technik ist bei Nagetieren gut etabliert, um akute Nierenschäden und chronische Nierenerkrankungen zu untersuchen. Die GFR-Messung mit dem transdermalen System wurde jedoch bei Schweinen, einer Spezies mit einem ähnlichen Nierensystem wie der Mensch, nicht validiert. Daher untersuchten wir die Wirkung der Sepsis auf die transdermale GFR bei anästhesierten und mechanisch beatmeten Neugeborenenschweinen. Die polymikrobielle Sepsis wurde durch Ligatur und Punktion (CLP) induziert. Das transdermale GFR-Messsystem, bestehend aus einem miniaturisierten Fluoreszenzsensor, wurde auf der rasierten Haut des Schweins angebracht, um die Clearance von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) konjugiertem Sinistrin, einem intravenös injizierten GFR-Tracer, zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 12 h nach CLP das Serumkreatinin mit einer Abnahme der GFR anstieg. Diese Studie zeigt zum ersten Mal den Nutzen des transdermalen GFR-Ansatzes bei der Bestimmung der Nierenfunktion bei mechanisch beatmeten neonatalen Schweinen.

Introduction

Eine praktische und quantitative Bewertung der Nierenfunktion ist die Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR), die anhand des Clearance-Prinzips1 angibt, wie gut die Nieren Blut filtern. Eine frühere Methode zur Messung der GFR beinhaltet die intravenöse Injektion exogener Verbindungen wie Inulin oder Sinistrin, wobei serielle Messungen der Plasma-/Harnspiegel durchgeführt werden, um deren Clearance zu erkennen 2,3. Diese Methode ist umständlich und erfordert die serielle Sammlung von Plasma- und Urinproben4. Eine Alternative ist die Messung körpereigener Stoffwechselendprodukte wie Kreatinin. Dies ist jedoch zeitaufwendig und manchmal ungenau, da es nicht nur vom Glomerulus, sondern auch von denTubuli 5,6 abgesondert wird. Darüber hinaus wird der Kreatininspiegel durch Geschlecht, Alter, Ernährung und Muskelmasse beeinflusst 7,8,9.

Ein genaueres, minimalinvasives und weit verbreitetes Maß für GFR ist die Verwendung von transdermalen GFR-Monitoren, die die Echtzeit-GFR bei Tieren messen 4,10. Sinistrin, ein hochlöslicher und frei filtrierter exogener Nierenmarker, ist mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiert. Diese konjugierte Verbindung wird intravenös injiziert, und die Nierenfunktion in Echtzeit kann ohne Blut- und Urinproben beurteilt werden11. Die Verwendung der transdermalen GFR-Messung wurde bei Nagetieren 12, Hunden13 und Katzen14 validiert, jedoch nicht bei Schweinen.

Schweinearten teilen mehrere anatomische und physiologische Merkmale mit dem Menschen, was sie zu idealen Tieren für die Untersuchung verschiedener menschlicher Krankheiten macht15. Die Verwendung von Schweinen in der translationalen biomedizinischen Forschung ist zunehmend populär geworden und wird gegenüber Nagetiermodellen bevorzugt, da sie die menschliche Physiologie und Pathophysiologie nachahmt16. Neugeborene Schweine sind von Interesse, um die Mechanismen von Krankheiten zu verstehen, die für pädiatrische Patienten einzigartig sind17. Darüber hinaus drängen die jüngsten Fortschritte bei der Transplantation von Schweinen auf menschliche Organe, die diagnostischen Instrumente für präklinische und klinische Studien zu erweitern 18,19,20,21. Dieses Papier bietet zum ersten Mal einen Leitfaden für die Verwendung des transdermalen Geräts bei der Messung der GFR bei Neugeborenenschweinen.

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Protocol

Die Verfahren sind nach nationalen Standards für die Pflege und Verwendung von Labortieren geschrieben und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) genehmigt.

HINWEIS: Ferkel in der Versuchsgruppe werden einer Stuhlligatur und Punktion unterzogen, während die Scheingruppe nur eine Öffnung des Abdomens ohne Stuhlligatur oder Punktion erfährt. Ferkel beider Gruppen werden 12 Stunden nach dem Eingriff unter Narkose gehalten, um genügend Zeit für Sepsis und akute Nierenschädigung (AKI) in der Versuchsgruppe zu haben. Die transdermale GFR-Messung erfolgt 8 h nach dem Eingriff für insgesamt 12 h.

