Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (תלת-ממדית).
Abstract
אוסטיאוציטים נחשבים לתאים לא מתרבים המתמיינים באופן סופני מאוסטאובלסטים. אוסטאובלסטים המשובצים במטריצה החוץ תאית של העצם (אוסטיאואיד) מבטאים את הגן Pdpn ליצירת דנדריטים תאיים והופכים לפראוסטיאוציטים. מאוחר יותר, פראוסטיאוציטים מבטאים את הגן Dmp1 כדי לקדם מינרליזציה של מטריצה ובכך להפוך לאוסטיאוציטים בוגרים. תהליך זה נקרא אוסטיאוציטוגנזה. IDG-SW3 הוא קו תאים ידוע למחקרי מבחנה של אוסטיאוציטוגנזה. שיטות קודמות רבות השתמשו בקולגן I כמרכיב העיקרי או היחיד של מטריצת התרבית. עם זאת, בנוסף לקולגן I, האוסטאואיד מכיל גם חומר טחון, שהוא מרכיב חשוב בקידום גדילה, היצמדות ונדידה של תאים. בנוסף, חומר המטריצה שקוף, מה שמגביר את השקיפות של הג'ל שנוצר על ידי קולגן, ובכך מסייע לחקר היווצרות הדנדריטים באמצעות טכניקות הדמיה. לפיכך, מאמר זה מפרט פרוטוקול ליצירת ג'ל תלת-ממדי באמצעות מטריצה חוץ-תאית יחד עם קולגן I להישרדות IDG-SW3. בעבודה זו, היווצרות דנדריטים וביטוי גנים נותחו במהלך אוסטאוציטוגנזה. לאחר 7 ימים של תרבית אוסטאוגנית, נצפתה בבירור רשת דנדריטים נרחבת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. PCR בזמן אמת הראה כי רמות mRNA של Pdpn ו - Dmp1 עלו ללא הרף במשך 3 שבועות. בשבוע 4, המיקרוסקופ הסטריאוסקופ גילה ג'ל אטום מלא בחלקיקים מינרליים, התואם את בדיקת קרני רנטגן פלואורסצנטיות (XRF). תוצאות אלה מצביעות על כך שמטריצת תרבית זו מקלה בהצלחה על המעבר מאוסטאובלסטים לאוסטיאוציטים בוגרים.
Introduction
אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים שמקורם באוסטאובלסטים 1,2. ברגע שהאוסטאובלסט נקבר על ידי האוסטאואיד, הוא עובר אוסטיאוציטוגנזה ומבטא את הגן Pdpn ליצירת פרה-אוסטיאוציטים, את הגן Dmp1כדי להפוך את האוסטיאואיד למינרליזציה, ואת הגנים Sost ו-Fgf23 לתפקד כאוסטיאוציטים בוגרים ברקמת עצם3. כאן, מערכת תרבית תלת ממדית מוצגת כדי לזהות הרחבת דנדריט וביטוי גנים סמן בתהליך אוסטיאוציטוגנזה.
תאי IDG-SW3 הם קו תאים ראשוני אימורטלי שמקורו בעכברים טרנסגניים ויכולים להרחיב או לשכפל אוסטאובלסטים להתמיינות אוסטיאוציטים מאוחרת כאשר הם מתורבתים במדיות שונות4. בהשוואה ל- MLO-A5, MLO-Y4 וקווי תאים אחרים, פרופיל הביטוי של חלבונים פונקציונליים, היכולת לבצע שקיעת מלחי סידן והתגובות להורמונים שונים בתאי IDG-SW3 נוטים יותר להיות זהים לאלה של אוסטיאוציטים ראשוניים ברקמת העצם4.
