Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l'attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.
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Articolo metodologico
Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epitelio intestinale si rigenera ogni 5-7 giorni ed è controllato dalla popolazione di cellule staminali epiteliali intestinali (IESC) situata nella parte inferiore della regione della cripta. Gli IESC includono cellule staminali attive, che si auto-rinnovano e si differenziano in vari tipi di cellule epiteliali, e cellule staminali quiescenti, che fungono da cellule staminali di riserva in caso di lesioni. La rigenerazione dell'epitelio intestinale è controllata dalle capacità auto-rinnovanti e differenzianti di questi IESC attivi. Inoltre, l'equilibrio della popolazione di cellule staminali della cripta e il mantenimento della nicchia delle cellule staminali sono essenziali per la rigenerazione intestinale. La coltura di organoidi è un approccio importante e attraente per studiare proteine, molecole di segnalazione e segnali ambientali che regolano la sopravvivenza e le funzioni delle cellule staminali. Questo modello è meno costoso, meno dispendioso in termini di tempo e più manipolabile rispetto ai modelli animali. Gli organoidi imitano anche il microambiente tissutale, fornendo rilevanza in vivo . Il presente protocollo descrive l'isolamento delle cripte del colon, incorporando queste cellule isolate in un sistema tridimensionale di matrice di gel e coltivando cellule criptate per formare organoidi del colon capaci di auto-organizzazione, proliferazione, auto-rinnovamento e differenziazione. Questo modello consente di manipolare l'ambiente - eliminando proteine specifiche come la claudina-7, attivando / disattivando le vie di segnalazione, ecc. - per studiare come questi effetti influenzano il funzionamento delle cellule staminali del colon. In particolare, è stato esaminato il ruolo della proteina a giunzione stretta claudina-7 nella funzione delle cellule staminali del colon. Claudin-7 è vitale per mantenere l'omeostasi intestinale e la funzione e l'integrità della barriera. Il knockout di claudina-7 nei topi induce un fenotipo infiammatorio simile alla malattia intestinale che mostra infiammazione intestinale, iperplasia epiteliale, perdita di peso, ulcerazioni della mucosa, desquamazione delle cellule epiteliali e adenomi. In precedenza, è stato riportato che la claudina-7 è necessaria per le funzioni delle cellule staminali epiteliali intestinali nell'intestino tenue. In questo protocollo, viene stabilito un sistema di coltura organoide del colon per studiare il ruolo della claudina-7 nell'intestino crasso.
Introduzione
La coltura organoide intestinale è un sistema tridimensionale (3D) ex vivo in cui le cellule staminali sono isolate dalle cripte intestinali del tessuto primario e placcate in una matrice di gel 1,2. Queste cellule staminali sono capaci di auto-rinnovamento, auto-organizzazione e funzionalità degli organi2. Gli organoidi imitano il microambiente tissutale e sono più simili ai modelli in vivo rispetto ai modelli di coltura cellulare in vitro bidimensionale (2D), sebbene meno manipolabili delle cellule 3,4.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti e le procedure sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della East Carolina University (ECU) e condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e dell'ECU sulla cura e l'uso degli animali da laboratorio. Topi knockout claudin-7 inducibili, intestinali-specifici sono stati generati incrociando topi transgenici claudin-7-flox C57BL6 con topi Villin-CreERT219. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine di età pari o superiore a 3 mesi.
1. Preparazione del reagente/attrezzatura
- Ra....
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Risultati
Al fine di esaminare gli effetti regolatori della claudina-7 sulle cellule staminali del colon, le cripte del colon sono state isolate dal tessuto del colon murino come descritto sopra e mostrato nella Figura 1A. Una volta isolate le cripte dal tessuto primario, sono state placcate in una matrice 3D in una piastra da 96 pozzetti per crescere per 11 giorni (Figura 1). Le normali cripte sane chiuderanno il lume e diventeranno sferoidi entro il giorno 2 e alla fine.......
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Discussione
La coltura di organoidi è un modello eccellente per studiare la funzione delle cellule staminali, la fisiologia intestinale, la scoperta di farmaci, le malattie intestinali umane e la rigenerazione e riparazione dei tessuti 7,8,9,10,11,26. Sebbene abbia molti vantaggi, può essere difficile da stabilire. È necessario prestare .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato da NIH DK103166.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Essiccatore sottovuoto salvaspazio da 0,09 piedi cubi | Stati Uniti Plastic Corp | 78564 | camera per anestesia |
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | AM9261 | |
| provette per microcentrifuga da 1,5 mL | ThermoFisher | 69715 | |
| provette per centrifuga coniche da 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | 14190-144 | |
| 2-metilbutano | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldeide | ThermoFisher | J61899. | |
| 4-idrossitamoxifene (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL provette da centrifuga coniche | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 &; m filtro cellulare | in nylon Corning | 352350 | |
| piastra di coltura a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplemento (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Albumina sierica bovina | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anticorpo anticorpo di coniglio murino | Laboratori immunobiologici | 18875 | |
| Vetro di copertura (24 x 50-1,5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Tipo 2 | R& D Systems | 3533-005-02 | di gel |
| Cy3 anticorpo anti-coniglio | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Fiaschetta Dewar | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM Alto glucosio con L-glutammina | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II con DAPI | Electron Scienze della microscopia | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glicina | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Soluzione tampone | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| Kit di rilevamento della morte cellulare in situ, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurano | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Derivazione e coltura di organoidi gastrointestinali Core | N/A | |
| Kit chirurgico per topi | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Citrato di sodio | Fisher Scientific | S-279 | |
| Saccarosio | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Filtro sottovuoto (0,22 µ m; acetato di cellulosa) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris Bioscience | 1254 |
Riferimenti
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of e....
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Ristampe e permessi