1. Ferkelversorgung und -haltung

  1. Identifizieren Sie eine lokale Schweinefarm, die neonatale Ferkel im Alter von 3-5 Tagen versorgen kann. Planen Sie die Lieferung Anfang der Woche, um das Experiment abzuschließen, bevor Ferkel älter als 7 Tage sind.
    HINWEIS: Der Lieferant stellte montags drei bis fünf Ferkel für diesen Versuch zur Verfügung; Bis Freitag hätten die Ferkel das Experiment durchlaufen. Die Verwendung des gleichen Geschlechts und eines nahezu ähnlichen Alters ist wichtig, um Störfaktoren zu vermeiden.
  2. Stellen Sie bei der Ankunft des Ferkels sicher, dass es eine individuelle Identifizierung hat (z. B. eine Ohrmarke und eine Aufzeichnung mit Gewicht und Alter).
  3. Unterbringung der Ferkel in einer Labortierstation (LACU) unter der Obhut eines lizenzierten Tierarztes. Die Tiere sind als Gruppe in einem geräumigen Gehege mit einem festen Betonboden untergebracht, der leicht mit Wasser gewaschen werden kann, um eine gute Hygiene zu gewährleisten.
  4. Fügen Sie ein Möbelstück wie einen schweren Ball hinzu, um eine Bereicherung und Stimulation der Umwelt zu ermöglichen.
  5. Stellen Sie sicher, dass die LACU optimale Umgebungsbedingungen bietet, einschließlich der folgenden Schlüsselelemente: Hygiene, Ernährung, Temperaturregelung, Belüftung und Tag-Nacht-Zyklus, indem Sie die Beleuchtung steuern.
  6. Lassen Sie den Tierarzt das Ferkel täglich überprüfen, einschließlich Gewichtsmessung, um den Untersucher zu informieren, wenn ein Ferkel krank erscheint, was einen Ausschluss aus dem Versuch erforderlich machen kann.
  7. Lassen Sie die Ferkel für mindestens 1 Tag, um sich an die Umgebung zu gewöhnen, was hilft, den Stress zu minimieren.

2. Präoperative Vorbereitung

  1. Bereiten Sie die chirurgische Station vor, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Dazu gehören ein Heizkissen, Katheter, ein Beatmungsgerät, ein Endotrachealtubus, heparinisierte Kochsalzlösung und ein Beutel mit Ringerlaktatflüssigkeit.
    HINWEIS: Ferkel haben eine schlechte thermoregulatorische Kapazität und sind anfällig für Unterkühlung, die die Hämodynamik verändert22,23. Daher ist es wichtig, genügend Zeit für das Aufwärmen des Heizkissens einzuplanen.
  2. Bereiten Sie 10 mg/ml α-Chloralose zu, indem Sie es mit Kochsalzlösung bei 60 °C mischen, bis die Mischung klar ist. Überhitzen Sie die Lösung nicht, um ein Kristallisieren des Medikaments beim Abkühlen zu vermeiden. Vor der Verabreichung an die Ferkel mit einem Spritzenfilter (Größe 0,22 μm) filtrieren.
  3. Erstellen Sie Anästhetika basierend auf dem Tiergewicht - Ketamin: 20 mg / kg und Xylazin: 2,2 mg / kg. Verwenden Sie α -Chloralose (5 ml / kg), um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
    HINWEIS: α-Chloralose wird aufgrund der einfachen intravenösen Verabreichung im Vergleich zu inhalativen
    Anästhetika, da letztere ein Anästhesiegerät und ein geeignetes Spülsystem erfordern, das über einen Endotrachealtubus verabreicht werden muss.

3. Anästhesie

  1. Führen Sie die Einleitung der Anästhesie im Schweinestall durch, einer Umgebung, die für Ferkel bekannt ist, um übermäßigen Stress zu vermeiden.
  2. Das Ferkel vorsichtig an den Hinterbeinen pflücken und Ketamin: 20 mg/kg und Xylazin: 2,2 mg/kg mit einer 23 G 3/4 Nadel in das hintere Bein am Musculus semimembranosus/semitendinosus verabreichen.
  3. Warten Sie einige Minuten, bis die Medikamente wirksam werden. Überprüfen Sie die angemessene Anästhesie, indem Sie sicherstellen, dass das Tier entspannt genug ist, um unbeweglich zu sein, mit Verlust des Reflexes und des Kiefertonus, um einen einfachen und sicheren Transport zur chirurgischen Station zu ermöglichen. Beurteilen Sie den Lidreflex durch Berühren des inneren Augenwinkels; Das Fehlen von Blinzeln weist auf eine ausreichende Anästhesie hin.

4. Tracheostomie

HINWEIS: Dieses Experiment ist nicht überlebensfähig, daher wird eine Tracheotomie durchgeführt, um einen Atemweg für die mechanische Beatmung zu etablieren. Die Tracheostomie ist ein schnelles und einfaches Verfahren, im Gegensatz zur endotrachealen Intubation, die bei Ferkeln aufgrund ihrer Kopf- und oberen Atemwegsanatomie eine Herausforderung darstellt24,25. Darüber hinaus wird häufig über Laryngospasmus während der Intubation berichtet, was zu einer längeren Periode von Hypoxie und Hypercarbie führt, die die Ergebnisse beeinträchtigen kann26.