בהשוואה למערכות דו-ממדיות, מערכות תרבית תלת-ממדיות מסוגלות יותר לחקות את סביבת הגידול התאית in vivo, כולל שיפוע חומרי המזון, קשיחות מכנית נמוכה והטווח המכני שמסביב (טבלה 1). רוב השיטות הקודמות לגידול תאים אוסטאובלסטיים במערכת תלת-ממדית השתמשו בקולגן I כמרכיב ייחודי בפורמולציות 4,5,6, מכיוון שסיבי קולגן I משמשים כאתר של שקיעת סידן וזרחן. עם זאת, מרכיב חיוני באוסטאואיד, המטריצה החוץ תאית, מכיל קבוצה גדולה של גורמים תאיים המקדמים גדילה, הידבקות ונדידה תאית 7,8 והוא שקוף ונוח לתצפית הדמיה. לפיכך, פרוטוקול זה משתמש במטריג'ל (להלן מטריצת קרום מרתף) כמרכיב משני למחקר אוסטאוציטוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מתאים לגידול תאים בארבע בארות של לוחות 24 בארות. אם מכינים מספר דגימות או צלחות, יש להגדיל את כמויות הריאגנטים בהתאם.
1. הכנת תערובת קולגן I
הערה: קולגן I וג'ל מטריצת קרום מרתף במהירות בטמפרטורת החדר. לכן, קולגן צריך להיות מטופל על קרח (2 ° C עד 8 ° C). כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים אלא אם כן צוין אחרת. כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה מנוע.
- מניחים את כל הריאגנטים וצינורות הצנטריפוגות על קרח.
- פיפטה איטית 0.48 מ"ל של קולגן I (5 מ"ג/מ"ל) ו-0.1 מ"ל של 10x מדיום חיוני מינימלי (MEM) (עם פנול אדום) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל השמור על קרח. מערבבים היטב על ידי פיטינג בעדינות למעלה ולמטה.
- על פי לוח הצבעים של מחוון פנול אדום, השתמש בנפח מתאים של 7.5% (w/v) NaHCO3 (כ -0.2 מ"ל) כדי להתאים את מחוון אדום פנול לכתום, המציין כי ערך ה- pH הוא בטווח של 7.0-7.4.
הערה: בהתאם ל- pH של המדיום, נפח של NaHCO3 משמש כדי להביא את ה- pH ל- 7.0-7.4 בקירוב. בנוסף, NaOH משמש לנטרול pH. - הביאו את הנפח הסופי של התערובת עד 1 מ"ל על ידי הוספת נפח מתאים של ddH2O. ערבבו היטב על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה כדי להתכונן לשימוש.
הערה: הנפח הסופי של ddH2O יהיה תלוי בכמות NaHCO 3 או NaOH בשימוש בשלב1.3 .
2. הכנת תערובת מטריצת התא
- לאט פיפטה 0.9 מ"ל של מטריצת קרום מרתף לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מ"ל על הקרח.
- תרבית את תאי IDG-SW3 בבקבוק T25 עם 4 מ"ל של תווך מלא (אלפא-MEM המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS]) בתוספת 50 U/mL INF-γ ב 33 ° C.
- ברגע שתאי IDG-SW3 מגיעים למפגש של 90%, הסירו את התווך ושטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול) עם פיפטה. לעכל את התאים עם 0.5 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 37 ° C במשך 30 שניות.
- נטרל את הטריפסין על-ידי הוספת 3.5 מ"ל של מדיום מלא (אלפא-MEM המכיל 10% נסיוב בקר עוברי [FBS]). העבר את מתלה התא 4 מ"ל לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- סובב את מתלה התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של התווך המלא על קרח.
- ספור את התאים באמצעות המוציטומטר והתאם את צפיפות התאים הסופית עם המדיום המלא ל 4 × 105 תאים / מ"ל. הוסף 0.1 מ"ל של השעיית התא מוכן ל 0.9 מ"ל של המטריצה החוץ תאית משלב 2.1. מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה.
הערה: אם יש צורך בבקרה נטולת תאים, הוסף 0.1 מ"ל של התווך המלא עד 0.9 מ"ל של מטריצה חוץ-תאית כבקרה שלילית.
3. ציפוי תערובת התא-ג'ל
- בעדינות, מערבבים היטב את שתי התערובות משלב 2.6 ושלב 1.4 עד 2 מ"ל על ידי פיטום למעלה ולמטה על הקרח. פיפטה 0.5 מ"ל של התערובת הסופית לתוך כל באר (ארבע בארות של צלחת 24 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ליצירת תערובת ג'ל תאים.
