خلايا الكبد المحملة بالدهون متأصلة في تجديد الكبد ولكنها عادة ما تضيع عند الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هنا ، نقدم بروتوكول عزل الخلايا الأمثل الذي يحتفظ بخلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه مجموعات تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم استخدام استئصال الكبد الجزئي على نطاق واسع للتحقيق في تجديد الكبد في الفئران ، ولكن عزل الغلة العالية لخلايا الكبد القابلة للحياة لتطبيقات الخلية المفردة في المصب يمثل تحديا. لوحظ تراكم ملحوظ للدهون داخل خلايا الكبد المتجددة خلال أول 2 أيام من تجديد الكبد الطبيعي في الفئران. هذا ما يسمى بالتنكس الدهني المرتبط بالتجديد العابر (TRAS) مؤقت ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية. تنقية تدرج الكثافة هي العمود الفقري لمعظم البروتوكولات الحالية لعزل خلايا الكبد الأولية. نظرا لأن التنقية المتدرجة تعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فإنها تفصل بين مجموعات خلايا الكبد غير الدهنية والخلايا الكبدية الدهنية. لذلك ، غالبا ما تفقد خلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه أجزاء غير تمثيلية من خلايا الكبد.
يصف البروتوكول المقدم طريقة سهلة وموثوقة للعزل في الجسم الحي لتجديد خلايا الكبد بغض النظر عن محتواها من الدهون. يتم عزل خلايا الكبد من ذكور الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى البقايا ، باستخدام تقنية التروية الرجعية مع التدفق الخارجي عبر الوريد البابي. يتم فصل خلايا الكبد عن طريق كولاجيناز لإطلاقه من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والطرد المركزي الدقيق ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب. في الختام ، تصف هذه الورقة تقنية مباشرة وقابلة للتكرار لعزل مجموعة تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران. قد تساعد هذه الطريقة أيضا في دراسة مرض الكبد الدهني.
المقدمة
يمكن للكبد تجديد نفسه حتى بعد فقدان الأنسجة بشكل كبير. تتضح هذه القدرة التجديدية الفريدة بوضوح من خلال النموذج التجريبي لاستئصال الكبد الجزئي (70٪) ، والذي تم وصفه لأول مرة في الفئران من قبل هيغينز وأندرسون في عام 19311. في هذا النموذج ، تتم إزالة 70٪ من الكبد جراحيا من الحيوانات عن طريق قص فصوص الكبد الكبيرة. ثم تنمو الفصوص المتبقية من خلال تضخم تعويضي لاستعادة كتلة الكبد الأصلية في غضون أسبوع واحد تقريبا بعد الجراحة ، وإن كان ذلك دون استعادة بنية الكبد الأصلية 2,3. تم تطوير عمليات استئصال الكبد الإضافية بكميات متفاوتة من إزالة الأنسجة ، مثل استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ حيث تكون بقاي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كانت جميع التجارب على الحيوانات متوافقة مع اللوائح الفيدرالية السويسرية للحيوانات ووافق عليها المكتب البيطري في زيورخ (رقم 007/2017 ، 156/2019) لضمان رعاية الإنسان. تم الاحتفاظ بذكور الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعا في دورة نهارية / ليلية لمدة 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. تألفت كل مجموعة تجريبية من ستة إلى ثمانية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. استئصال الكبد الجزئي في الفئران
- لاستئصال الكبد القياسي (70٪) ، قم بربط واستئصال الفص الجانبي الأيسر والجزء الأيمن من الفص المتوسط والجزء الأيسر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يبلغ TRAS ذروته في 16 ساعة بعد استئصال الكبد ويختفي تدريجيا بعد 32-48 ساعة بعد استئصال الكبد القياسي ، لكنه يستمر بعد 48 ساعة بعد استئصال الكبد الممتد. من الناحية المجهرية ، يمكن رؤية TRAS بسهولة كبشرة شاحبة من بقايا الكبد (الشكل 1F) ويمكن ملاحظتها في الفئران التي تم استئصال الكبد فيها بين 16 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة.