  1. Positionieren Sie das Ferkel im Rückenliegen. Identifizieren Sie den Cricothyroidknorpel, indem Sie die Prominenz des Schildknorpels abtasten, der sich fest anfühlt. Sterilisieren Sie den Bereich mit Povidon-Jod und 70% Ethanol, bevor Sie einen sterilen Drapier auftragen.
  2. Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge einen 2-3 cm langen ventralen Mittellinienschnitt unterhalb des kaudalen Endes des Schildknorpels.
  3. Mit einem gekrümmten Mückenhämostaten stumpf die darüber liegenden Unterhautgewebe und Muskeln (Sternohyoideus und kutane coli) sezieren, bis die Cricothyroidmembran und die ersten Trachealringe sichtbar sind. Seien Sie beim Sezieren vorsichtig, um Blutgefäße nicht zu verletzen.
  4. Erhalten Sie eine klare Sicht auf die Cricothyroidmembran und die Trachealringe24, und verwenden Sie dann ein Paar lange Mixter-Winkelzangen, um die Strukturen anzuheben.
    1. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen kleinen Schnitt an der Cricothyroidmembran oder dem ersten Trachealring. Verlängern Sie den Schnitt horizontal auf ~ 0,5 cm, um einen 3,0 mm Endotrachealtubus zu passieren.
    2. Führen Sie das Röhrchen bis zur 5-cm-Markierung ein. Stellen Sie eine bilaterale Brustausdehnung und Atemgeräusche sicher, bevor Sie den Schlauch sichern.
  5. Führen Sie Nabelband um die Luftröhre, um sie an Ort und Stelle zu befestigen. Zusätzliches Klebeband wird verwendet, um den Schlauch an der Basis des Kiefers zu befestigen.
  6. Schalten Sie das Beatmungsgerät ein, schließen Sie den Endotrachealtubus an und rollen Sie die spezifischen Knöpfe (z. SIMV-Knöpfe, PEEP-Knöpfe usw.), um die folgenden Grundeinstellungen auszuwählen. Druckregelmodus: synchronisierte intermittierende mechanische Beatmung (SIMV); Spitzeninspirationsdruck (PIP) - 15; positiver endexspiratorischer Druck (PEEP) - 5; Rate- 20; I-Zeit - 0.6. Nach der ersten Blutgasanalyse passen Sie die Einstellungen des Beatmungsgeräts entsprechend den Blutgasergebnissen an, mit dem Ziel, eine ausreichende Sauerstoffversorgung und Belüftung aufrechtzuerhalten.

5. Kanülierung von Oberschenkelgefäßen

  1. Stellen Sie die Atemwege und die Belüftung her, bevor Sie die Aufmerksamkeit auf die Femurgefäße für den venösen Zugang und die invasive Blutdrucküberwachung lenken. Die Arteria femoralis wird durch das Gefühl eines Pulses an der Rille zwischen den Musculus sartorius und gracilis identifiziert, und die Vene kann nur medial zur Arterie gefunden werden.
  2. Während das Ferkel in einer dorsalen liegenden Position liegt, sterilisieren Sie die Leistengegend mit Povidon-Jod und Ethanol und tragen Sie einen entsprechend großen Tuch auf.
  3. Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen 3-4 cm langen Längsschnitt zu erstellen, der kranial an der Leistenfalte beginnt und sich distal entlang des Femurkanals erstreckt.
  4. Wenden Sie eine stumpfe und scharfe Dissektion mit einer gebogenen Pinzette und einer Schere an, um bis auf die Höhe des femoralen neurovaskulären Bündels zu sezieren. Das Bündel befindet sich tief im Körper des Muskelsgracillis27. Zerlegen Sie die Oberschenkelarterie und Vene im Laufe von 2-3 cm, um eine Kanülierung zu ermöglichen. Ligate kleine Seitenäste, wenn nötig.
  5. Tragen Sie eine 3,0-Seidenkrawatte sowohl an der Arterie als auch an den proximalen und distalen Enden der Vene an, um Traktion anzuwenden. Binden Sie die distale Seidennaht sowohl an die Vene als auch an die Arterie und ligieren Sie die Gefäße.
  6. Beginnen Sie mit der Oberschenkelvene, behalten Sie die distale und proximale Traktion auf den Seidenbinden bei und verwenden Sie dann eine Mikroschere, um eine Venotomie zu erzeugen.
  7. Als nächstes verwenden Sie einen Venenpickkathetereinleitung, um das Gefäß zu öffnen, während Sie einen vorgemessenen Polyurethankatheter mit einem Innendurchmesser x Außendurchmesser von 0,86 mm x 1,32 mm einführen. Nach dem Einführen binden Sie die proximale 3.0-Seidennaht, um den Katheter zu fixieren. Spülen Sie den Katheter mit 3 ml heparinisierter Kochsalzlösung (1 U/ml). Diese Lösung kann durch Zugabe von 0,5 ml Heparin zu 50 ml normaler Kochsalzlösung hergestellt werden.
  8. Führen Sie einen invasiven Blutdruckkatheter mit dem gleichen Ansatz wie oben ein, um eine Arterriotomie zu erstellen und den Katheter zu passieren.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der distalen und proximalen Traktion ist unerlässlich, um den Blutverlust beim Zugang zur Arterie zu minimieren.
  9. Sobald die Katheter gesichert sind, bedecken Sie die Stelle mit salzhaltiger Gaze, und falls erforderlich, kann die Haut mit einer 3,0-Seidennaht genäht werden, um eine Infektion zu verhindern.