- הוסף 0.5 מ"ל של תווך אוסטאוגני (מדיום שלם המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ו-4 מ"מ β-גליצרופוספט, הידוע גם בשם מדיום אינדוקציה אוסטאוגני)4 לתערובת התא-ג'ל בכל באר כדי להתחיל את ההתמיינות האוסטאוגנית ב-37°C. חשבו על זה כיום 0.
- כל יומיים, להחליף חצי בינוני עם תווך אוסטאוגני טרי נשמר ב 37 ° C. המשך את הטיפוח במשך 35 יום.
4. זיהוי כדאיות התא והדנדריטים התאיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
- צביעת תאים
הערה: Calcein אצטוקסימתיל אסטר (calcein AM) הוא צבע מתאים שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את כדאיות התא. Ethidium homodimer-I (EthD-1) אינו חוצה את הממברנה של תאים שלמים/בני קיימא9. לפיכך, calcein AM/EthD-1 יכול לשמש לזיהוי כדאיות התא ודנדריטים תאיים.- ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, הוציאו מהמקפיא את תמיסת מלאי הקלצין AM (4 מילימטר ב-DMSO) ואת תמיסת המלאי EthD-1 (2 מילימטר ב-DMSO/H2O 1:4 [v/v]) ואפשרו להם להתחמם לטמפרטורת החדר.
הערה: למטריצה המינרלית יש אות אוטופלואורסצנטי חזק, כך ששלב הפראוסטיאוציטים ללא ביטוי Dmp1 תוך 7 ימים מגידול4 מתאים יותר לתצפית על צביעת תאים. - הוסף 4 μL של תמיסת מלאי 2 mM EthD-1 ו- 5 μL של תמיסת מלאי 4 mM calcein AM ל- 2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (D-PBS) של Dulbecco, וערבב היטב. זה נותן בערך 2 מיקרומטר calcein AM ו 4 μM EthD-1 כפתרונות עבודה.
- פיפטה 0.5 מ"ל של פתרון העבודה לתוך הבארות בצלחת 24 בארות. יש לדגור במשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את מטריצת הג'ל של התא.
- לאחר הדגירה, יש להוסיף כ-0.5 מ"ל של D-PBS טרי לצלחת תרבית חדשה בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית. מכסים את הכלי כדי למנוע זיהום או התייבשות של הדגימות.
- בעזרת מלקחיים עם מרפקים, העבירו בזהירות את מטריצת הג'ל התאית המוכתמת משלב 4.1.3 לצלחת התרבית בקוטר 35 מ"מ משלב 4.1.4. הימנע מפגיעה או גזירה של מטריצת הג'ל התאית.
- הצג את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי לייזר.
- ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, הוציאו מהמקפיא את תמיסת מלאי הקלצין AM (4 מילימטר ב-DMSO) ואת תמיסת המלאי EthD-1 (2 מילימטר ב-DMSO/H2O 1:4 [v/v]) ואפשרו להם להתחמם לטמפרטורת החדר.
- סט סריקה במיקרוסקופ
- מניחים את צלחת 35 מ"מ על הבמה. בחר את האזורים של מטריצת ג'ל התא לסריקה דרך העינית באמצעות מטרה של 10x. מטרות הגדלה גבוהות יותר אינן מומלצות בשל גודל הדנדריטים המורחבים.
- בחר את המסננים האופטיים. ניתן לראות את הקלצין כירוק עם מסנן פסים פלואורסצאין סטנדרטי, וניתן לראות את EthD-1 כאדום עם מסננים עבור יודיד פרופידיום או צבע אדום טקסס. בחר את "מצב קו" לסריקה ולהגדיר את "חור סיכה" ל 2 מיקרומטר.
- בחר עומק נתונים של 8 סיביות ורזולוציית תמונה של 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים.
- תמונה באמצעות סריקת קו רציף עם הגדרות לייזר וגלאי אופטימליות (שמור על אנרגיית לייזר מינימלית כדי למנוע הלבנה פוטנציאלית).