العائد النهائي المقدر هو 10-15 × 10 6 خلايا كبدية بعد 70٪ - استئصال الكبد و 4-9 × 106 بعد استئصال الكبد الممتد 86٪ في الفئرا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر البروتوكول المنشور طريقة موثوقة ومباشرة لعزل غلة عالية من خلايا الكبد الفأر الطبيعية والدهنية لتحليلات المصب أحادية الخلية أو التحليل المجمع للخلايا بعد فرز FACS. الميزة المميزة لتنقية تدرج الكثافة هي أن محتوى الدهون الخلوية ليس له أي تأثير أساسي على العائد الفعال لخلايا الكبد. وبالتالي ، سيتم الاحتفاظ بجزء من خلايا الكبد الدهنية وإدراجها في التحليلات النهائية. هذا ليس أمرا بالغ الأهمية لدراسة أمراض الكبد الدهنية فحسب ، بل إنه أمر بالغ الأهمية أيضا لأي تحليل للعمليات التي تلي عمليات استئصال الكبد الرئيسية ، حيث تظهر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة من قبل Swiss National Fond (منحة المشروع 310030_189262).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > الكواشف < / قوي > | |||
| Alexa Fluor 488 الزومبي الأخضر | BioLegend | 423111 | صبغة الجدوى التفاعلية |
| الأمين Attane Isoflurane ad. Vet. 99.9٪ | Provet | AG QN01AB06 | تنبيه: يحتاج إلى تهوية |
| حل EDTA | سيجما ألدريتش | E8008-100ML | - |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | V001229 | تمييع بالماء إلى 70٪ |
| مصل الجنين البقري (FCS) محلول | الملح المتوازن من جيبكو | A5256701-هانكس | |
| (HBSS) ، Ca2 + < / sup> ، Mg 2 + < / sup> ، الفينول الأحمر | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | للهضم / الحفظ |
| محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ، بدون Ca2 + < / sup> ، بدون Mg < sup> 2 + < / sup> ، لا يوجد فينول أحمر | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | لمحلول HEPES العازل للتروية |
| ، 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F-Histoacryl | |
| لاصق الأنسجة (بوتيل -2-سيانواكريلات) | B. Braun | 1050052 | لتثبيت موقع القنية |
| Hoechst 33258 محلول صبغة التلوين | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | الكولاجينات المجففة بالتجميد I / II |
| كلوريد الصوديوم 0.9٪ 500 مل Ecotainer | B. Braun | 123-Paralube | |
| Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38-Phosphate | |
| Buffered Saline (PBS) | Gibco | A1286301-Sudan | |
| IV & ndash; تلطيخ الدهون | سيجما ألدريتش | ||
| V001423-تيمجيسيك (بوبرينورفين هيدروكلوريد) ، محلول للحقن 0.3 مجم / مل | إنديفيور أوروبا المحدودة. | 345928 | المخدرات. تخزينها بأمان. |
| تريبان الأزرق ، 0.4٪ ، | Sigma-Aldrich | T8154 | لعد الخلايا |
| ويليامز متوسط E | سيجما-ألدريتش | W4128-500ML- | |
| <قوي>مواد< / قوي> | |||
| 25 مل ماصة مصلية ، Greiner Cellstar | Merck | P7865-50 | |
| مل أنابيب Falcon | TPP | - | |
| BD Neoflon ، قسطرة Pro IV 26 G | BD Falcon | 391349-Cell | |
| مكشطة ، عرض الشفرة الدوارة 25 مم | TPP | 99004-مصفاة | |
| خلية الصقر 100 & m نايلون | BD Falcon | 352360-Fenestrated | |
| الستارة الجراحية المعقمة | - | مادة | قماش قابلة لإعادة الاستخدام |
| فوهة تعبئة للحجم 16 # الأنابيب (معرف 3.1 مم) | Drifton | FILLINGNOZZLE # 16 | للذهاب إلى أنابيب |
| التدفق الخلوي ، 5 مل | BD Falcon | 352008-Male | |
| Luer to Barb ، معرف الأنبوب 3.2 مم | أنبوب توصيل Drifton | LM41 | لحقنة |
| أطباق بتري ، 96 × 21 مم | TPP | 93100-Prolene | |
| 5-0 | Ethicon | 8614H | لسحب القص |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | لخياطة الجلد |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | ربط المرارة |
| أنبوب 16 # ، WT 1.6 مم ، ID 3.2 مم ، OD 6.4 مم | Drifton | SC0374T | أنبوب التروية |
| <قوي> المعدات< / القوي > | |||
| BD LSRFortessa محلل الخلية مقياس التدفق | الخلوي BD | - | |
| ماكينة حلاقة القوارض إيزيس | Aesculap | GT421-محطة | |
| Isofluran | Provet | - | |
| جهاز طرد مركزي منخفض السرعة & ndash ؛ Scanspeed 416 | Labogene | - | |
| العد المحسنة Neubauer | Marienfeld | - | |
| مكثف الأكسجين &ndash ؛ EverFlo | Philips | 1020007 | 0 &ndash ؛ 5 لتر / دقيقة |
| Pipetboy &ndash ؛ مضخة التروية Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700-Shenchen | |
| &ndash ؛ YZ1515x | Shenchen | YZ1515x-المجهر | |
| الجراحي – SZX9 | أوليمبوس | - | |
| حصيرة الاحترار ThermoLux | Thermo Lux | - | |
| Vortex Genie 2 ، 2700 UpM | NeoLab | 7-0092-حمام | |
| مائي & ndash ؛ الدقة GP 02 | الحرارية العلمية | - | ضبط إلى 42 درجة ؛ ج |
المراجع
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