6. Aufrechterhaltung von Anästhesie, Flüssigkeit und Blutgas

  1. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie während des gesamten Experiments mit Kieferton und Lidreflex und verabreichen Sie α-Chloralose intravenös, je nach Bedarf, um das Tier unter tiefer Narkose zu halten. Verwenden Sie eine anfängliche Aufsättigungsdosis von 50 mg/kg und 20 mg/kg für weitere Bolus.
  2. Ringerlaktat mit einer Rate von 4 ml / kg / h während des gesamten Experiments als Erhaltungsflüssigkeit infundieren. Wenn beispielsweise das Ferkelgewicht 3 kg beträgt, beträgt die Flüssigkeitsinfusionsrate 12 ml / h.
  3. Für die Gasanalyse am Krankenbett ziehen Sie eine arterielle Blutprobe in eine heparinisierte Blutgasspritze und legen Sie die Probe dem Analysegerät vor. Wählen Sie die Option arterielles Blutgas und warten Sie ~2-3 s, bis der Analysator die Blutentnahmenadel präsentiert.
    1. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Ende der Spritze mit der Blutprobe ein. Warten Sie, bis der Analysator die erforderliche Probe abgesaugt hat, und ziehen Sie die Spritze heraus. Lassen Sie die Maschine das Blutgas analysieren und die Ergebnisse präsentieren.
    2. Basierend auf den Ergebnissen stellen Sie das Beatmungsgerät so ein, dass der pH-Wert zwischen 7,35-7,45, der Partialdruck von Kohlendioxid (PCO2) zwischen 35-45 mmHg und der Sauerstoffpartialdruck (PaO2) zwischen 80-150 mmHg gehalten wird. Die Einstellungen unterscheiden sich je nach Beatmungstyp, beinhalten jedoch hauptsächlich die Erhöhung oder Verringerung der Atemfrequenz mit geeigneten Knöpfen, um Hypoxie und / oder Hyperkapnie zu kompensieren.
  4. Ziehen Sie 3 ml Blut in ein hellgrünes Röhrchen (Lithium-Heparin). Die Probe wird 15 min lang bei 2000 xg zentrifugiert, bei 4 °C gehalten, um Plasma zu extrahieren. Nach Fertigstellung kann das Plasma sofort mit dem Chemieanalysator am Krankenbett auf Serumkreatininspiegel analysiert oder für eine spätere Analyse bei -80 °C gelagert werden.
  5. Überwachen Sie die Temperatur kontinuierlich mit einem rektalen Sondenthermometer und stellen Sie die Heizkissentemperatur ein, um die Ferkeltemperatur zwischen 101 und 103 ° F zu halten.

7. Versuchsgruppe; Stuhlligatur und -perforation (CLP) 25,28,29

HINWEIS: Führen Sie bei Ferkeln in der Versuchsgruppe CLP durch, um eine polymikrobielle Sepsis28 zu induzieren, und überwachen Sie das Tier 12 Stunden nach der Operation, um genügend Zeit für eine schwere Sepsis zu haben. Die transdermale GFR-Aufzeichnung beginnt bei 8 h post-cecal Ligatur, um eine 4-stündige Aufzeichnung zu ermöglichen.

  1. Verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um einen 5-6 cm linken paramedianen vertikalen Schnitt zu erstellen, da der Blinddarm bei Schweinen in der linken paralumbalen Fossa30 liegt. Sezieren Sie die Bauchwandschichten und vermeiden Sie eine Verletzung der oberflächlichen Oberbauchgefäße.
  2. Sobald die Peritonealschicht eingeschnitten ist, verwenden Sie einen Retraktor, um den Zugang zu intrabdominalen Strukturen zu verbessern.
  3. Identifizieren Sie den Spiraldickdarm im oberen linken Quadranten des Abdomens. Verfolgen Sie den Spiraldickdarm, kaudal und dorsal, um den Blinddarm zu lokalisieren. Das Ileum verbindet sich mit dem Sigmaspirale an der Basis des Blinddarms.
  4. Ligieren Sie den Blinddarm nur distal zum ileozökalen Übergang (Abbildung 1).
  5. Machen Sie mit einer 18-G-Nadel sieben Einstiche im Blinddarm und extrudieren Sie Kot in den Peritonealbereich.
  6. Schließen Sie den Bauch in Schichten mit einer 3,0-Seidennaht mit einfachen unterbrochenen oder kontinuierlichen Stichen. Ein Hefter kann auch verwendet werden, um die Hautschicht zu schließen, falls vorhanden.

8. Scheingruppe

  1. Befolgen Sie die Schritte 7.2-7.4 wie oben. Nachdem Sie den Blinddarm identifiziert haben, legen Sie ihn unberührt zurück und schließen Sie die Bauchdecke ähnlich.
  2. Überwachen Sie Ferkel in der Scheingruppe für 12 Stunden, um verwirrende Verzerrungen zu beseitigen, die auf eine längere Exposition gegenüber Anästhesie zurückzuführen sind.