הערה: הגדרת הגלאי האופטימלית תלויה באותות הפלואורסצנטיים הסופיים.
- איסוף "ערימת z" של תמונות
- על פי אות הערוץ הירוק, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים של מטריצת ג'ל התא לסריקה על ידי מיקוד דרך הדגימה תוך כדי סריקה רציפה, .
- לאחר ציון החלק העליון והתחתון של הדגימה, בחר במסגרת הסריקה הרצויה. התחל לסרוק. המדגם ייסרק מלמעלה למטה עם ההגדרות שנבחרו משלב 4.2, יצירת גלריה של תמונות.
- זיהוי כדאיות התא.
- בחרו פרוסה אחת משלב 4.3. התעלות הירוקות והאדומות מציינות תאים חיים ומתים, בהתאמה.
- זיהוי דנדריט תאים.
- בחר את הערוץ הירוק היחיד כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים באמצעות תוכנת רכישת התמונות. נתוני העומק מוצגים כסדרה של תמונות פסאודו-צבעוניות בצבעי הקשת. הדנדריטים הממוקמים בתחתית הג'ל מוצגים באדום, ואילו אלה בחלק העליון מוצגים בכחול.
5. זיהוי המראה באמצעות סטריאומיקרוסקופ
- ביום 1, יום 7, יום 21 ויום 35 של התרבית, הסירו את מדיום הגידול, ושטפו את הג'לים בצלחת פעמיים עם D-PBS. הוסף 0.5 מ"ל של 4% (v/v) paraformaldehyde ב- D-PBS לבאר כדי לקבע את מטריצת התא ג'ל בצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את הפרפורמלדהיד בבאר ושוטפים את מטריצת ג'ל התא פעמיים נוספות עם D-PBS בצלחת. השאר 0.5 מ"ל של D-PBS בכל באר להדמיה.
- הניחו את הצלחת על הבמה ובחרו את המיקום האופטימלי דרך העינית באמצעות מטרה של 0.5x. דמיינו את תצוגת השדה המלא של מטריצת ג'ל התא בלוח בנפרד באמצעות "חשיפה אוטומטית" מתחת לשדה הבהיר.
6. זיהוי שקיעת מינרלים באמצעות בדיקת XRF
- ביום ה-35 של התרבית, בדקו אם החנקן הנוזלי מספיק. הפעל את מערכת XRF. פתח את חדר הדגימה והעבר את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לאמצע שלב הדגימה של המכשיר. סגור את חדר הדגימה והמתן 30 דקות כדי לאפשר למכשיר להתקרר לפני השימוש.
- הגדר את "זמן החשיפה" ל- 35 אלפיות השנייה, את "טווח הספקטרום" ל- 0-40 keV, ואת "הזרם החשמלי" ל- 770 μA להגדרת רכישה.
- בחר שלושה עד חמישה אתרי סריקה לניתוח על-ידי הזזת שלב הדגימה.
- בחר את הרכיבים (Ca ו - P) לזיהוי. התחל את הזיהוי וייצא את התוצאות.
הערה: Ca ו-P הם היסודות הנפוצים ביותר בהידרוקסיאפטיט.
7. זיהוי ביטוי גנים פונקציונלי
- ביום 1, יום 7, יום 21, יום 28 ויום 35 של התרבית, הסירו את מדיום הגידול ושטפו את מטריצת הג'ל התאית פעמיים עם D-PBS קר כקרח בצלחת.
- מעבירים את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לצינור של 2.0 מ"ל (בהתאם לזמן התרבית, מטריצת הג'ל התאית תתכווץ בהדרגה לכ-0.1 מ"ל ביום ה-35). ודא שג'ל אחד מונח בצינור אחד. הוסף 1 מ"ל של פנול-כלורופורם ושני חרוזי מכות סטריליים מפלדת אל-חלד (4 מ"מ, כמטריצה שוכבת) לכל צינור. הניחו את הצינורות באופן סימטרי בחריץ הדגימה המצונן מראש של ההומוגנייזר המכאני.