9. Einrichtung des transdermalen GFR-Geräts

  1. Nach 8 Stunden Stuhlligatur bereiten Sie sich darauf vor, die transdermale Messung der GFR zu beginnen.
  2. Verwenden Sie die MB-Servicesoftware Version 3.0, um die Abtastrate auf dem GFR-Gerät anzupassen. Verbinden Sie das transdermale GFR-Gerät kurz über den USB-Anschluss mit der Computersoftware. Öffnen Sie die Software, klicken Sie auf Verbinden und stellen Sie das Timing auf 4000 ms ein. Klicken Sie auf Schreiben , um die Einstellungen zu speichern.
    HINWEIS: Dies ergibt bis zu 6 Stunden Gesamtprobenahmezeit. Bei den Schweinen ist die transdermale GFR in 4 h abgeschlossen. Für Experimente, die eine Probenahme von bis zu 12 Stunden erfordern, wählen Sie die Option 8000 ms.
  3. Befestigen Sie die beidseitigen Klebepflaster mit einem klaren Fenster am Gerät. Befestigen Sie das Gerät an einer Seite und stellen Sie sicher, dass die Leuchtdiode über dem klaren Fenster liegt, um die Tracererkennung zu ermöglichen.
  4. Rasieren Sie den Bereich über der seitlichen Brustwand. Befestigen Sie den Akku am Gerät, kleben Sie den Klebepflaster sofort mit dem Gerät an Ort und Stelle, und stellen Sie sicher, dass er gut gesichert ist (Abbildung 2). Da die Ferkel tief betäubt sind, kann ein Klebeband unnötig sein, um das Gerät an Ort und Stelle zu halten.
    HINWEIS: Das Klebepflaster allein reicht aus, um es zu sichern. Bei Verfahren, bei denen das Tier manipuliert, aktiv wird oder die Anästhesie gestört werden könnte, kann es jedoch wichtig sein, ein Klebeband anzubringen. Ein Verband könnte auch ein alternativer Ansatz sein31.
  5. Vor der Verabreichung von FITC-Sinistrin ist eine Baseline-Aufzeichnung von 3-5 min erforderlich.

10. FITC-Sinitrin-Vorbereitung und Injektion

  1. Bereiten Sie eine Mischung von FITC-Sinistrin mit Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 50 mg / ml vor. Die dem Ferkel verabreichte Dosis beträgt 20 mg/kg. FITC-Sinistrin wird in Pulverform geliefert.
    HINWEIS: Das FITC-Sinistrin kann auch über einen peripheren Venenkatheter verabreicht werden, der in die Ohrvene eingeführt wird. Es ist wichtig, einen hohen Spitzenwert durch die Verabreichung von FITC-Sinistrin als Push-Bolus durch den Venenkatheter der Oberschenkelvene zu erreichen.
  2. Befestigen Sie die Spritze mit Medikamenten auf einer Seite eines Drei-Wege-Stop-Hahns und einer Kochsalzlösung auf der anderen Seite des Stop-Hahns. Drücken Sie das FITC-Sinistrin und folgen Sie sofort mit einem 5 ml Kochsalzbolus, bevor Sie den Drei-Wege-Stop-Hahn zur Ferkelvene schließen.

11. Transdermale GFR-Aufzeichnung

  1. Halten Sie das Gerät 4 h lang am Ferkel befestigt. Während dieser Zeit halten Sie das Ferkel unter Narkose mit intermittierenden Dosen von α-Chloralose in einer Konzentration von 20 mg / kg, um Bewegungsartefakte zu vermeiden.
  2. Am Ende der 4 h entfernen Sie das Gerät und trennen Sie sofort die Batterie.

12. GFR-Messung

  1. Verbinden Sie das transdermale GFR-Gerät über den vom Lieferanten bereitgestellten USB-Anschluss mit dem Computer.
  2. Öffnen Sie die Lesesoftware, um Daten vom Gerät abzurufen. Speichern Sie die Rohdaten, indem Sie auf die Reihenfolge Verbinden, Lesen, Umbenennen und Speichern klicken. Wie im Handbuch beschrieben, verarbeiten und werten Sie die gespeicherten Daten in der Analysesoftware aus.
  3. Öffnen Sie kurz die Software Version 3.0 und importieren Sie die Daten. Passen Sie die Offset-, Start- und Endposition mithilfe der automatisierten Marker an. Entfernen Sie ggf. Artefakte und klicken Sie auf Anpassen. Dies ergibt eine Anzeige, die die FITC-Sinitrin-Clearance in Minuten (t1/2) anzeigt. Der t1/2 wird anschließend zur Berechnung der tGFR32,33 wie folgt verwendet:
    Equation 1
    HINWEIS: In Absprache mit dem Hersteller beträgt der Umrechnungsfaktor für Schweine 20 (was bedeutet, dass 20% des Körpergewichts extrazellulärer Raum ist), im Gegensatz zu 21,33 bei Ratten (tGFR in ml/min) und 14.616,8 bei Mäusen (tGFR in μL/min). Dies liegt daran, dass die GFR genau als Funktion der extrazellulären Flüssigkeit 34,35 gemessen wird, die wiederum vom Körpergewicht36 abhängt.

13. Ferkel-Euthanasie

  1. Sammeln Sie 3 ml Blut nach 12 Stunden CLP für weitere biochemische Analysen.
  2. Euthanasieren Sie das Ferkel, indem Sie 0,2 ml / kg vorgemischte Mischung aus 20% Natriumpentobarbital und Phenytoin-Natrium intravenös verabreichen.
  3. Ernten Sie die richtige Niere für die histopathologische Studie, bevor Sie das Ferkel in die Leichenhalle bringen.

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Representative Results

In diesem Abschnitt präsentieren wir zum ersten Mal die repräsentativen Daten aus der Anwendung der transdermalen GFR bei Neugeborenenschweinen. Wir verwendeten ein Stuhlligatur- und Punktionsmodell, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es die Nierenfunktion verringert28. Dementsprechend stellten wir die Hypothese auf, dass bei unseren CLP-Schweinen ein akuter Abfall der GFR entsprechend AKI auftreten sollte, und dies sollte auf dem transdermalen GFR-Gerät als erhöhte Clearance-Zeit (t1/2) nachgewiesen werden, wodurch seine Verwendung bei Schweinen validiert wird. Sieben männliche Ferkel wurden eingeschlossen, drei Scheinferkel und vier Sepsis. Die beiden Gruppen hatten vergleichbare Gewichte (Abbildung 3A). Wie erwartet28, erhöhte 12 h Sepsis die Serumspiegel von C-reaktivem Protein (CRP), einem Bakteriämie- und Sepsismarker (Abbildung 3B). Repräsentative FITC-Sinistrin-Clearance-Kurven in schein- vs. septischen Ferkeln sind dargestellt (Abbildung 4 A,B), wobei AKI durch Überlagerung der Schein- und Sepsiskurven dargestellt wird (Abbildung 4C). AKI wird durch eine vergrößerte Fläche unter der Kurve für die CLP-Schweine dargestellt. Dies ist sichtbar, wenn die Scheinkurve auf die CLP-Kurve gelegt wird. Die durchschnittliche Halbwertszeit für FITC-Sinistrin in der Schein- und Sepsis-Gruppe betrug 114 bzw. 537 Minuten (Abbildung 5A). Die durchschnittliche GFR in der Scheingruppe betrug 5,1 ml / min / 100 g des Körpergewichts, während sie in der Sepsis-Gruppe 1,06 ml / min / 100 g des Körpergewichts betrug (Abbildung 5B). Ein weiteres Tier wurde ausgeschlossen, da die Sonde verschoben wurde, was die Freiraumkurve und die Zeit störte. Während sich 12 h Serumkreatinin (ein Biomarker für akute Nierenschädigung) in der Scheingruppe nicht veränderte, war es bei den septischen Schweinen von ~ 0,6 auf 1,08 mg/dl erhöht (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Ligatur des Himmels. (A) Cecum identifiziert und nach außen gebracht. (B) Cecum an der Basis mit einer Seidenkrawatte ligiert, bevor es mit einer Nadel punktiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Befestigung des transdermalen Geräts an der Haut. (A) Rasierte Haut vor dem Anbringen des Klebepflasters. (B) Transdermales GFR-Gerät, das am Klebepflaster befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse. (A ) Gewicht der in dieser Studie verwendeten Ferkel und (B) Serum-C-reaktives Protein (CRP) in mechanisch beatmeten Schein- und septischen männlichen Ferkeln ( ungepaarter t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative FITC-Sinitrin-Clearance-Kurven bei mechanisch beatmeten Schein- und septischen männlichen Ferkeln. (A ) 12 h Schein, (B) 12 h Sepsis. Septische Schweine weisen eine eingeschränkte Nierenfunktion auf, was durch eine vergrößerte Fläche unter der Kurve gezeigt wird. Schwarze Datenpunkte stellen Rohdaten dar, blaue Linien die Drei-Kompartiment-Passung, grüne Linien die 95%-Konfidenzintervalle und rote Linien die gefilterten Daten. (C) Überlagerung repräsentativer Kurven zur Widerspiegelung des Grades der Abweichung vom Ausgangswert bei septischen Schweinen. Die Sepsiskurve (rot) zeigte eine minimale Clearance von FITC-Sinistrin, was auf AKI hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse. (A ) FITC-Sinitrin-Halbwertszeit und ( B) GFR-Plots in mechanisch beatmeten Schein- und septischen männlichen Ferkeln (ungepaarter t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Serumkreatinin in mechanisch beatmeten Schein- und septischen männlichen Ferkeln. (Einweg-ANOVA-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieser Artikel beschreibt praktische Schritte zur Bestimmung der Nierenfunktion bei Schweinen mit den miniaturisierten transdermalen GFR-Monitoren und FITC-Sinistrin in einem mechanisch beatmeten, anästhesierten Neugeborenenschweinmodell. Frühere Arbeiten haben experimentelle transdermale GFR-Protokolle bei Nagetieren11,12,14 etabliert, aber keine Protokolle bei Schweinen.