- הגדר את הפעימות לתדר של 55 הרץ ומשרעת של 1 ס"מ בכל דקה של פעימה מכנית עם הפסקה של 10 שניות, עם שישה מחזורים בסך הכל. התחילו את מכות החרוזים.
- חלץ את הרנ"א הכולל ממטריצת ג'ל התא בשיטת פנול-כלורופורם-איזואמילאכהול. תעתיק לאחור של 2 מיקרוגרם מסך הרנ"א ל-cDNA עם פריימרים אקראיים של הקסמר.
- תכננו פריימרים המיועדים ל-β-actin, Pdpn, Dmp1, Sost ו-Fgf23 ל-PCR בזמן אמת (טבלה 2). β-Actin הוא גן משק הבית המשמש לנורמליזציה. הגנים Pdpn10 ו-Dmp1 11 מתבטאים בעיקר בקדם-אוסטיאוציטים ובאוסטיאוציטים מינרליים, בעוד ש-Sost12 ו-Fgf2313 מתבטאים בעיקר באוסטיאוציטים בוגרים.
- הניחו את הצינור על thermocycler כאשר המכסה המחומם מכוון ל-105°C ובצעו הגברה של PCR באמצעות הגדרות מחזור ה-PCR הבאות: 95°C עבור 5 שניות ו-60°C למשך 30 שניות למשך 35 מחזורים עם שלב דנטורציה ראשוני ב-95°C למשך 5 דקות ושלב הארכה אחרון ב-60°C למשך 30 שניות. נתח את שינויי הקיפול בשיטת ΔΔCt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר צביעת תאים חיים/מתים, התאים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. כל התאים היו קלצין AM-חיובי (צבע ירוק), וכמעט ולא היו תאים חיוביים ל-EthD-1 (צבע אדום) בשדה, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל המיוצרת בשיטה זו מתאימה מאוד לאוסטאוציטוגנזה (איור 1A, משמאל). כדי לקבוע טוב יותר את ההתפלגות המרחבית של התאים, נבחרה תמונה פסאודו-צבעונית שתציג את הדנדריטים של התא בעומקים שונים של הג'ל; אדום מראה את הדנדריטים בתחתית הג'ל, וכחול מראה את הדנדריטים בחלק העליון. התוצאות הצביעו על כך שתאי IDG-SW3 גדלו היטב במטריצת הג'ל התאית הזו, והדנדריטים התאיים התרחבו בהדרגה לרשת בתווך האוסטאוגני ביום 7 (איור 1A, מימין ואיור 1B).
תחת סטריאומיקרוסקופ, השקיפות של מטריצת הג'ל המשיכה לרדת עד שהיא נעשתה אטומה ביום ה-35, בניגוד למטריצת הג'ל נטולת התאים (איור 2A). ספקטרום XRF של הג'ל האטום ביום 35 הצביע על כך שהג'ל היה מלא לחלוטין במרבצי סידן וזרחן (איור 2B).
ביום 1, יום 7, יום 21, יום 28 ויום 35 של התרבית, הביטוי של מספר גנים סמן נותח על ידי PCR בזמן אמת. התוצאות הראו שרמות ה-mRNA של Pdpn ו-Dmp1 עלו ללא הרף מהיום הראשון עד היום ה-21, בעוד שרמות ה-mRNA של Pdpn ירדו לאחר יום 21 (איור 3). רמות ה-mRNA של Fgf23 ו-Sost עלו ללא הרף במהלך כל השלבים (איור 3).