In jüngster Zeit wurde versucht, alternative Tiermodelle zu erforschen, um hartnäckige Krankheiten zu lösen und die Belastung durch Nierenerkrankungen beim Menschen zu verringern. Leider hatten viele dieser Ansätze translationale Einschränkungen aufgrund von Größe, anatomischen und physiologischen Unterschieden. Die Nierenanatomie und Pathophysiologie von Nagetieren weist große Unterschiede im Vergleich zum Menschenauf 37. Da das System von Mensch und Schwein ähnliche anatomische und funktionelle Merkmale aufweist, kann das Schweinemodell ein realistischeres pathophysiologisches Modell menschlicher Krankheiten sein38,39. Schweine werden heute häufig zur Abgrenzung der Pathophysiologie und in der Arzneimittelentwicklung eingesetzt. Mit der Veröffentlichung des Schweinegenoms wird das Schweinemodell neben der erfolgreichen transgenen Produktion krankheitsspezifischer Modelle eine wichtigere Rolle in der translationalen Forschung einnehmen40,41.

Die Inulin-Clearance ist nach wie vor das am meisten akzeptierte Mittel zur Bestimmung der GFR, ist jedoch in Großtiermodellen aufgrund der Notwendigkeit einer kontinuierlichen Infusion von Inulin, der Katheterisierung der Blase und ihrer zeitaufwendigen und umständlichen Natur unpraktisch42. Serumkreatinin und Blutharnstoffstickstoff (BUN) werden häufig zur Messung der Nierenfunktion in präklinischen Studien verwendet, aber da Kreatinin in den Tubuli sezerniert wird und Harnstoff bei Dehydratation zunehmend resorbiert wird, haben sich diese Marker bei der Schätzung der Nierenfunktion als schlecht erwiesen 5,43. Entscheidend war, dass die tubuläre Kreatininsekretion eine Überschätzung der GFR verursachte, wenn sie als Marker für die Nierenfunktion bei den Schweinen verwendet wurde6. Aufgrund ihres Körperhabitus ist ein Anstieg des Kreatinins in großen Tiermodellen im Vergleich zu Nagetieren eher zu beobachten. Eine Studie an Mäusen ergab einen 1,5-fachen Anstieg des Serumkreatinins 6 h nach der Cecal-Ligatur44. Zuvor zeigten wir einen Anstieg des Kreatinins bei neonatalen Schweinen 6 h nach CLP28. In dieser Studie hielten wir die Tiere für eine längere Zeit, ~ 12 Stunden nach der Cecal-Ligatur, um genügend Zeit für eine signifikante AKI und einen anschließenden Anstieg des Kreatinins zu haben. Wie in unserer vorherigen Studie bestätigten wir die Induktion einer Sepsis durch einen Anstieg der Serumspiegel von CRP, einem Entzündungs- und Sepsismarker. In dieser Studie und wie frühere Arbeiten zeigen, hängt der Schweregrad der Sepsis nach CLP von der Länge der Ligatur und der Anzahl der Punktionen ab44.

Ein Protokoll zur Messung der GFR bei Schweinen mit Iohexol wurde zuvor bei Schweinen37 validiert, aber im Gegensatz dazu ist das transdermale GFR-Verfahren eine deutliche Verbesserung. Es ist weniger umständlich, vermeidet wiederholte Blut- oder Urinproben und bietet ein Echtzeitfenster für die Nierenfunktion und die Möglichkeit wiederholter Serienmessungen am selben Tier45. Diese Studie liefert praktische Leitlinien für die transdermale GFR-Bestimmung bei Schweinen.

Wie von anderen Gruppen festgestellt, sind die kritischsten Schritte die korrekte Fixierung des Geräts an das Tier und die Bolusinjektion von FITC-Sinistrin. Das Messgerät muss gut an der Hautoberfläche befestigt sein, um Bewegungsartefakte auf der Spur zu vermeiden. Da Schweine weniger behaart sind als Nagetiere, ist die Verwendung einer Enthaarungscreme nicht erforderlich. Eine saubere Rasur mit einem Haarschneider könnte alles sein, was benötigt wird. Dies minimiert die mit der Enthaarung verbundene Erhöhung der Halbwertszeit von FITC-Sinistrin, dessen Mechanismus unbekannt ist12. Für eine ordnungsgemäße Fixierung sind ein doppelseitiges Klebepflaster und Klebeband erforderlich, um das Gerät an Ort und Stelle zu halten. Die optimalen Platzierungsorte der Geräte sind die laterale Brustwand und die ventrale Bauchregion. Diese Bereiche korrelierten mit weniger Bewegungsartefakten.

Bei der Injektion von FITC-Sinistrin muss die richtige und gesamte Dosis in einer Flüssigkeitsbewegung in die Vene injiziert werden. Wenn die Einspritzung unterbrochen und neu gestartet wird, erzeugt sie mehrere "Mini-Peaks" auf der Freiraumkurve. Die Schwanzvene wird routinemäßig für kleine Nagetiere verwendet, aber die Ohrvene aurikuläre bietet einen zugänglicheren und prominenteren Weg bei den Schweinen. Eine Kanüle kann für mehrere Messungen bei bewussten Schweinen in die Ohrvene gelegt werden. Ein wichtiger Unterschied in der Probenahmezeit ist, dass Schweine im Gegensatz zu Nagetieren (~ 1-2 h) länger halten (~ 4 h), was ungefähr der Zeit entspricht, die benötigt wird, bis FITC-Sinistrin aus dem Kreislauf entfernt wird. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Arbeit, die transdermale GFR über FITC-Sinitrin-Clearance bei Schweinen detailliert beschreibt. Es gibt also keine Zitate als Referenz. Die verwendete Messzeit ~4h wurde durch Rücksprache mit dem Hersteller ermittelt. Diese Probenahmezeit ist vergleichbar mit einer früheren Studie zur Validierung der transdermalen GFR bei anderen Nicht-Nagetiersäugetieren14.

Bei der Bewertung der transdermalen GFR bei Ferkeln gibt es einige Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Es ist bekannt, dass Ein-Kompartiment-Modelle die GFR deutlich überschätzen46; Wir verwenden das kinetische Drei-Kompartiment-Modell, das genauer ist und eine Drei-Wege-Kommunikation des intravenös injizierten Markers zwischen dem Plasma, dem extrazellulären Raum und tieferen Komponenten46 ermöglicht. Auch dies sind mechanisch beatmete Ferkel unter sehr tiefer Narkose für ~12 h. Da die Anästhesie die Nierenfunktion beeinflusst47,48, könnte es sich lohnen, dies bei Verfahren zu berücksichtigen, die eine lange Sedierung erfordern oder bei denen experimentelle Manöver neben der GFR-Überwachung eine zusätzliche Anästhesie erfordern. Schließlich, und vielleicht am entscheidendsten, haben neonatale Ferkel noch sich entwickelnde Nierensysteme mit unreifen Nephronen, die bei einem Bruchteil des erwachsenen Tieres funktionieren49. Daher zeigen sie eine niedrigere GFR und Nierenfunktion50.

Wie bereits erwähnt, ist die transdermale GFR bei Schweinen kein absolutes Maß für die Sinitrinkonzentration im Blut. Es ist nur eine Schätzung des Zerfalls in der Fluoreszenz über die Zeit12. Die Verwendung eines Umrechnungsfaktors versucht, dies zu mildern, indem GFR in ml / min ausgedrückt wird. Da der Umrechnungsfaktor jedoch vom extrazellulären Raum abhängig ist, der wiederum vom Körpergewicht34,35,36 abhängt, ist es möglich, dass große Schwankungen auftreten, wenn das Gewicht nicht kontrolliert wird oder wenn der extrazelluläre Raum nicht genau definiert ist 51,52.

Darüber hinaus scheint die Hautpigmentierung die transdermale FITC-Sinitrin-Clearance 12,31 zu beeinflussen. In unseren Studien fanden wir heraus, dass die pigmentierten Schweine ein vermindertes Signal zeigten. In einem Fall haben wir kein Signal in einem intensiv dunkel gefärbten Schwein gefunden. Da das Hintergrundsignal jedoch bei pigmentierten Tieren tendenziell reduziert ist12, fanden wir, dass die GFR-Werte weitgehend vergleichbar waren. Eine Lösung dafür ist, sich bei der Platzierung des Geräts für hellere Hautbereiche zu entscheiden. Da diese Schweine weitgehend in einem chirurgischen Krankheitsmodell mit verschiedenen Formen von Beleuchtung und Wärmequellen verwendet wurden, muss man potenzielle Bewegungsartefakte auf den GFR-Spuren über reflektiertes Licht, das von der umgebenden Haut absorbiert wird, berücksichtigen12. Eine Lösung hierfür könnte sein, Infrarotlicht während der Aufnahme zu minimieren oder die Geräte mit Folie zu bedecken.

Zusammenfassend bietet diese Studie eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der glomerulären Filtrationsrate bei neugeborenen Schweinen unter Verwendung der transdermalen Messung der FITC-Sinitrin-Clearance. Darüber hinaus unterstützen unsere Daten den Nutzen des Systems bei der Bewertung der Nierenfunktion bei akuten Nierenverletzungen.

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Disclosures

Nichts.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health R01 DK120595 und R01 DK127625 unterstützt, die Dr. Adebiyi verliehen wurden. Der Inhalt dieses Papiers liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar. Vielen Dank an Dr. Daniel Schock-Kusch, Standortleiter der MediBeacon GmbH, für seinen Rat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

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Medizin Ausgabe 187
Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei mechanisch belüfteten Ferkeln
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Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

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