איור 1: רשת הדנדריטים התאית של IDG-SW3 בהדגמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי . (A) תמונות מייצגות של אזור חלקי ברשת הדנדריטים הנרחבת בג'ל. הצבע הירוק מציין את התאים החיים ואת רשת הדנדריטים התאית המורחבת. (B) פסאודו-צבע של התמונה ב-A (מימין, יום 7). הצבע האדום (כחול) מציין את הדנדריטים הממוקמים בחלק התחתון (העליון) של הג'ל. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שקיעת מינרלים של תאי IDG-SW3 לאחר תרבית אוסטאוגנית . (A) תמונות שדה מלא מייצגות של הג'ל עם תאים (עליונים) וללא תאים (תחתונים) בצלחת של 24 בארות בזמנים שצוינו, כפי שהודגם על-ידי מיקרוסקופ סטריאוסקופי. (B) תכולת הסידן והזרחן במטריצת הג'ל התאית ביום ה-35, כפי שנותחה על-ידי בדיקת XRF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי הגן התפקודי של תאי IDG-SW3 לאחר תרבית אוסטאוגנית. שינויים בגנים הפונקציונליים בתאי IDG-SW3 בתרבית עם תווך אוסטאוגני בזמנים שצוינו. קיצורים: D = יום; W = שבוע. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. שינויים בקיפול נותחו בשיטת Ct, המתייחסת לגן β-אקטין (-actin ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| דו-ממד | .3D | |
| קושי בהכנה | קל | בינוני |
| שיפוע של חומר מזין | נעדר | נוכח |
| סידור קולגן | מונולייר | בדידה רב-צירית |
| קשיחות מכנית של ECM | גבוה | נמוך |
| טווח מכני של ECM | חד צדדי | להקיף |
| תנועתיות התא | משטח שטוח | חינם |
| תקשורת בין-תאית | מספיק | מספיק |
טבלה 1: השוואה בין מערכות תרבית דו-ממדיות ותלת-ממדיות עבור תאי IDG-SW3.
| שמות | רצפים (5'- 3') |
| Pdpn-עבור | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTCTCTG |
| Dmp1-עבור | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| Dmp1-rev | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| Sost-for | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| Fgf23-עבור | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| Fgf23-rev | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-אקטין | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-אקטין-rev | CTGGATGGCTACGTACATGG |
טבלה 2: פריימרים המשמשים בבדיקת PCR בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא שיש לבצע את שלבים 1 ו-2 על קרח כדי למנוע קרישה ספונטנית. בשיטה זו, הריכוז הסופי של קולגן I היה 1.2 מ"ג/מ"ל. לפיכך, יש לחשב נפח אופטימלי של ddH2O כך שיתאים לקולגן השונים של יצרנים שונים.
In vivo, אוסטאוציטוגנזה כוללת תנועה קוטבית של אוסטאובלסטים מפני השטח אל פנים העצם הטרבקולרית14. פרוטוקול זה משחרר תאים מצמיחה במטריצה ללא קוטביות כיוונית. כמובן, זריעת תאי IDG-SW3 על משטח מטריצת הג'ל ללא תאים היא אופציונלית. עם זאת, ריכוז הקולגן המסופק בפרוטוקול זה אינו מספיק כדי ליצור משטח שטוח תיאורטית לחדירת אוסטאובלסט. לשם כך יש לבדוק יחסים שונים של קולגן I ומטריצה חוץ-תאית.
בהשוואה לזו של האוסטאואיד, הנוקשות של ג'ל זה רחוקה מלהספיק. מאמרים מסוימים מדווחים על הגברת חוזק הג'לים על ידי הוספת מספר חומרים כימיים כדי לחקות טוב יותר את הנוקשות של האוסטואיד in vivo 6,15. היתרון של שיטה זו הוא שהג'ל שנוצר יכול לספק מדיום עם שקיפות טובה להדמיה ומעקב אחר תאים באתרם ולא באמצעות שיטות היסטולוגיות15. עם זאת, קשה לספק את שקיפות החומר לצורך הדמיה תוך הבטחה שהתכונות הפיזיקליות והכימיות במבחנה יכולות לחקות את האוסטאואיד. לכן, יש לחקור מודלים תרבותיים נוספים כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות.
בנוסף, התכונות הפיזיקוכימיות של ג'ל מינרלי IDG-SW3 זה, כולל התכונות הריאולוגיות, הוצגו במחקר קודם16. לפיכך, ג'ל מינרלי ביוגני זה שנוצר בשיטה זו יכול להיות שימושי כחומר ביו-רפואי למחקר אורתופדי עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר לינדה פ. בונוולד על הענקת קו התאים IDG-SW3 במתנה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070902, 82100935 ו-81700778) ופרויקט השייט "חדשנות מדעית וטכנולוגית" בשנגחאי (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F.
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
